Swertiajaponiini estää ihon pigmentaatiota kahdella mekanismilla tyrosinaasin tukahduttamiseksi, osa 1

ABSTRAKTI

Monet ihoa valkaisevat yhdisteet kohdistuvat tyrosinaasiin, koska se katalysoi kahta nopeutta rajoittavaa vaihetta melaniinin synteesissä. Vaikka monia tyrosinaasin estäjiä on tällä hetkellä saatavilla ihon valkaisutarkoituksiin, on raportoitu myös ei-toivottuja haittavaikutuksia. Siten on tehty lukuisia yrityksiä kehittää turvallisempia tyrosinaasi-inhibiittoreita luonnontuotteista. Tämän mukaisesti testasimme viisikymmentä flavonoidia, ryhmän luonnossa esiintyviä antioksidantteja ja metallikelaattoreita, ja seuloimme swertiajaponiinin vahvimpana tyrosinaasin estäjänä soluttomissa kokeissa. Swertiajaponiini ei osoittanut sytotoksisuutta B16F10-, HaCat- ja Hs27-soluissa ja osoitti vahvaa antioksidanttiaktiivisuutta kokeissa, joissa käytettiin soluvapaata järjestelmää ja B16F10-soluja. Se esti merkittävästi MSH- tai UVB-indusoitua melaniinin kertymistä B16F10-soluihin ja tukahdutti ihon pigmentaatiota ihmisen ihomallissa. Taustalla olevina mekanismeina in silico ja Lineweaver-Burk -kaavioanalyysit osoittivat, että swertiajaponiini voi sitoutua suoraan tyrosinaasiaktiivisuuteen ja inhiboida sitä muodostamalla useita vetysidoksia ja hydrofobisia vuorovaikutuksia tyrosinaasin sitovan taskun kanssa. Lisäksi Western blot -tulokset osoittivat, että swertiajaponiini esti oksidatiivisen stressin välittämää MAPK/MITF-signalointia, mikä johti tyrosinaasiproteiinitason laskuun. Yhdessä swertiajaponiini estää melaniinin kertymistä estämällä sekä tyrosinaasin aktiivisuutta että proteiinien ilmentymistasoja. Siten se olisi uusi lisäaine kosmetiikan valkaisuun.

Avainsanat

swertiajaponiini; melanogeneesi; pigmentaatio; ihmisen iho; tyrosinaasi

JOHDANTO

Iho on tärkeä paikka, jossa melaniinipigmentit kerääntyvät. Melaniinin synteesi ja kertyminen toimivat suojamekanismina ultraviolettisäteilyä (UV) vastaan. Näin ollen mustaihoisilla ihmisillä on pienempi riski sairastua ihosyöpään kuin kalpeaihoisilla, koska he ovat suojassa UV:n mutageenisilta vaikutuksilta [1]. Hallitsematon melanogeneesi liittyy kuitenkin läheisesti pigmentaatiohäiriöihin, mukaan lukien melisma, pisamiat ja seniilit linssit [2]. Lisäksi epänormaalit muutokset ihon värissä johtavat epäsuotuisiin kosmeettisiin ongelmiin ja lopulta heikentävät elämänlaatua. Näin ollen epänormaalin melanogeneesin ehkäisy on herättänyt paljon huomiota ihoa valkaisevan kosmetiikan kehittämisessä [3–5].

Melanosyytti on tärkein solutyyppi, joka syntetisoi melaniinia ihon epidermiksessä. Synteesin jälkeen melanosyytit siirtävät melaniinia keratinosyytteihin dendriittien kautta, mikä johtaa ihon pigmentaatioon. Melaniinia voidaan syntetisoida L-tyrosiinista hydroksylaatio- ja hapetusprosesseilla, joissa monifunktionaalisella kuparia sisältävällä tyrosinaasilla on keskeinen rooli melaniinin synteesissä. Tyrosinaasi katalysoi kahta nopeutta rajoittavaa vaihetta melaniinin synteesissä; L-tyrosiinin mykofenolaattihydroksylaatio 3,4-dihydroksi-L-fenyylialaniiniksi (L-DOPA) ja L-DOPA:n hapetus DOPA-kiniiniksi [6, 7]. Näin ollen tyrosinaasin esto on hyvä strategia ihon kirkastamiseksi, mutta sytotoksisuus ja stabiilisuuden puute ovat rajoittaneet erilaisten tyrosinaasin estäjien käyttöä lääketieteellisten tuotteiden ja kosmetiikan alalla. Näin ollen on tehty lakkaamattomia ponnisteluja löytääkseen turvallisempia tyrosinaasin estäjiä, joilla on vahvempi stabiilisuus ja selektiivisyys luonnollisista lähteistä.

Löytääksemme yhdisteitä parempiin ja turvallisempiin ihon valkaisuvaikutuksiin testasimme 50 luonnollisesti saatavilla olevaa flavonoidia niiden tyrosinaasia estävän vaikutuksen osalta ja seuloimme swertiajaponiinin vahvimpana tyrosinaasin estäjänä. Tutkimme edelleen sen vaikutusta ihon pigmentaatioon solu- ja ihmisen ihomalleilla erilaisilla biologisilla määrityksillä ja in silico -analyysillä.

Cistanche on yleinen yrtti, joka tunnetaan nimellä "ihmeyrtti, joka pidentää elämää". Sen pääkomponentti on cistanosidi, jolla on erilaisia ​​​​vaikutuksia, kuten antioksidantteja, tulehdusta ehkäiseviä ja immuunitoimintoja edistäviä vaikutuksia. Cistanchen ja ihon valkaisun välinen mekanismi piilee cistanche-glykosidien antioksidanttisessa vaikutuksessa.

Napsauta Cistanchea parantaaksesi ihon valkaisua

Kysy lisää:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Ihmisen ihon melaniinia syntyy tyrosiinin katalysoiman tyrosiinin hapettumisen seurauksena, ja hapetusreaktio vaatii hapen osallistumista, joten kehon happivapaista radikaaleista tulee tärkeä melaniinin tuotantoon vaikuttava tekijä. Cistanche sisältää cistanosidia, joka on antioksidantti ja voi vähentää vapaiden radikaalien muodostumista kehossa, mikä estää melaniinin tuotantoa.

Lisäksi cistanchella on myös tehtävänä edistää kollageenin tuotantoa, mikä voi lisätä ihon kimmoisuutta ja kiiltoa sekä auttaa korjaamaan vaurioituneita ihosoluja.

Cistanche Fenyylietanoli Glykosideilla on merkittävä tyrosinaasin aktiivisuutta alentava vaikutus, ja vaikutuksen tyrosinaasiin on osoitettu olevan kilpailevaa ja palautuvaa estoa, mikä voi tarjota tieteellisen perustan Cistanchen valkaisevien ainesosien kehittämiselle ja hyödyntämiselle.

Siksi cistanchella on keskeinen rooli ihon valkaisussa. Se voi estää melaniinin tuotantoa vähentääkseen värjäytymistä ja tylsyyttä; ja edistää kollageenin tuotantoa parantaakseen ihon kimmoisuutta ja hehkua. Koska nämä cistanchen vaikutukset tunnetaan laajalti, monet ihoa valkaisutuotteet ovat alkaneet infusoida kasviperäisiä ainesosia, kuten Cistanchea, vastatakseen kuluttajien kysyntään, mikä lisää Cistanchen kaupallista arvoa ihonvalkaisutuotteissa.

Yhteenvetona voidaan todeta, että cistanchen rooli ihon valkaisussa on ratkaiseva. Sen antioksidanttinen vaikutus ja kollageenia tuottava vaikutus voivat vähentää värjäytymistä ja sameutta, parantaa ihon joustavuutta ja kiiltoa ja siten saavuttaa valkaisevan vaikutuksen. Myös Cistanchen laaja käyttö ihonvalkaisutuotteissa osoittaa, että sen roolia kaupallisessa arvossa ei voida aliarvioida.

TULOKSET JA KESKUSTELU

Swertiajaponiini on 50 flavonoidin vahvin tyrosinaasin estäjä

Useista luonnollisista yhdisteistä flavonoidien, ryhmän luonnossa esiintyviä antioksidantteja ja metallikelaattoreita, on tiedetty estävän tyrosinaasiaktiivisuutta, koska ne pystyvät muodostamaan kupari-flavonoidikomplekseja [8, 9]. Käytimme viittäkymmentä kaupallisesti saatavilla olevaa flavonoidia testataksemme, onko niillä sienen tyrosinaasia estävää vaikutusta. Kojihappoa, hyvin tunnettua tyrosinaasin estäjää, käytettiin positiivisena kontrollina parempien tyrosinaasin estäjien seulomiseksi (kuva 1A-1B). Tämän seurauksena näyte numero 40 (swertiajaponiini) (kuva 1C) osoitti voimakkainta estoaktiivisuutta tyrosinaasia vastaan ​​kuin muilla flavonoideilla (kuva 1A-1B ja täydentävä kuva 1). Kun inhiboivaa aktiivisuutta tutkittiin edelleen pitoisuudesta riippuvaisella kokeella, kojiinihapon IC50-arvo oli 41,26 µM ja swertiajaponiinin 43,47 µM (kuva 1D), mikä osoittaa, että swertiajaponiinin tyrosinaasiaktiivisuuden esto on verrattavissa kojiinihapon tyrosinaasiaktiivisuuden estoon. koeputkikokeissa.

Swertiajaponiinilla ei ole sytotoksisuutta in vitro

Swertiajaponiini kuuluu flavonoidi-C-glykosidien perheeseen. Se sisältää hiilihydraattiosan, joka on C-glykosidisesti kytketty yhteen flavonoidirungosta (kuva 1C). Sen on raportoitu olevan koko Swertia japonica -yrtissä oleva yhdiste [10]. Vaikka joissakin tutkimuksissa kerrottiin, että Swertia japonicaa käytetään kliinisesti ruoansulatuskanavan oireiden lääkkeenä Japanissa [11], swertiajaponiinin biologisista toiminnoista on saatavilla vain vähän tutkimuksia. Siten tutkimme edelleen sen vaikutuksia melanogeneesiin. Koska sytotoksisuus on synteettisten tyrosinaasin estäjien pääongelma, testasimme, osoittiko swertiajaponiini solutoksisuutta käyttämällä useita solulinjoja, mukaan lukien HaCat (ihmisen keratinosyytti), B16F10 (hiiren melanooma) ja Hs27 (ihmisen fibroblasti). Swertiajaponiini ei osoittanut sytotoksisuutta näissä solulinjoissa (kuvio 2A-2C).

Swertiajaponiini estää melanogeneesiä B16F10-soluissa

Tutkimme sen vaikutusta melanogeneesiin käyttämällä B16F10-soluja, jotka oli esikäsitelty kojiinihapolla tai swertiajaponiinilla, mitä seurasi UVB- tai MSH-altistus, voimakkaimmat melanogeeniset indusoijat. Kuten odotettiin, UVB- tai MSH-altistus lisäsi huomattavasti melaniinitasoja B16F10-soluissa (kuva 2D-2F), ja swertiajaponiinihoito vähensi solujen melaniinipitoisuutta annoksesta riippuvalla tavalla UVB- tai MSH-altistuksen jälkeen (kuva 2D{{10). }}F). Solututkimuksissa swertiajaponiinin melanogeeninen vaikutus näyttää olevan voimakkaampi kuin kojiinihapon (kuva 2E- 2F). Samoin swertiajaponiinilla ennen MSH-käsittelyä esikäsitellyn solupelletin väri kirkastui verrattuna MSH-käsiteltyihin soluihin (kuvio 2D), mikä osoittaa, että swertiajaponiini estää UVB:n tai MSH:n indusoimaa melanogeneesiä.

Swertiajaponiini estää melanogeneesiä ihmisen ihomallissa

Vahvistaaksemme, että swertiajaponiini tukahduttaa ihon pigmentaatiota ihmisillä, viljelimme elinkelpoista, kolmiulotteista ihmisen epidermistä, joka koostuu ihmisen melanosyyteistä ja keratinosyyteistä, joiden tiedetään käyvän läpi spontaanin melanogeneesin ajan myötä [12]. Esikäsittelimme ihmisihomallia swertiajaponiinilla 1 tunnin ajan ja viljelimme sitä ylläpitoalustassa 5 päivää. Verrattuna päivään 1 ihmisen ihomalli tummuutui päivänä 5 ja swertiajaponiinihoito esti sen pitoisuudesta riippuvaisella tavalla (kuva 3A-3B). Samoin Fontana-Masson-värjäys osoitti, että swertiajaponiini alensi merkittävästi melaniinitasoja orvaskedessä (kuva 2C), mikä viittaa siihen, että swertiajaponiini vähentää pigmentaatiotaihmisen ihon malli.

Swertiajaponiini voi sitoutua tyrosinaasiin ja inaktivoida sitä

Seuraavaksi tutkimme mekanismeja, jotka ovat swertiajaponiinivälitteisten melanogeenisten vaikutusten taustalla käyttämällä B16F10-soluja. Koska swertiajaponiini tukahdutti tyrosinaasin aktiivisuutta soluttomissa kokeissa, joissa käytettiin sienityrosinaasia (kuva 1B), oletimme, että se sitoutuu suoraan tyrosinaasiin ja deaktivoi sen. Tämän testaamiseksi suoritettiin proteiini-ligandin telakointisimulaatio sitoutumisaffiniteetin ennustamiseksi käyttämällä AutoDock Vinaa. Ennustettu sitoutumisaffiniteetti tyrosinaasin ja kojiinihapon välillä oli -5,4 kcal/mol ja tyrosinaasin ja swertiajaponiinin välinen affiniteetti oli -6,3 kcal/mol (kuvat 4A ja 4C), mikä viittaa siihen, että swertiajaponiini saattaa sitoutua tyrosinaasille vahvemmalla affiniteetilla kuin kojiinihapolla. Yhdisteiden ja tyrosinaasin välisen sitoutumistavan tutkimiseksi edelleen farmakoforianalyysi suoritettiin käyttäen LigandScout 3.1 -ohjelmistoa. Vaikka kojiinihappo voi sitoutua tyrosinaasiin pääasiassa vetysidosten kautta tyrosinaasin ASN260- tai GLU256-tähteen kanssa (kuva 4B), swertiajaponiini muodostaa useita vetysidoksia HIS85:n, ASN81:n, ASN260:n, HIS244:n ja phos248MET-residinaasien hydroso2444- ja ARG88-residinaasien kanssa. ja tyrosinaasin PHE264-tähde (kuvio 4D), mikä todennäköisesti selittää swertiajaponiinin korkeamman sitoutumisaffiniteetin tyrosinaasille.

Koska ennalta määritettyä tyrosiinin sitoutumiskohtaa käytettiin telakointitaskuna proteiini-ligandin telakointisimulaatiossa [3], on todennäköistä, että swertiajaponiini voi sitoutua kilpailevasti tyrosinaasiin tyrosiinin kanssa. Tämän tutkimiseksi suoritettiin Lineweaver-Burk-analyysi. Kun swertiajaponiinin pitoisuus nousi, myös Km-arvot nousivat, kun taas Vmax-arvot olivat yhdenmukaisia ​​(kuva 4E-4F), mikä osoittaa, että swertiajaponiini on kilpaileva tyrosinaasin estäjä.

Swertiajaponiini on antioksidantti, joka vaimentaa UVB-indusoitua MITF/tyrosinaasi-signalointia

Vaikka swertiajaponiinin IC50-arvo on samanlainen kuin kojiinihapon soluvapaassa kokeessa, todellinen melanogeneesin esto on suurempi swertiajaponiinilla käsitellyissä soluissa kuin kojiinihapolla käsitellyissä soluissa, mikä osoittaa, että suora sitoutuminen tyrosinaasiin ei ehkä ole ainoa mekanismi, joka on taustalla swertiajponiinin välittämän melanogeneesin eston. On hyvin dokumentoitu, että flavonoidien biologiset toiminnot liittyvät niiden antioksidanttisiin vaikutuksiin [13]. Siksi tutkimme, sääteleekö swertiajaponiini oksidatiivista stressiä soluttoman reaktiivisen hapen (ROS) ja peroksinitriitin (ONOO-) poistamismäärityksillä. Swertiajaponiini osoitti voimakkaita ROS- ja ONOO-poistoaktiivisuuksia, jotka olivat verrattavissa Troloxiin ja penisillamiiniin, jotka ovat hyvin tunnettuja ROS- ja ONOO-estäjiä, vastaavasti (kuva 5A-5B). Testasimme edelleen, osoitettiinko swertiajaponiinin antioksidanttivaikutus myös B16F10-soluissa UVB-altistuksen jälkeen. UVB-altistus lisäsi merkittävästi ROS- ja ONOO-tuotantoa, kun taas swertiajaponiini vähensi niitä pitoisuudesta riippuvaisella tavalla, mikä viittaa siihen, että swertiajaponiini on antioksidantti (kuva 5C-5D).

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501