Tulehdukseen liittyvien munuaisvaurioiden estäminen siirrosta uudella PrC-210 vapaaradikaalin poistajalla rotilla
Mar 18, 2022
Torsten R. Goesch 1, Nancy A. Wilson2, Weifeng Zeng2, Bret M. Verhoven2, Weixiong Zhong2Maya M. Coumbe Gitter3ja William E. Fahl1,3,*
Abstrakti:
Allograftmunuainentransplantaatio, joka laukaisee isännän solu- ja vasta-ainevälitteisen hylkimisenmunuainen, on merkittävä munuaisvaurion aiheuttaja elinsiirron aikana. Tässä kysyimme, ehkäisikö PRC{0}} allograft-munuaisensiirroissa havaittuja vaurioita. Brown Norway (BN) -rotan munuaiset perfusoitiin in situ (UW-liuos) lisätyn 30 mM PrC-210:n kanssa tai ilman ja siirrettiin sitten välittömästi Lewis (LEW)-rotille. 20 tuntia myöhemmin siirretyt BN-munuaiset ja LEWrat-plasma analysoitiin.Munuainenhistologia ja useiden tulehdukseen liittyvien sytokiinien munuais-/seerumitasot mitattiin epäsovitukseen liittyvän munuaispatologian ja PrC{2}}suojatehokkuuden arvioimiseksi. 20 tuntia allograft-siirteiden jälkeen: (i) allograftin munuaisissa havaittiin merkittävää histologista munuaistiehyiden vauriota ja mononukleaarista tulehdussolujen infiltraatiota; (ii)munuainentoimintamittarit (kreatiniini ja BUN) olivat merkittävästi kohonneet; (iii) merkittäviä muutoksia avainsytokiineissa, eli TIMP-1, TNF-alfa ja MIP-3A/CCL20, ja munuaisten aktivoimissa kaspaasitasoissa havaittiin. Kiinassa käsitellyissä munuaisissa ja vastaanottajarotissa (i) munuaisten histologiset vauriot (Banff Scores) ja mononukleaarinen infiltraatio vähenivät käsittelemättömille taustatasoille; (ii) kreatiniini ja BUN vähenivät merkittävästi; ja (iii) aktivoidut kaspaasin ja sytokiinien muutokset vähenivät merkittävästi, jotkin taustalla. Yhteenvetona voidaan todeta, että tulokset viittaavat siihen, että PrC-210 voisi tarjota laajasti sovellettavan elinsuojan monille allograft-siirtotileille; se voisi suojata siirrettyjä munuaisia siirtoprosessin kaikissa vaiheissa ja sen jälkeen – elinten luovutuksesta, kuljetuksesta, uudelleenistutuksesta ja leikkauksen jälkeisestä tulehduksesta – akuutin ja kroonisen hylkimisreaktion minimoimiseksi.
Koiwords: munuainenallograft; munuaisten hylkääminen; iskemia
Ottaa yhteyttä:joanna.jia@wecistanche.com
maca ginseng cistanche
1. Esittely
Loppuvaiheen munuaisten vajaatoiminta aiheuttaa yli 1,2 miljoonaa kuolemaa vuosittain maailmanlaajuisesti [1].Munuainenelinsiirto on suositeltu hoito potilaille, joilla on loppuvaiheen munuaissairaus. Maailmassa tehdään vuosittain yli 90000 munuaisensiirtoa.
Elinsiirtoprosessi itsessään aiheuttaa merkittäviä solu- ja elinvaurioitamunuainen, mikä vähentää elimen pitkäaikaista eloonjäämistä. Kolme ensisijaista munuaiseen kohdistuvaa loukkausta allograftisiirron aikana ovat (i) reaktiivisten happi- ja typpilajien (ROS ja RNS) aiheuttamat vauriot kylmäiskemian aikana ("kylmävarastointi") [2], (ii) ROS:n aiheuttama vaurio implantin yhteydessä. ("uudelleenperfuusiovaurio") [3] ja (iii) allograft-siirron jälkeinen tulehdus, joka laukaisee synnynnäisen immuunivasteen ja vasta-ainevälitteisen hylkimisreaktion (ABMR) [4].
Neutrofiilit ja makrofagit siirtyvät vaurioituneeseen siirtoon 6 tunnin sisällä reperfuusion jälkeen ja stimuloivat kemokiinin synteesiä asuvissa dendriittisoluissa, jotka sitten aktivoivat T-lymfosyyttejä ja värväävät mukautuvia immuunisoluja. Kun nämä immuunisolut tunkeutuvat proksimaalisiin tubulusten epiteelisoluihin, ne tuottavat myeloperoksidaasia neutrofiileissä ja nikotiiniamidiadeniinidinukleotidifosfaatti (NADPH) -oksidaasia makrofageissa, jotka molemmat edistävät paikallista vapaiden radikaalien tuotantoa. Nämä tulehdukselliset prosessit johtavat komplementtireitin aktivoitumiseen ja edelleen solujen uudelleenmuodostumiseen ja hajoamiseenmunuainenallograft [5]. ABMR voi ilmetä jommankumman tai molempien, ennalta muodostetun allovasta-aineen seurauksena siirrettä vastaan tai luovuttajaspesifisen vasta-aineen (dnDSA) de novo -kehityksen seurauksena [5–7]. Akuutti (min/vrk), krooniseksi siirtyvä (päivät/viikko), tulehdusreaktio allograftin munuaisessa, jatkuvan ROS:n ja tulehduksellisten sytokiinien tuotannon kanssa, voi saada aikaan vakavan, itsestään jatkuvan vasteen, joka aiheuttaamunuainenelinten vajaatoiminta.
Ymmärtää paremmin solu- ja molekyylireittejä, jotka osallistuvat patogeneesiinmunuainenallograftin tulehdus ja hylkiminen, kehitimme ja karakterisoimme rottamallin, joka toistaa suurimman osan luontaisen immuunivasteen, ABMR:n ja munuaiselinten menetyksen kliinisistä kriteereistä [8]. Tätä mallia on käytetty arvioitaessa useita uusia allograftin jälkeisiä siirtostrategioita.
Nämä kaksi tällä hetkellä tunnustettua lähestymistapaa akuutin ja pitkäaikaisen immuunivasteen vähentämiseksimunuainenallograftit ovat: (i) lisätä mahdollisuutta löytää ristiinsovitettu luovuttaja ja (ii) poistaa olemassa olevia vasta-aineitamunuainenallograft desensibilisaatioprotokollia käyttäen [9,10].
Tässä käsikirjoituksessa kuvatussa työssä kysyimme, olisiko kolmas lähestymistapa akuutin ja pitkäaikaisen tulehduksen vaikeusasteen hillitsemiseksi hyödyllinen. Annoimme välittömästi vaikuttavaa vapaiden radikaalien poistajaa, PRC-210, molemmat istutettuun allograftiinmunuainenja vastaanottajarotalle sen määrittämiseksi, voidaanko tulehdukseen liittyvää ROS-vauriota tukahduttaa. Vaikka ajatus tukahduttaa tulehdukseen liittyvä ROSinmunuainenelinsiirto ei ole uutta, vaan uuden, välittömästi toimivan PRC-210 ROSscavengerin käyttö täällä on. Sekä välitön että krooninen tulehdusta synnyttävien ja syntyneiden vapaiden radikaalien poistaminen ja inaktivointi juuri siirretyssä allograftissamunuainenwould significantly enhance the existing strategies to suppress allograft rejection and would provide another pathway to reduce post-transplant kidney cell damage, and with it, suppress Delayed Graft Function to improve survival of the kidney allograft.PRC-210 is a new small-molecule, aminothiol, free radical scavenger [11]; it has no measurable nausea/emesis nor hypotension side effects [12]. Unlike traditional antioxidants that act indirectly over hours to days via NrF-2 to activate the expression of protective genes [13], PRC-210 directly scavenges ROS to confer 100% protection in seconds [11]. PRC- 210 was the most potent of the 13 commonly studied "antioxidants" screened in an assay that scored the ability of molecules to prevent x-ray-induced damage to naked DNA; the majority of the tested "antioxidants" showed no protection [14,15]. In a related essay, the addition of PrC-210 30 s before a 60 s pulse of •OH to naked DNA provided complete protection against the •OH insult that induced >95-prosenttinen DNA-vaurio suojaamattomissa kontrolleissa [16]. Kahdessa aikaisemmassa jyrsijän munuaissiirtotutkimuksessa [16,17] PRC-210:n osoitettiin estävän ROS-indusoitua munuaisvauriota, joka aiheutti (i) 30 tunnin kylmäsäilytyksen [17] ja (ii) reperfuusiovaurion implantin yhteydessä [16]. ] taustatasoille, mikä poistaa kaksi merkittävää vaurion lähdettä siirretyistä munuaisista. PRC-210-molekyylin on myös osoitettu estävän vapaiden radikaalien aiheuttamia vaurioita useissa muissa elinympäristöissä [15,18]. Näin ollen oletimme, että PrC{13}}:n pitäisi kyetä myös suojaamaan allograftia oksidatiiviselta stressiltä, joka syntyy sekä (i) solu- että (ii) vasta-ainevälitteisistä hyljintäprosesseista, jotka tuottavat vapaita radikaaleja sivutuotteena.
Tämän hypoteesin tutkimiseksi kehitimme uuden rottamallin, jolla vältyttiin suurien iskeemisten ja reperfuusiotapahtumien induktiolta ja annettiin PrC{0}} sekä ennen implantaatiota että sen jälkeen. Ruskean rotan munuaiset huuhdeltiin UW-liuoksella, joka sisälsi PrC-210, ja siirrettiin välittömästi syngeenisiin Lewis-rotan vastaanottajiin. Kylmä iskeeminen aika oli käytännössä eliminoitu. Välittömästi seuraava implantti ja 8 tuntia sen jälkeenmunuainenimplantti, vastaanottajarotat saivat systeemisiä PrC{0}}-injektioita annoksina, jotka mahdollistavat jatkuvan vapaiden radikaalien poistamisen siirretyssämunuainen. Siirretyt munuaiset ja veriplasma otettiin sitten talteen 20 tuntia siirron jälkeen, jotta voidaan mitata sekä PrC-210--antamia (i) tulehduksellisten sivutuotteiden suppressiota että (ii)munuainensuojaa.
maca ginseng cistanche
2. Materiaalit ja metodit
2.1. Eläimet
Aikuiset (200–250 g) urospuoliset Lewis- ja BN-rotat ostettiin Envigosta (Indian-napolis, IN, USA) ja pidettiin Wisconsinin yliopiston eläintenhoitolaitoksessa Madisonissa, WI, USA:ssa. Kaikki toimenpiteet suoritettiin Wisconsinin yliopiston eläinten hoito- ja käyttökäytäntöjen mukaisesti. Eläinten hoitohenkilökunta suoritti päivittäin eläinten terveyden ylläpitoa, mukaan lukien eläinten kuolemat, huoneen lämpötila, 12 tunnin valo/pimeysjaksot ja häkin siivous, muiden sanitaatiotehtävien ohella. Ruokaa ja vettä oli saatavilla ad libitum. Wisconsinin yliopiston lääketieteellisen korkeakoulun ja kansanterveyslaitoksen eläintenhoito- ja käyttökomitea (Animal Protocol #M005204) hyväksyi tämän tutkimuksen. Kaikissa ryhmissä oli 4–6 eläintä.
2.2. Materiaalit
Prekliinisen molekyylin PrC-210 HCl-aminotiolin synteesi kuvattiin erikseen [19,20]. PrC-210 HCl-kiteitä (3-(metyyliamino)-2-(metyylimonometyyli)propaani-1- tioli) säilytetään typpiatmosfäärissä -20 ◦C:ssa ja jopa rutiininomaisesti sulatuksen, käytön ja uudelleen varastoinnin aikana kiteinen PrC-210 on täysin stabiili yli 4 vuotta massaspektrometrianalyysin perusteella. Muut kemialliset reagenssit hankittiin Sigma Aldrichilta (St. Louis, MO, USA). UW Organ Preservation Solution ostettiin Bridge to Lifelta, Columbia, SC, USA.
2.3. Kirurginen ja kokeellinen toimenpide
Näissä kokeissa käytetty siirtomenetelmä on esitetty kuvassa 1. BN-luovuttajarotalla vasen rotta aortan kaksoisligaatioon, oikean munuaisvaltimon ja -laskimon ligaation ja vasemman munuaislaskimon kirurgisen osan jälkeenmunuainenperfusoitiin in situ käyttäen 5 ml huoneenlämpöistä UW-liuosta (15 sekunnin aikana). Perfusaatti oli joko pelkkä UW-liuos (ryhmille "0 h" ja "20 h Ei käsittelyä") tai UW-liuos, jolle kiteinen PrC-210 saavutettiin 30 mM [17], oli lisätty, liuennut välittömästi ja sitten pH säädettiin lähtö UW-liuoksen pH-arvoon 7,4 lisäämällä 0,0619 µl 5N NaOH per µmol PrC-210 HCL-suolaa (FW: 220). PrC-210-tiolin (aktiivinen muoto) puoliintumisaika on noin 3,5 tuntia fysiologisissa pH-liuoksissa, kuten UW-liuoksessa ja ihmisveressä [14]. In situ -perfuusion jälkeen vasen BNmunuainenpoistettiin kirurgisesti ja ommeltiin sitten suonten ja virtsanjohtimen tylpällä anastomoosilla LEW-vastaanottajarotan vapautettuun vasempaan munuaiskohtaan. Oikea LEWmunuainensidottiin ja poistettiin välittömästi ennen. Viisi minuuttia LEW-rotan kirurgisen sulkemisen jälkeen rotta sai systeemisen PrC{{0}}-annoksen (121 ug PrC-210 HCl:a painogrammaa kohti, mikä vastaa 0.24 X Suurin siedetty annos) intraperitoneaalisella injektiolla. Kuten kuvion 1 kaaviossa esitetään, rotta sai myös vatsaontelonsisäisiä injektioannoksia PrC-210:a (0,24 MTD) plus 4 tuntia ja plus 8 tuntia siirron jälkeen. Rotat lopetettiin yli 20 tuntia siirron jälkeen, jamunuaisetja plasmanäytteet kerättiin analysointia varten. Jokaisessa hoitoryhmässä oli vähintään viisi rottaa.
2.4. Seerumin BUN- ja kreatiniinimittaukset
BUN ja kreatiniini mitattiin seeruminäytteistä käyttämällä Catalyst One AnalyzerTechnologya (IDEXX Laboratories, Westbrook, ME, USA).
2.5. Entsyymi-immunosorbenttimääritykset
Määritykset suoritettiin ELISA-sarjan protokollissa kuvatulla tavalla (rotan TIMP-1, Cat# RTM- 100; rotan MIP3-A, luettelonumero DY540; rotan TNF-alfa, Cat# RTA{ {5}}; R&D Systems, Minneapolis, MN, USA). Lyhyesti, rotan plasman laimennoksia lisättiin esipäällystetyille levyille, inkuboitiin 2 tuntia 37 °C:ssa. Sen jälkeen lisättiin määritetylle proteiinille spesifinen biotiinilla konjugoitu vasta-aine ja inkuboitiin 1 tunti 37 °C:ssa, pestiin, avidiinikonjugoituna. piparjuuriperoksidaasia lisättiin, mitä seurasi pesu ja TMB-substraatin lisääminen. Reaktiota inkuboitiin 10-30 minuuttia, pysäytettiin rikkihapolla ja luettiin 450 nm:ssä.
2.6. Proteome Profiler Rat Cytokine Array
Määritykset suoritettiin olennaisesti tuoteprotokollassa kuvatulla tavalla. Lyhyesti sanottuna plasmaa inkuboitiin nitroselluloosakalvojen kanssa, joissa oli sieppaus- ja kontrollivasta-aineita. Inkuboinnin jälkeen kalvot pestiin ja inkuboitiin streptavidiini HRP:n kanssa. Protokollasta poiketen käytimme SuperSignal West Femtoa (ThermoFisher, Madison, WI, USA; luettelonumero 34094) kemiluminesenssien havaitsemiseen, koska se antoi vahvemman signaalin. Blotit visualisoitiin FotoDyne gel doc -järjestelmällä.
2.7. Histologia
Formaliinikiinnitetty (10 prosenttia formaliinia), parafiiniin upotettu,munuaisetleikattiin 5 um:n paloiksi. Objektilasit poistettiin parafiinista, hydratoitiin uudelleen ksyleenistä asteitetun etanolisarjan kautta veteen ja käsiteltiin sen jälkeen alla kuvatulla tavalla. Diat skannattiin käyttämällä 20--objektiivia Aperio Digital Pathology Slide Scannerissa. Dr. Weixiong Zhong, MD, PhD, elinsiirtopatologi tarkasteli kaikki H&E-levyt ja pisteytti ne PTC:n, munuaiskerästulehduksen (g), vaskuliitin (v) / sisäkalvon arteriitin, interstitiaalisen tulehduksen (I) ja C4d-värjäytymisen suhteen Banff 2009:n mukaan. [21].
Erikseen objektilaseille annettiin sokkonumero, ja jokaiselta H/E-dialta otettiin ei-päällekkäisiä digitaalisia kuvia munuaistiehyistä ydinosan ja aivokuoren välisestä rajapinnasta. Varottiin, ettei se sisällä suuria suonen luumeneja ja glomeruluksia. Automaattinen punaisten ja sinisten pikselien kvantifiointi jokaisessa 10-munuainenkuva suoritettiin käyttämällä ImageJ-ohjelmistolla kirjoitettua mukautettua makroa (https://imagej.nih.gov/ij/index.html
näytetty 13.4.2021). Punaiset pikselit heijastivat proksimaalista putkimaista paksuutta, mukaan lukien siveltimen reuna. Ytimet kvantifioitiin sinisessä kanavassa. Sinisten ydinpikseleiden ja punaisten tubulusten suhde antoi tulehduksellisen infiltaatiopisteen valkosolujen infiltaatiolle transplantaation jälkeisessä vaiheessa.munuaiset. Pisteet laskettiin keskiarvosta ja piirrettiin käyttämällä Graphpad Prismia.
2.8. Aktivoitu kaspaasientsyymiaktiivisuus
Aktivoitunut kaspaasi 3 ja 7 aktiivisuus sisäänmunuainenhomogenaattisupernaatit määritettiin käyttämällä Apo-ONE fluoresoivaa substraattia (Promega, Madison, WI, USA) [16]. Lyhyesti, sulatettunamunuaisetsekoitettiin 8--kertaiseen ylimäärään lyysipuskuria, joka sisälsi 50 mM Na HEPES:ää, pH 7,4, 100 mM NaCl:a, 1 mM EDTA:ta, 10 mM DTT:tä, 10 % glyserolia ja homogenoitiin 4 °C:ssa 30 s Omni-kudoshomogenisaattorilla. . Munuaishomogenaattia sentrifugoitiin 4 °C:ssa (16,000- g) Eppendorf-mikrofuugissa 20 minuuttia. Supernataattien kaspaasiaktiivisuus ja proteiinipitoisuus määritettiin välittömästi Bradfordin menetelmällä käyttäen naudan seerumin albumiinia standardina. Aktivoidun kaspaasin määritys suoritettiin seuraavasti: 5 ul supernataattia (~ 40 ug supernateproteiinia) laimennettiin 50 ul:n kokonaistilavuuteen yllä olevalla lyysipuskurilla, sekoitettiin 50 ul:aan laimentamatonta Apo-ONE-substraattia kuopassa. musta, läpinäkymätön, 96-kuoppainen levy 60 minuutin reaktion aloittamiseksi. Levyjä ravisteltiin nopeudella 200 RPM 37 °C:ssa 60 minuuttia. DEVD-kaspaasisubstraatin peptidin pilkkoutuminen mitattiin käyttämällä BMG Clariostar -fluoresoivaa levylukijaa viritysaallonpituudella 499 nm ja emissioaallonpituudella 521 nm. Kaspaasistandardi sisällytettiin jokaiseen kokeeseen.
2.9. Rotan munuaisten mitokondrio
Puhdistettu mitokondriofraktio valmistettiin homogenisoidusta rottastamunuaisettavallisella sentrifugointitekniikalla [22]. Puhdistetut mitokondriot suspendoitiin 0,15 M Tris HCl -puskuriin, pH 7,4.
Sen määrittämiseksi, estääkö eksogeenisen PrC{0}} lisääminen ROS-indusoitua mitokondrio-DNA:n fragmentoitumista [22] 25 ul:n reaktiotilavuudessa (PCR-putkessa), lisäsimme: 1{{29} } uL puhdistettua mitokondriota, 5 uL PrC-210-laimennusta tai vettä (PrC-210 lisättiin 10 min ennen Fe plus plus plus ADP plus H2O2 ●OH -generaattoria) ja 10 ul, joka sisälsi FeCl2:ta (2,5 mM; FW: 127), adenosiini-5'-difosfaattinatriumsuola (10 mM; FW: 427) ja H202 (0,003 prosentin lopullinen pitoisuus). 20 minuutin kuluttua 37 °C:ssa 10 ul reaktiota sekoitettiin 5 ul:aan 6- geelilatausväriä, joka sisälsi 0,3 prosenttia SDS:ää; putket istuivat 60 °C vedessä 1 minuutin ajan, sitten 10 ul ladattiin kuoppaan, jossa oli 1 % agaroosi TAE-geeliä, ja 60 minuutin kuluttua 60 voltissa geelit värjättiin ja valokuvattiin. Jokaiselle määrityspisteelle tehtiin vähintään kolme toistoa tilastollisen vertailun mahdollistamiseksi.
2.10. Tilastollinen analyysi
Tiedot ilmaistaan keskiarvoina plus /一 sukupuolitaudit. Studentin t-testejä käytettiin tilastollisten erojen ja p-arvojen määrittämiseen GraphPad Prism 7.03 -ohjelmistolla. p-arvoja alle 0,05 pidettiin merkittävinä.
3. Tulokset
3.1. PrC-210 Munuaissiirteen patologian tukahduttaminen
20 tuntia siirron jälkeen siirretyn BN:n histologiamunuaiset(Kuvat 2A–D), joita käsiteltiin pelkällä UW-liuoksella, osoittivat selvästi kohonneita Banff-pisteitä tubuliitin ja peritubulaarisen kapillariitin osalta (punaiset ja keltaiset nuolet); summatut patologiset pisteet esitetään paneelissa E. BNmunuaisetperfusoituna PrC{0}} sisältävällä UW-liuoksella ja implantin jälkeiset vatsaontelonsisäiset systeemiset PrC-210-annokset (kuva 2D) osoittivat selvästi tukahdutettua munuaisten tulehduspatologiaa ja heikentyneet Banff-pisteet tubuliitin ja peritubulaarisen osalta kapillariitti on yhtä suuri kuin "0 h" -kontrolliryhmän Banff-pisteet (kuvio 2E). PrC-210:n antaminen vähensi merkittävästi sekä kreatiinin (p=0.032) että BUN:n (p=0.046) munuaisvauriomarkkereita.
3.2. Aktivoituneet kaspaasitasot siirron jälkeisissä munuaisissa
Aktivoidun kaspaasin tasot BN:ssämunuainenhomogenaatit vähenivät merkittävästi BN-allograftissamunuaisetjotka eivät olleet alttiina PrC{{0}}-hoidolle 20 tunnin aikana siirrosta (kuva 5). BN-munuaisten perfuusio PrC-210--pitoisella UW-liuoksella ja siirto Lewis-rotille, jotka saivat systeemisiä PrC-210-annoksia, johtivat samaan aktivoituun kaspaasiaktiivisuuteen kuin "0 tunnin" kontrollimunuaisissa.
3.3. Tulehdukselliset sytokiinitasot BN-munuaissiirteen jälkeen
Seulontakokeissamunuainenhomogenoi supernaatit 0 h kontrolleista ja 20 h ilman käsittelyämunuaisetseulottiin Proteome Profiler 29 -sytokiiniryhmällä muuttuneiden, tulehdukseen liittyvien sytokiinien ja kemokiinien ilmentymistasojen havaitsemiseksi 20 tuntia siirron jälkeen. Kuten kahdessa kuvan 6 mikrosirujen lisäyksessä näkyy, muutoksia havaittiin TIMP-1-, TNF-alpha- ja MIP-3a/CCL20-arvoissa. Yksittäisiä ELISA-levyjä käytettiin sitten kvantifioimaan nämä muutokset munuaishomogenaateissa ja seerumeissa, mukaan lukien nyt myös PrC-210:lla hoidetut rotat. Sekä TIMP-1- että TNF-alfa-tasot nousivat 20 tuntia transplantaation jälkeen, ja molemmissa tapauksissa niiden tasot laskivat PrC-210:n läsnä ollessa (kuvat 6A–C). MIP-3a/CCL20-tasot nousivat 20 tunnin kohdalla, mutta ne nousivat huomattavasti korkeammalle PrC-210-käsitellyillä rotilla (kuva 6D).
3.4. PrC-210 Rotan munuaisten mitokondrioiden suojaaminen
Jatkuva mitokondrioiden toiminta aikana ja sen jälkeenmunuainenelinsiirto on tarpeen siirretyn elimen selviytymiseksi. Siirteeseen liittyvän iskemian, iskemia-reperfuusion ja implantaation jälkeisen tulehduksen aikana syntyvä ROS voi kaikki vaikuttaa munuaisten mitokondrioiden suorituskykyyn ja eloonjäämiseen. Tärkeän mitokondriaalisen roolin vuoksi eristimme mitokondriot rotan munuaisista ja määritimme, voisiko PrC-210 suojata näitä organelleja saavutettavissa olevilla farmakologisilla pitoisuuksilla ROS-vauriolta.
Kuvassa 7 puhdistettu rottamunuainenmitokondrioita inkuboitiin ●OH-generaattorin kanssa [23]. Lyhyen reaktion jälkeen näimme rotan munuaisten mitokondrioiden DNA:n merkittävän ROS-fragmentoitumisen. ROS-vaurion jälkeen osa mitokondrioista liuotettiin SDS:ää sisältävään geelilatauspuskuriin, ja mitokondrio-DNA erotettiin ja "mitoitettu" käyttämällä agaroosigeelikromatografiaa (kuvio 7). ROS-infarkti pienensi selvästi rotan munuaisen mitokondrion DNA:n keskikokoa (kaista b), ja PrC-210:n lisääminen mitokondrioihin esti DNA:n rikkoutumisen (kaistat c–g) PrC:ssä-210 keskittymisestä riippuvaisella tavalla.
maca ginseng cistanche
4. Keskustelu
Allograftmunuainenelinsiirto, joka laukaisee synnynnäisen isäntäsolu- ja vasta-ainevälitteisen munuaisen hylkimisreaktion, on tärkeä tekijä lyhyen ja pitkän aikavälinmunuainenvaurioita siirron aikana, ja siihen liittyvä viivästynyt siirrännäistoiminto havaitaan jopa 50 prosentissa siirretyistä munuaisista. Suoritimme tämän tutkimuksen selvittääksemme, olisiko PrC-210 tehokas estämään allograftin munuaissiirron jälkeen aiheutetun vaurion vakavuutta rottamallissa, joka eliminoi suurelta osin siirteen iskeemisen ajan ja siihen liittyvän oksidatiivisen stressin. Oletuksemme oli, että tämän lähestymistavan pitäisi antaa meille mahdollisuus nähdä PrC-210:n vaikutus transplantaation jälkeiseen tulehduskohtaukseen minimaalisella iskemiahäiriöllä.
TNF-alfan lisääntyminen ja merkittävä mononukleaarinen infiltaatio osoittavat, että allograft-munuaisensiirto aiheuttaa voimakkaan akuutin tulehduksen 20 tunnin kuluessa siirrosta, ja tämä korreloi munuaistiehyissä havaittujen vaurioiden kanssa.munuainenhistologia (Banff Scores). TNF-alfaa tuottavat pääasiassa aktivoidut makrofagit, ja se on solusignaaliproteiini, joka osallistuu akuuttiin tulehdukseen. Se liittyy läheisesti akuutin ja kroonisen allograftin hyljinnän patogeneesiin [24].
Toisin kuin yllä olevat havainnot käsittelemättömästä BN:stämunuaiset, PrC{0}} annettuna osana UW-liuosta ja annettuna systeemisesti transplantaation jälkeen rotille alensi sekä TNF-alfa-tasoa että munuaisten infiltraatiota mononukleaaristen solujen kautta, jotka ovat molemmat merkkejä vähentyneestä akuutista tulehduksesta. PrC-210 vähensi munuaisvaurion, joka nähtiin histologisissa munuaisvauriopisteissä (Banff Scores), hoitamattomille taustatasoille ja alensi molempien munuaispatologian toiminnallisten pisteiden, kreatiniinin ja BUN:n tasoja.
Hoitamattomien BN-munuaisten tulehdus liittyi sekä TIMP-1- että MIP-3A/CCL20-arvon nousuun. Vertailun vuoksi havaitsimme, että PrC-210-hoito alensi merkittävästi TIMP-1-tasoa ja nosti merkittävästi MIP-3A/CCL20-tasoa.
Metalloproteinaasin-1 kudosestäjä (TIMP-1) on tärkeä ekstrasellulaarisen matriisin (ECM) synteesin ja hajoamisen säätelijä. Liiallinen ECM-kertymä on tärkein patologinen mekanismi fibroosin kehittymiselle akuutin munuaisvaurion aikana ja sen jälkeen. Normaalissa TIMP-1 ei käytännössä ilmenemunuainenkudos [25], havainto, joka vahvistetaan kuvioissamme 6A ja B, mutta TIMP-1:n tiedetään ilmentyvän vaurioituneissa munuaisissa, pääasiassa munuaisten tubulusepiteelisoluissa, munuaisten tubuluksen tyvikalvossa ja interstitiaalisen solun sytoplasmassa. soluja. Lisääntynyt TIMP-1-ilmentyminen korreloi positiivisesti samanaikaisen munuaisten toiminnan heikkenemisen kanssa [26]. PrC-210:lla hoidetut rotat osoittivat syvän laskun TIMP-1-tasoissa (p=0,001) sekä munuaishomogenaatissa että plasmassa; tämä tarkoittaa, että PrC-210 suojaa vahvasti munuaisen solunulkoisen matriisin transplantaation aiheuttamaa uudelleenjärjestelyä vastaan.
Kemokiini MIP-3a/CCL20 aktivoi CCR6-reseptorin, joka ilmentyy erityisesti säätelevissä T-soluissa (Tregs). CCL20 ekspressoituu tubulaarisissa endoteelisoluissa ja interstitiaalisissa soluissa, ja sitä säätelevät myös munuaisissa, joissa on akuutti munuaisvaurio. CCL20–CCR6-reitillä on elintärkeä rooli Treg-välitteisessä T-solujen rekrytoinnissa munuaisiin, ja Tregeillä on kuvattu olevan positiivinen roolimunuainenkorjaus, siirtotoleranssi ja munuaisten eloonjääminen. Sekä CCL20–CCR6-reitin vasta-aineesto että CCR6-puutteellisten hiirten käyttö akuuteissamunuainenvammakokeiden osoitettiin lisäävän munuaisten vajaatoiminnan vakavuutta ja kuolleisuutta [27]. Tämä viittaa siihen, että kliinisesti CCL20–CCR6-reitin tehostaminen ja Treg-aktivaatio voivat olla mahdollinen terapeuttinen tapa rajoittaa akuuttia ja kroonista.munuainenvahinko [28]. Tutkimuksessamme (kuva 6D) MIP-3a/CCL20-taso oli merkittävästi korkeampi PrC-210--käsitellyillä rotilla kuin hoitamattomilla rotilla. Arvelemme, että tämä on yksi syy sekä (i) huomattavasti pienempään mononukleaaristen solujen rekrytoitumiseen munuaisiin (kuva 3C) että (ii) merkittävästi vähentyneeseen munuaisvaurioon (kuva 2) PrC-210--käsitellyillä rotilla. .
Normaali munuaisten mitokondrioiden toiminta ja mikä tärkeintä, siihen kohdistuvat loukkaukset munuaisen varastoinnin, implantin ja implantin jälkeisen tulehduksen aikana ovat merkittäviä ROS-vaurion ja munuaisten vajaatoiminnan määrääviä tekijöitä siirron aikana. Näin ollen oli merkittävää, että PrC-210:n osoitettiin estävän täydellisesti mitokondrioiden DNA-fragmentaatiota (kuva 7) konsentraatioilla (2–4 mM), jotka on saavutettu sekä hiirten että rottien plasmassa, joille annettiin joko intraperitoneaalista tai suun kautta otettavat systeemiset 0.5 MTD-annokset PrC-210, jotka siedettiin ilman havaittavia toksisuuksia [29].
Aikaisemmissa munuaisensiirtoon liittyvissä tutkimuksissamme [16,17] havaitsimme aktivoituneen kaspaasin merkittävän lisääntymisen munuaisissa, jotka olivat alttiina "kylmäiskemialle" ja "iskemia-reperfuusiovauriolle". Nämä iskemian aiheuttamat munuaisten loukkaukset vähenivät taustalle PrC-210-hoidolla (kuva 8). Tämän käsikirjoituksen (kuvio 5) tutkimuksissa, joissa kylmäiskemia ja iskemia-reperfuusio eliminoituivat olennaisesti välittömällä siirrolla, aktivoituneen kaspaasin määrä ei lisääntynyt siirretyissä munuaisissa. Pikemminkin aktivoitu kaspaasi väheni merkittävästi plus 20 tunnin kohdalla "ei lääkehoitoa" -kontrolleissa, ja PrC{10}}-käsittely eliminoi tämän kaspaasin vähenemisen kokonaan yli 20 tunnin rotilla ja piti kaspaasin tason vakaana. Tulkintamme näistä mielenkiintoisista tuloksista on, että ilman merkittävää iskemian aiheuttamaa vapaaradikaalikohtausta ROS:n ja RNS:n kautta siirron jälkeiseenmunuaiset, siihen ei liity solukuolemaa ja apoptoosin markkereita, kuten aktivoituja kaspaaseja. Pikemminkin näissä allograft-munuaisensiirroissa äskettäin ilmentyneiden syto- ja kemokiinien tulehdukselliset signaalit säätelevät nyt solujen aineenvaihduntaa, joka sisältää apoptoosireittiin vaikuttamisen. Kirjallisuudessa kuvataan, että TIMP-1:n yli-ilmentyminen johtaa apoptoosin suppressioon [26]. Kaspaasituloksemme (kuva 5) tukevat tätä kuvattua TIMP-1-vaikutusta, ja ne viittaavat siihen, että TIMP-1 on tärkeä soluvaurioiden patofysiologian säätelyssä munuaissiirteensiirron jälkeen. Vahvistaa aikaisempaa TIMP-1-ilmentymän PrC-210-suppressiota (kuvat 6A, B), PrC-210-käsittely poisti kaspaasin muutoksen täysin pitäen kaspaasitasot samalla tasolla kuin kontrolli "0 h" munuaiset. Koska alentuneet PrC-210 seerumin TIMP-1 -tasot plus 20 tunnin kohdalla (kuva 6B) heijastavat tarkasti allograftin merkittävää suppressiota: (i) apoptoosi (kuva 5), (ii) histologinen patologia (kuvat 2 ja 3) ja (iii) tulehdussolujen infiltaatio (kuva 3), odotamme, että seerumin TIMP{19}}-tasojen seuranta ihmisen munuaissiirteen saajilla on looginen tapa seurata PrC{20}}-kliinistä tehoa tulevissa kliinisissä tutkimuksissa. .
Tähän mennessä tehdyssä työssämme [16,17] olemme osoittaneet, että PrC-210 pystyy suojaamaan siirrettyjä munuaisia sekä kylmäiskemialta että iskemia-reperfuusiovaurioilta. Tässä tutkimuksessa näemme nyt, että PrC-210 suojaa myös allograftin munuaisia ei-iskemiallisilta tulehduksilta, joita esiintyy munuaisen implantoinnin jälkeen. PrC-210 vähentää merkittävästi akuuttien tulehduksellisten sytokiinien, kuten TNF-alfan, tasoja ja vaimentaa TIMP-1-kemokiinin ilmentymistä. Molempien näiden tapahtumien, ja mahdollisesti myös lisä-CCL20-ilmentymisen tukemana, odotetaan: (i) vähentävän allograftin munuaisvaurioita, (ii) tukahduttavan T-solujen rekrytoitumista munuaiseen ja (iii) tukahduttavan synnynnäisen ja adaptiivinen immuunijärjestelmä. Kuvassa 8 teemme yhteenvedon näistä havainnoista tukeaksemme roolia, joka mielestämme PrC- 210 voi olla ihmisen munuaisensiirrossa. se estää: (i) kylmän iskemian reaktiivisten happiyhdisteiden (ROS) ja reaktiivisten typpilajikkeiden (RNS) taustavaurioita [17],
(ii) iskemia-reperfuusio ROS-vaurio taustalle [16] ja (iii) allograft-tulehdus vaurioittaa merkittävästi, joissakin tapauksissa, taustaa. Koska PrC-210:n pääasiallinen vaikutusmekanismi PrC-210:lle on hapen ja typen vapaiden radikaalien poistaminen, tämä tarkoittaa, että nämä vapaat radikaalit ovat tärkeä osatekijä ei-iskeemisissä olosuhteissa havaittavissa munuaisvaurioissa, esim. tässä käsikirjoituksessa tutkittu allograftiin liittyvä tulehdus.
Yhteenvetona tämä viittaa siihen, että PrC{0}} voisi tarjota laajalti sovellettavan elinsuojan moniin allograft-siirtotiloihin. se voisi suojata siirrettyjä munuaisia siirtoprosessin kaikissa vaiheissa ja sen jälkeen – elinten luovutuksesta, kuljetuksesta, uudelleenistutuksesta ja leikkauksen jälkeisestä tulehduksesta – akuutin ja kroonisen hylkimisreaktion minimoimiseksi.
Cistanche tubulosa ehkäisee munuaissairauksia, napsauta tästä saadaksesi näytteen
Tekijän panokset:NAW, WZ (Weifeng Zeng), WZ (Weixiong Zhong), BMV ja MMCG osallistuivat tutkimuksen suorittamiseen ja tietojen analysointiin; TRG ja NAW osallistuivat tutkimuksen suunnitteluun ja tietojen analysointiin; WEF ja TRG osallistuivat tutkimuksen suunnitteluun, tutkimuksen suorittamiseen, data-analyysiin ja artikkelin kirjoittamiseen. Kaikki kirjoittajat ovat lukeneet käsikirjoituksen julkaistun version ja hyväksyneet sen.
Rahoitus:Tätä tutkimusta rahoitti UW Institute for Clinical and Translational Research, ja se myöntää UL1TR002373 UW ICTR:lle NIH/NCATS:lta, American Society of Transplant Surgeonsilta (133 AAA1552), American College of Surgeonsilta (133 AAB2176) ja myöntää tukea WEF:lle (#). R03CA176799).
Institutionaalisen arviointilautakunnan lausunto: Wisconsinin yliopiston lääketieteen ja kansanterveyden korkeakoulun (Animal Protocol #M005204) Institutional Animal Care and Use -komitea hyväksyi tämän tutkimuksen.
Tietojen saatavuusilmoitus:Tutkimustiedot ovat täysin saatavilla tästä käsikirjoituksesta. Eturistiriidat: Kirjoittajat eivät ilmoittaneet eturistiriitoja.
Viitteet
1. Wang, H.; Naghavi, M.; Allen, C.; Parturi, RM; Bhutta, ZA; Casey, DC; Charlson, FJ; Chen, AZ; Coates, MM; Coggeshall, M.; et ai. Maailmanlaajuinen, alueellinen ja kansallinen elinajanodote, kaikista syistä johtuva kuolleisuus ja syykohtainen kuolleisuus 249 kuolinsyyn osalta, 1980–2015: Systemaattinen analyysi maailmanlaajuista sairaudentaakkaa koskevaa tutkimusta varten 2015. Lancet 2016, 388, 1459–1544. [CrossRef]
2. Treat, E.; Chow, E.; Peipert, JD; Waterman, A.; Kwan, L.; Massie, AB; Thomas, AG; Bowring, MG; Leeser, D.; Flechner, S.; et ai. Elävien luovuttajien munuaisten ja siirteen vastaanottajan tulosten toimittaminen. Arabi. Archaeol. Epigr. 2017, 18, 632–641. [CrossRef] [PubMed]
3. Paino, SC; Bell, PR; Nicholson, ML Munuaisiskemia-reperfuusiovaurio. Br. J. Surg. 1996, 83, 162-170. [PubMed]
4. Sellarés, J.; De Freitas, DG; Mengel, M.; Reeve, J.; Reinecke, G.; Sis, B.; Hidalgo, LG; Famulski, K.; Matas, A.; Halloran, PF Munuaissiirron epäonnistumisen syiden ymmärtäminen: vasta-ainevälitteisen hylkimisen ja noudattamatta jättämisen hallitseva rooli. Olen. J. Transplant. 2012, 12, 388–399. [CrossRef]
5. Siedlecki, A.; Irish, W.; Brennan, DC viivästynyt siirteen toiminta munuaissiirrossa. Arabi. Archaeol. Epigr. 2011, 11, 2279–2296. [CrossRef]
6. Hidalgo, LG; Campbell, pääministeri; Sis, B.; Meinecke, G.; Mengel, M.; Chang, J.; Sellars, J.; Reeve, J.; Halloran, PF; Hidalgo, LG; et ai. De NovoDonor-spesifinen vasta-aine munuaissiirtobiopsian yhteydessä liittyy mikrovaskulaariseen patologiaan ja myöhäiseen siirteen vajaatoimintaan. Arabi. Archaeol. Epigr. 2009, 9, 2532–2541. [CrossRef]
7. Loupy, A.; Hill, GS; Jordan, SC Luovuttajaspesifisten anti-HLA-vasta-aineiden vaikutus myöhäiseen munuaissiirteen vajaatoimintaan. Nat. Pastori Nephrol. 2012, 8, 348–357. [CrossRef]
8. Huang, G.; Wilson, NA; Reese, SR; Jacobson, LM; Zhong, W.; Djamali, A. Verensiirron aiheuttaman akuutin vasta-ainevälitteisen hylkimisen luonnehdinta munuaissiirron rottamallissa. Arabi. Archaeol. Epigr. 2014, 14, 1061–1072. [CrossRef] [PubMed]
9. Jordan, SC; Pescovitz, MD Esittely: Ongelma ja sen hallinta. Clin. J. Am. Soc. Nephrol. 2006, 1, 421–432. [CrossRef] [PubMed]
10. Stegall, M.; Gloor, J.; Winters, J.; Moore, S.; DeGoey, S. Plasmafereesin ja suuriannoksisen IVIG-desensibilisoinnin vertailu munuaissiirteen vastaanottajilla, joilla on korkea luovuttajaspesifisen allovasta-aineen taso. Arabi. Archaeol. Epigr. 2006, 6, 346–351. [CrossRef] [PubMed]
11. Peebles, DD; Soref, CM; Fahl, WE:n uuden PrC-210-aminotiolin ROS-sieppaaja ja säteilyä suojaava teho. Säteily. Res. 2012, 178, 57–68. [CrossRef]
12. Soref, CM; Hakkeri, TA; Fahl, WE on uusi oraalisesti aktiivinen, aminotioliradionsuojalääke, joka ei aiheuta pahoinvointia ja hypotension sivuvaikutuksia korkeimmillaan säteilyä suojaavina annoksina. Int. J. Radiat. Oncol. 2012, 82, e701–e707. [CrossRef]
13. Techapiesancharoenkij, N.; Fiala, JL; Navasumrit, P.; Croy, RG; Wogan, GN; Groopman, JD Sulforaphane, syöpää ehkäisevä aine, indusoi kalvon biosynteesiin liittyviä reittejä vasteena aflatoksiini B1:n kudosvaurioille. Toxicol. Appl. Pharmacol. 2015, 282, 52–60. [CrossRef] [PubMed]
14. Jermusek, F.; Benedict, C.; Dreischmeier, E.; Brand, M.; Under, M.; Jeffery, JJ; Ranallo, FN; Fahl, WE CT-säteilyn aiheuttaman DNA-vaurion merkittävä estäminen normaaleissa ihmissoluissa PrC-210-radiosuojalla. Säteily. Res. 2018, 190, 133–141. [CrossRef] [PubMed]
15. Hakkeri, TA; Diarra, G.; Fahl, BL; Takaisin, S.; Kaufmann, E.; Fahl, WE Vähensi merkittävästi iskemia-reperfuusiosolukuolemaa hiiren sydäninfarkteissa käyttämällä välittömästi vaikuttavaa PrC-210 ROS-savengeria. Pharmacol. Res. Näkökulma. 2019, 7, e00500. [CrossRef]
16. Bath, NM; Fahl, WE; Redfield, RR Vähentää merkittävästi hiiren munuaisten iskemia-reperfuusiosolukuolemaa käyttämällä välittömiä PrC-210-reaktiivisia happilajeja. Elinsiirto. Suoraan. 2019, 5, e549–e555. [CrossRef] [PubMed]
17. Verhoven, BM; Karim, AS; Bath, NM; Fahl, CJS; Wilson, NA; Redfield, RR; Fahl, WE paransi merkittävästi rotan munuaisten kylmäsäilytystä käyttämällä UW-elinten säilytysliuosta, jota on täydennetty välittömästi vaikuttavalla PrC-210 Free Radical Scavengerilla. Elinsiirto. Suora 2020, 6, e578. [CrossRef]
18. Giese, APJ; Guarnaschelli, JG; Ward, JA; Choo, DI; Riazuddin, S.; Ahmed, ZM Aminotioli PrC{1}}:n radiosuojaava vaikutus marsun säteilytettyyn sisäkorvaan. PLoS ONE 2015, 10, e0143606. [CrossRef]
19. Copp, RR; Peebles, DD; Fahl, WE Uuden aminotioliradioprotektoreiden perheen prototyypin jäsenen synteesi ja kasvua säätelevä aktiivisuus. Bioorganic Med. Chem. Lett. 2011, 21, 7426–7430. [CrossRef]
20. Fahl, WE; Peebles, D.; Copp, RR Aminotioliyhdisteet ja koostumukset käytettäväksi syöpähoidon yhteydessä. US-patentti 7 314 959, 12. huhtikuuta 2004.