Cistanche Tubulosasta peräisin olevan sakkaroosisyntaasin geenikloonaus, funktionaalinen tunnistus, rakenne- ja ilmentymisanalyysi Ⅱ

Tulokset ja analyysit

1 Sakkaroosisyntaasigeenien louhinta Cistanche tubulosasta ja CtSus-geenin kloonaus

Using the amino acid sequence of the identified Arabidopsis thaliana sucrose synthase AtSus1 as a template[16], the sequence was aligned in the Cistanche tubulosa transcriptome database by local Blastp. At the same time, two sucrose synthase gene sequences with FPKM values greater than 10 were screened out in combination with transcriptome gene annotation and gene expression abundance data. They were named CtSus and CtSus1, respectively. The comparative transcriptome data of different parts of Cistanche (haustoria, underground parts and aerial parts) were further analyzed. The distribution of chemical components in different parts of Cistanche plants has been studied in depth. The results showed that glycoside compounds represented by phenylethanoid glycosides in Cistanche are mainly present in its underground parts, with the highest content in the haustoria[22]. In the early stage of this study, the content of phenylethanoid glycosides in plant materials used for comparative transcriptome sequencing of different parts was also determined, confirming that the content of phenylethanoid glycosides in different parts of Cistanche tubulosa was different in the following manner: haustorium>underground part>>ilmaosa.

Laadukas Cistanche Tubulosa miesten terveydelle

Siksi Cistanche tubulosan eri osien transkriptitiedoissa saadut kahden ehdokkaan sakkaroosisyntaasigeenin ekspressiotason FPKM-arvot normalisoitiin Z-Scorella ja suoritettiin differentiaalianalyysi (kuvio 1A). Tulokset osoittivat, että CtSus-geenillä oli korkein ilmentymistaso haustoriumissa ja maanalaisessa osassa korkeampi kuin ilmaosassa, mikä vastasi glykosidiyhdisteiden kertymismallia Cistanche tubulosan eri osissa. kun taas CtSus1-geenin ilmentymistaso haustoriumissa oli alhainen. Siksi CtSus-geeni valittiin edellä olevien tulosten perusteella myöhempää sekvenssin monistusta, eksogeenistä ilmentämistä ja toiminnallista tunnistamista varten. Käyttämällä Cistanche tubulosa cDNA:ta templaattina, yksijuovainen tuote saatiin ~2500 bp:ssä PCR-monistuksen jälkeen (kuvio 1B). PCR-tuote otettiin talteen geelistä ja ligoitiin kloonausvektoriin, ja kohdegeenin täysipituinen koodaava alue saatiin sekvensoimalla. CtSus-sekvenssin pituus oli 2418 bp.

Kuvio 1 CtSus:n geeni tutkiminen ja kloonaus C. tubulosasta ja sen koodaaman proteiinin bioinformaattinen analyysi. A: CtSus- ja CtSus1-geenien ilmentymistasot C. tubulosanan eri osissa normalisoituina Z-pisteinä niiden FPKM-arvojen perusteella; B: CtSus:n geenin monistus; M: DNA-markkeri; C: SMART:n ennustama CtSus-proteiinin konservatiivinen domeeni; D: CtSus:n ja sakkaroosisyntaasien, jotka on tunnistettu muista kasveista, mukaan lukien Arabidopsis thaliana, Solanumtuberosum ja Albuca bracteata, useiden sekvenssien rinnastaminen. Sakkaroosisynteesidomeeni ja sokerinsiirtodomeeni on esitetty punaisilla ja sinisillä laatikoilla, vastaavasti; E: CtSus:n ja muiden kasvien sakkaroosisyntaasien fylogeneettinen analyysi; F: CtSus:n heterologisen ilmentymisen SDS-PAGE-analyysi käyttäen pCold™ I -vektoria E. colissa. Kaista 1: Proteiinimarkkeri; Kaista 2: Supernatanttifraktio; Kaista 3: Sakkafraktio. Punainen nuoli näyttää CtSus-proteiinin. G: Yksittäisen kloonin pesäke-PCR, joka sisältää molemmat kaksi rekombinanttiplasmidia. M: DNA-markkeri; 1: pET-28a-UGT71BD1; 2: pCold™ I-CtSus

Taulukko 2 Aminohapposekvenssien samankaltaisuudet CtSus:n ja muista kasveista tunnistettujen sakkaroosisyntaasien välillä

2.3 Fylogeneettinen analyysi

MEGA-ohjelmistolla rakennettua fylogeneettistä puuta käytettiin analysoimaan Cistanche tubulosan sakkaroosisyntaasin CtSus ja muiden kasviperäisten sakkaroosisyntaasien välistä fylogeneettistä suhdetta. Tulokset on esitetty kuviossa 1E. Kasviperäisillä sakkaroosisyntaaseilla on erilliset evoluutiohaarat kaksisirkkaisissa (alueet I ja II) ja yksisirkkaisissa (alue III). CtSus on kaksisirkkahaarassa, ja CtSusille läheisimmin sukua olevat sekvenssit ovat kaikki Lamiaceae-kasveista (Cistanche tubulosa on Lamiaceae Orobanchaceae -kasvi), kun taas toinen haara koostuu pääasiassa Solanales-kasveista, mikä edelleen osoittaa korkeaa säilyvyyttä ja kasviperäisten sakkaroosisyntaasigeenien homologia kasvien evoluutiossa samassa järjestyksessä. Niistä Orobanchaceae-kasvin Phelipanche ramosasta peräisin oleva sakkaroosisyntaasi PrSus (AEN79500.1) on läheisimmin sukua CtSus:lle.

3 CtSus:n eksogeeninen ilmentyminen ja aktiivisuusanalyysi

3.1 CtSus-geenin eksogeeninen ilmentyminen Sekvensoinnilla varmennetut pET-28a-CtSus-, pET-24b-CtSus- ja pCold™ I-CtSus -plasmidit siirrettiin ekspressiokompetenttiin E. coli Transettaan (DE3), ja positiiviset kloonit seulottiin pesäke-PCR:llä sekvensoinnin vahvistamiseksi. Saadut rekombinanttiekspressiokannat indusoitiin IPTG:llä matalassa lämpötilassa proteiinin ilmentämistä varten, bakteerit kerättiin sentrifugoimalla ja lyysipuskuri lisättiin bakteerien hajottamiseksi supernatantin ja saostuman saamiseksi, ja havaitsemista varten suoritettiin SDS-PAGE. Tulokset osoittivat, että kun pET-28a:ta ja pET-24b:tä käytettiin ekspressiovektoreina, CtSus ei ilmentynyt E. colissa, kun taas pCold™ I:tä käytettiin ilmentämisvektorina, selkeä CtSus. rekombinanttiproteiinivyöhyke havaittiin ~100 kDa:n alueella, mikä oli yhdenmukainen sen teoreettisesti ennustetun 92,2 kDa:n suhteellisen molekyylimassan kanssa (kuvio 1F).

3.2 Kokosolumuunnos

CtSus:n katalyyttisen toiminnan alustamiseksi todentamiseksi rakennettiin CtSus:n ja glykosyylitransferaasigeenin UGT71BD1 yhteisilmentymiskanta. UGT71BD1 kloonattiin ja tunnistettiin Cistanche tubulosasta, ja se on UDP-glukosyylitransferaasi, joka voi laajalti hyväksyä aromaattisia yhdisteitä, kuten fenyylietanoidiglykosideja, erityyppisiä flavonoideja, stilbeeniä ja kumariinia reseptoreina ja katalysoida UDP-substraattiryhmän glukosylaatioreaktiota käyttämällä UDP-substraattiglukosyylihappoa. sokerin luovuttajana [18]. CtSus:n käyttöönotto voi teoriassa tarjota riittävästi glykosyyliluovuttaja UDP-glukoosia UGT71BD1:n katalysoimaan glukosylaatioreaktioon, mikä edistää reaktion tasapainoa siirtymään kohti glykosylaatiotuotteiden muodostumista, mikä lisää glykosylaatiotuotteiden saantoa. pCold™ I-CtSus-plasmidi ja pET-28a-UGT71BD1-plasmidi transformoitiin samanaikaisesti ekspressiokompetenttiin E. coli Transettaan (DE3). Yksittäiset kloonit, jotka sisälsivät molemmat rekombinanttiplasmidit, seulottiin pesäke-PCR:llä, ja positiiviset rekombinanttiekspressiokannat saatiin sekvensointivarmentamalla (kuvio 1G). Kaksoisgeenin yhteisilmentyminen indusoitiin in vitro, ja pET-28aUGT71BD1 yhden geenin ilmentymiskantaa käytettiin kontrolliryhmänä. CtSus:n aktiivisuus UDP-glukoosin luovuttajan muodostumisen katalysoinnissa varmistettiin alustavasti kokosolutransformaatiolla. HPLC:n ja korkean erotuskyvyn massaspektrometrian tulokset osoittivat, että kun koko solun transformaatioreaktio suoritettiin akonitiini 1:llä ja resveratrolia 2:lla substraatteina, ilmeisten glykosylaatiotuotteiden muodostuminen havaittiin 24 tunnin transformaation jälkeen, kuten kuvassa 2 on esitetty.

Kuvio 2 Substraatin 1 tai 2 kokosolubiotransformaatio UGT71BD1:n sisältävällä rekombinanttikannalla tai vastaavasti CtSus:n kanssa kytketyn UGT71BD1:n sisältävällä rekombinanttikannalla. A: HPLC-kromatogrammit substraatin 1 koko solun biotransformaatiosta. Havaitsemisaallonpituus oli 360 nm; B: tuotteen la HRESI-MS- ja MS2-spektrit; C: HPLC-kromatogrammit substraatin 2 kokosolubiotransformaatiosta; Havaitsemisaallonpituus oli 330 nm. D: Tuotteiden 2a ja 2b HRESI-MS-spektrit

Kun 1 (m/z 179.{2}} [M+H]+, molekyylikaavaa C9H6O4) käytettiin substraattina, tuotekromatografinen piikki 1a (m/z 341.087 2 [M+H]+, ennustettu molekyylikaava C15H16O9) havaittiin 5,39 minuutissa, mikä oli yhdenmukainen UV:n kanssa. substraatin ja kontrollituotteen absorptio. Samanaikaisesti 1a:n MS2-spektrissä havaittiin fragmentin piikki m/z 179.{14}} [M+H]+, joka muodostui 1a:n menettäessä glukoosimolekyylin (162 Da), mikä osoittaa, että Kuvio 1a oli glukoosimolekyyliin yhdistetyn substraatin 1 tuote. Muuntokurssi laskettiin integroimalla piikin pinta-ala. Havaittiin, että substraattia 1 katalysoivien UGT71BD1-kokosolujen konversionopeus glykosyloidun tuotteen la muodostamiseksi oli 71,87 %, kun taas CtSus:n lisäys nosti reaktion konversionopeuden 95,84 %:iin, 1,3 kertaa kontrolliryhmän konversionopeus. Kun substraatti oli yhdiste 2 (m/z 227.072 5 [MH]-, molekyylikaava C14H12O3), tuotekromatografiset huiput 2a (m/z 389.123 4 [MH]-, ennustettu molekyyli kaava C20H22O8) ja 2b (m/z 575.{51}} [M+Na]+, ennustettu molekyylikaava C26H32O13), jotka ovat sopusoinnussa substraatin ja kontrollituotteen ominaisen UV-absorption kanssa, havaittiin 10,32 ja 6,52 minuutin kohdalla, vastaavasti. . Fragmenttihuippu havaittiin arvossa 3 [MH]-, joka muodostui yhden glukoosimolekyylin (162 Da) häviämisestä, mikä osoitti, että 2a oli substraatin 2 tuote, joka oli yhdistetty yhteen glukoosimolekyyliin. Vertaamalla kirjallisuuden [18] tietoihin ja massaspektrometrian ennustustietoihin, määritettiin, että tuote 2b oli substraatin 2 tuote, joka oli yhdistetty kahteen glukoosimolekyyliin. Muuntokurssi laskettiin käyttämällä integroitua huippualuetta. Havaittiin, että CtSus:n lisääminen voisi nostaa substraatin 2 glykosylaatioreaktion konversionopeutta 64,01 %:sta 78,51 %:iin, joista monosakkaridituotteen 2a saanto nousi 45,09 %:sta 63,58 %:iin ja disakkaridituotteen 2b saanto. muuttui 18,92 prosentista 14,93 prosenttiin.

3.3 CtSus-rekombinanttiproteiinin puhdistus ja in vitro -entsymaattisen aktiivisuuden tunnistaminen

Koko solun transformaatiokokeen tulokset viittaavat siihen, että CtSusilla on aktiivisuus katalysoida aktiivisen glukoosin luovuttajan UDP-glukoosin tuotantoa. Tämän katalyyttisen aktiivisuuden edelleen suoraan vahvistamiseksi in vitro -entsymaattisen katalyyttisen reaktion avulla CtSus-geenin fuusioproteiini pCold™-ilmentämisjärjestelmässä erotettiin ja puhdistettiin affiniteettikromatografialla. Tulokset osoittivat, että kun pCold™ I:tä käytettiin ekspressiovektorina, rekombinanttiproteiini ilmentyi suuria määriä, mutta enimmäkseen sakassa. Kun pCold™ TF:ää käytettiin ekspressiovektorina, CtSus-geeni ilmentyi suurina määrinä E. colissa (kuvio 3A). Fuusioproteiini puhdistettiin HisTrap FF -affiniteettikromatografialla ja sille suoritettiin in vitro entsymaattinen katalyyttinen reaktio. Tulokset on esitetty kuviossa 3B. Kun sakkaroosia ja UDP:tä käytettiin substraatteina, verrattuna negatiiviseen kontrolliryhmään, uusi tuotepiikki havaittiin 10,32 minuutin kohdalla. Sen retentioaika ja UV-absorptio olivat yhdenmukaisia ​​UDP-glukoosin kanssa. Tuotteen osoitettiin olevan UDP-glukoosia verrattuna standardiin. Kuitenkin, koska pCold™ TF -ekspressiovektorin ekspressoima fuusioproteiini sisältää suuren laukaisintekijän liukoisen tagin (merkkiproteiinin koko on 48 kDa), sillä on suuri vaikutus proteiinin katalyyttiseen aktiivisuuteen. Siksi fuusioproteiinin merkkiä leikattiin edelleen tekijä Xa -entsyymillä, ja CtSus-proteiini ilman eksogeenisiä merkkejä puhdistettiin (kuvio 3A). Proteiinille suoritettiin entsymaattinen katalyysi in vitro, ja tulokset osoittivat, että UDP-glukoosin saanto nousi 3,53 %:sta 10,66 %:iin.

(Kuva 3B). Yllä olevat tulokset vahvistivat CtSus:n aktiivisuuden UDP-glukoosin tuotannon katalysoinnissa in vitro entsymaattisen katalyysin avulla ja osoittivat myös, että suuren affiniteettimerkin läsnäolo edistää CtSus:n liukoista ilmentymistä, mutta se vaikuttaa myös merkittävästi entsyymin katalyyttinen aktiivisuus in vitro.

Kuva 3 CtSus:n heterologinen ilmentyminen ja toiminnallinen tunnistus. A: CtSus-proteiinien SDS-PAGE-analyysi. Kaista 1: Proteiinimarkkeri; Kaista 2: Rekombinantti CtSus liipaisutekijällä; Kaista 3: Laukaise tekijämerkkien pilkkominen käyttämällä tekijä Xa -proteaasia, jolloin saadaan punaisella nuolella leimattu CtSus-proteiini. B: Invitro-entsymaattiset määritykset, joissa käytetään fuusioproteiinia ja laukaisevia tekijävapaita CtSus-proteiineja UDP-glukoosin synteesin katalysoimiseksi sakkaroosin ja UDP:n läsnä ollessa, vastaavasti, vertailustandardin UDP-glukoosin kanssa. Keitettyä proteiinia käytettiin kontrolliryhmänä samoissa olosuhteissa. Havaitsemisaallonpituus oli 260 nm