Cistanche Tubulosasta peräisin olevan sakkaroosisyntaasin geenikloonaus, funktionaalinen tunnistus, rakenne- ja ilmentymisanalyysi Ⅲ

4 CtSus:n ilmentymisanalyysi Cistanche tubulosan eri osissa ja soluviljelyjärjestelmässä kuivuusstressissä

4.1 CtSus:n ekspressioanalyysi Cistanche tubulosan eri osissa

In vitro, kokosolutransformaatiokokeet ja entsymaattiset katalyyttiset reaktiokokeet vahvistivat, että CtSus-geenin koodaama proteiini voi katalysoida UDP-glukoosin synteesiä. Tämän geenin ja Cistanche tubulosan glykosidiyhdisteiden biosynteesin välisen korrelaation tutkimiseksi edelleen analysoitiin tämän geenin ilmentymistaso Cistanche tubulosan eri osissa.

LAATU LAADUKKAISTA CISTANCHE YRTTIÄ, JOKA SISÄLTÄ 10-98 % KIINAKOOSIDEA

Echinacoside is the most representative glycoside compound in Cistanche tubulosa, and its content can reach more than 30% of the dry weight of Cistanche tubulosa plants [23]. The research group previously measured the content of echinacoside in different parts of Cistanche tubulosa plants. Specifically, the content of echinacoside in different tissues is as follows: haustoria>underground part>>antenni osa; niistä haustorian ekinakosidipitoisuus on korkein.

Reaaliaikainen fluoresenssikvantitatiivinen PCR suoritettiin käyttämällä Cistanche tubulosan eri osista peräisin olevaa cDNA:ta templaatteina, ja tulokset analysoitiin 2–ΔΔCT-menetelmällä ja suoritettiin differentiaalianalyysi. Tulokset on esitetty kuviossa 4A. CtSus-geenin ilmentymistaso haustoriassa oli korkein, 1,5-kertainen ilmaosaan verrattuna, ja maanalaisessa osassa ilmentymistaso oli merkittävästi korkeampi kuin ilmaosassa, mikä on yhdenmukainen fenyylietanoidiglykosidien kertymismallin kanssa. jota edustaa ekinakosidi Cistanche tubulosan eri osissa.

Kuva 4 CtSus:n suhteelliset ilmentymistasot C. tubulosan ja PEG6000:lla käsiteltyjen suspensiosolujen eri osissa. A: CtSus:n suhteellinen ilmentymistaso C. tubulosan eri osissa; B: CtSus:n suhteellinen ilmentymistaso C. tubulosa -suspensiosoluissa, joita on käsitelty PEG6000:lla eri ajankohtina. n=3, 𝑥̅± s.*P ＜ 0,05,***P ＜ 0,001

4.2 CtSus:n ekspressioanalyysi Cistanche deserticola -suspensiosoluissa kuivuuden stressiolosuhteissa

Projektin alustava tutkimus osoitti, että PEG6000:n aiheuttama kuivuusstressi voi merkittävästi lisätä fenyylietanoliglykosidien kertymistä Cistanche deserticola -suspensiosoluihin. 3 - 9 päivää induktion jälkeen echinaceaside-pitoisuus kasvoi merkittävästi. Päivästä 12. päivään 15. päivään ekinakosidipitoisuuden kasvu hidastui ja saavutti maksimiarvon 15. päivänä. Sitten kun viljelyaika piteni, ekinakosidipitoisuus kasvoi merkittävästi. Fruktosidipitoisuus pieneni vähitellen [24]. Tämän tutkimuksen perusteella tässä artikkelissa käytettiin käsittelemättömien Cistanche deserticola -suspensiosolujen ja PEG{7}}-indusoitujen Cistanche deserticola -suspensiosolujen cDNA:ta mallina reaaliaikaisen fluoresenssikvantitatiivisen PCR-detektion suorittamiseksi CtSus-geenin tutkimiseksi Cistanche deserticola -suspensiosoluissa. kuivuuden stressiolosuhteet. Muutokset ilmentymistasoissa. Tulokset on esitetty kuviossa 4B. PEG6000:lla indusoiduissa Cistanche deserticola -suspensiosoluissa CtSus:n ilmentyminen lisääntyi merkittävästi kuudentena päivänä induktion jälkeen, saavutti korkeimman arvon 9. päivänä ja laski sitten takaisin samalle tasolle kuin kontrollissa. Saman tason ryhmät. Yllä olevat tulokset osoittavat, että kuivuusstressi voi merkittävästi lisätä CtSus-geenin ilmentymistä Cistanche deserticola -suspensiosolulinjassa, mikä on yhdenmukainen echinaceasiden kertymismallin kanssa kuivuusstressissä. CtSus-geenin ilmentymishuippu ilmestyy kuitenkin aikaisemmin kuin echinaceaside-pitoisuuden huippu, koska CtSus-katalyysillä syntetisoitu aktiivinen glykosyyliluovuttaja on tärkeä prekursori, jota tarvitaan monivaiheiseen glykosylaatioreaktioon myöhemmässä echinaceasiden biosynteesireitissä. , spekuloidaan, että kuivuusstressin jälkeen organismit mobilisoivat ensisijaisesti primaariseen aineenvaihduntaan liittyviä geenejä saavuttaakseen aktiivisten luovuttajien kertymisen ja saavuttaakseen sitten aineenvaihduntatuotteiden tärkeän sekundaarisen aineenvaihduntakertymän.

5 Tutkimus CtSus-proteiinin kolmiulotteisesta rakenteesta ja keskeisten aktiivisten kohtien analyysi

Perustuen CtSus:n toimintoon glykosyylidonorin UDP-glukoosin tuotannon katalysoinnissa, CtSus:n katalyyttisen aktiivisuuden rakenteellista perustaa tutkittiin edelleen. Proteiinin sekundaarirakenteen ennustamiseen käytettiin online-työkalua SOPMA. Tulokset osoittivat, että CtSus:n sekundäärirakenne sisälsi 55,28 % -kierteitä, 25,47 % satunnaisia ​​kierteitä, 12,80 % pitkiä juosteita ja 6,46 % -käänteitä (kuva 5A), mikä osoittaa, että -heliksit ovat CtSus-proteiinin tärkeimmät toissijaiset rakenneyksiköt. seuraa satunnaiset kierteet, jotka myös muodostavat suuren osan proteiinista. Laajennetut säikeet ja käännökset jakautuvat koko proteiiniin. Olemassa olevien tutkimusten mukaan sakkaroosisyntaasi esiintyy yleensä tetrameerin muodossa, jota pidetään sen aktiivisena muotona. Siksi tässä artikkelissa käytettiin edelleen AlphaFold2:ta ennustamaan CtSus-proteiinin rakennetta ja saatiin sen proteiinitetrameerien kolmiulotteinen rakenne. PDB (Protein Data Bank) -tietokannan vertailussa havaittiin, että Arabidopsis thaliana -sukroosisyntaasin AtSus1 (PDBID 3S28) ja CtSus:n sekvenssien samankaltaisuus voi olla 77,93 %. Ennustettua CtSus-rakennetta verrattiin AtSus1:n kolmiulotteiseen rakenteeseen, ja keskimääräinen neliöpoikkeama (RMSD) proteiinin superpositiota jälkeen oli 1,11 Å, mikä osoittaa, että näiden kahden tilarakenteet ovat erittäin yhdenmukaisia ​​(kuvio 5B).

Kuva 5 CtSus:n rakennetutkimus. V: CtSus:n ennustettu toissijainen rakenne käyttämällä SOPMA:ta.Blue: helix; Violetti: Satunnainen kela; Punainen: Jatkettu nauha; Vihreä: arkki. B: AtSus1 (sininen) ja CtSus (vihreä väri) kolmiulotteisen rakenteen kohdistus. Molemmat esitettiin tetrameerinä. C: Avaintähteet AtSus1:n (sinisenä värinä) ja CtSus:n (vihreänä leimatuilla tähteillä) substraattia sitovassa taskussa; D: UDP:n ja fruktoosin sitovien konformaatioiden kohdistus AtSus1:ssä (sinisellä värillä) ja CtSus:lla (vihreällä värillä); E: UDP:n ja CtSusin väliset vuorovaikutukset Discovery Studio Clientin analysoimana 2D-kaaviona

Raportoitua Arabidopsis AtSus1:n proteiini-ligandikidekompleksirakennetta UDP:n ja fruktoosin kanssa (PDBID3S29) käytettiin templaattina [16] analysoimaan CtSus:n sitoutumismuotoa UDP:n ja fruktoosin kanssa. Molekyylitelakkatulokset on esitetty kuvassa 5C. Voidaan havaita, että AtSus1:n ja CtSus:n substraattia sitovat taskut ovat hyvin samankaltaisia ​​aminohappotyypin, tilajakauman ja konfiguraation suhteen, ja päällekkäisyys on suuri, mikä osoittaa, että sakkaroosisyntaasin sekvenssi on erittäin konservoitunut kasveissa. Kahden ligandin, UDP:n ja fruktoosin, konformaatiot proteiinisubstraattia sitovassa taskussa on esitetty kuviossa 5D. UDP:n ja CtSus:n molekyylitelakoinnin edullisin konformaatio menee hyvin päällekkäin AtSus1-UDP-kidekompleksissa olevan UDP:n konformaation kanssa, mikä todistaa molekyylitelakointitulosten tarkkuuden. UDP:n ja avainaminohappotähteiden välinen vuorovaikutus proteiinisubstraattia sitovassa taskussa on esitetty kuviossa 5E. UDP ja CtSus ovat pääasiassa sitoutuneet toisiinsa vetysidoksilla ja hydrofobisilla vuorovaikutuksilla. Keskeisiä aminohappotähteitä substraattia sitovassa taskussa ovat Leu294, Gly301, Met576, Arg578, Lys583, Gln646, Asn652, Leu677, Thr678 ja Glu681.

Keskustelu

Glykosylaatiomodifikaatio on yksi tärkeimmistä tavoista parantaa luonnontuotteiden tai lääkeprekursoreiden fysikaalisia ominaisuuksia ja biologisia aktiivisuuksia. Verrattuna perinteisiin kemiallisiin menetelmiin, entsymaattisella glykosylaatiomodifikaatiolla on etuna lievät reaktio-olosuhteet, vahva selektiivisyys ja ympäristöystävällisyys. Glykosyylitransferaasin glykosylaatioreaktio vaatii kuitenkin suuren määrän UDP-sokerin luovuttajia, jotka ovat kalliita ja vaikeita saada, mikä johtaa siihen, että glykosyylitransferaaseja ei voida käyttää laajasti teollisessa tuotannossa. Sakkaroosisyntaasi voi katalysoida palautuvaa reaktiota: sakkaroosi + UDP ⇌ UDP-glukoosi + fruktoosi ja voi muodostaa uusiutuvan UDP-glukoosisyklin kytkentäreaktion kautta glykosyylitransferaasin kanssa. Cistanche tubulosa sisältää runsaasti erilaisia ​​rakenteellisia glykosidiyhdisteitä, joita edustavat fenyylietanoliglykosidiyhdisteet, mikä viittaa siihen, että sen kehon aktiivisella glykosyyliluovuttajasynteesireitillä, johon liittyy sakkaroosisyntaasi, on voimakas aineenvaihdunta, mutta Cistanche-kasveista peräisin olevalla sakkaroosisyntaasilla ei ole on raportoitu. Tässä tutkimuksessa sakkaroosisyntaasigeeni CtSus kloonattiin Cistanche tubulosasta ensimmäistä kertaa. Tämän geenin koodaama proteiini sisältää kasvien sakkaroosisyntaasin konservoituneen domeenin. Vertaamalla muiden kasvien sakkaroosisyntaasien sekvenssejä havaittiin, että aminohapposekvenssien samankaltaisuus sen ja samaa luokkaa olevien kasveista peräisin olevien sakkaroosisyntaasien välillä oli yli 90 %, mikä osoittaa kasveista peräisin olevien sakkaroosisyntaasien korkean sekvenssin säilymisen. Molekyylievoluutioanalyysi osoitti, että CtSus kuuluu kaksisirkkaisten kasvien sakkaroosisyntaasihaaroihin ja on läheisimmin sukua Orobanchaceae-perheen P. ramosan sakkaroosisyntaasiin PrSus.

CtSusin katalyyttisen aktiivisuuden tutkimiseksi tässä tutkimuksessa yhdistettiin glykosyylitransferaasi UGT71BD1, jonka aktiivisuuden tutkimusryhmä on aiemmin todennut, rakentaakseen kaksoisplasmidin yhteisilmentymisjärjestelmän. Kokosolukatalyyttisten kokeiden avulla olosuhteet saavutettiin lisäämättä ylimääräisiä UDP-sokerin luovuttajia. Kumariiniyhdisteen kanelin ja stilbeeniyhdisteen resveratrolin glykosylaatioreaktio. Verrokkiryhmään verrattuna CtSus:n lisääminen lisäsi merkittävästi UGT71BD1--katalysoimien glykosylaatioreaktioiden konversionopeutta. Tämän perusteella tämä tutkimus rakensi edelleen CtSus-rekombinanttiekspressioplasmidin ja saavutti rekombinanttiproteiinin liukoisen ilmentymisen E. colissa. In vitro, entsymaattiset katalyyttiset reaktiot osoittavat, että sakkaroosin ja UDP:n läsnä ollessa CtSus voi katalysoida UDP-glukoosin muodostumista, ja sen jälkeen kun rekombinanttiproteiinin sisältämä laukaisutekijän affiniteettimerkki on poistettu, CtSusin tuote katalysoi UDP:n muodostumista. - saadaan glukoosia. Korko on parantunut huomattavasti. Kokosolutransformaatio ja in vitro entsymaattiset katalyyttiset reaktiot vahvistivat CtSus:n aktiivisuuden sakkaroosisyntaasi katalyyttisesti aktiivisena sokerin luovuttajana UDP-glukoosina. CtSus-geenin ja Cistanche tuberosumin glykosidien biosynteesin välisen korrelaation tutkimiseksi edelleen CtSus:n ilmentymistä Cistanche tuberosumin eri osissa analysoitiin reaaliaikaisilla fluoresenssikvantitatiivisilla PCR-kokeilla. Tulokset osoittivat, että geeni ilmeni Cistanche tuberosumin haustoriassa. Korkein ilmaisutaso. Cistanche deserticola on loiskavi, joka ei voi saada kasvuun ja kehitykseen tarvittavia ravintoaineita fotosynteesin kautta. Siksi sen on oltava loisia isäntäkasvin juurissa ja luottaa siihen, että isäntäkasvi saa ravinteita kasvun ylläpitämiseksi. Kasveissa sakkaroosi tarjoaa enimmäkseen energian ja hiililähteiden luovuttajia [12]. Solut eivät kuitenkaan voi käyttää sakkaroosia suoraan, ja se on hajotettava edelleen. Haustoria on Cistanche deserticolan ja isäntäkasvin välinen silta, ja sillä on tärkeä rooli sen kasvuprosessissa. ratkaiseva

[25], siksi sakkaroosisyntaasin korkea ilmentyminen Cistanche deserticolan haustoriassa on kohtuullinen. CtSus:n korkea ilmentyminen haustoriassa on myös yhdenmukainen fenyylietanoidiglykosidien suuren kertymiskuvion kanssa haustoriassa. Lisäksi fluoresenssikvantitatiivisen PCR-analyysin avulla CtSus-geenin ilmentymistasojen muutoksista Cistanche deserticola -suspensiosoluissa eri ajankohtina kuivuusstressissä havaittiin, että kuivuusstressi voi merkittävästi lisätä CtSus-geenien ilmentymistä suspensiosolulinjassa, joka on yhdenmukainen echinaceasiden kanssa. Kertymiskuvio suspensiosolulinjoissa kuivuusstressissä on johdonmukainen. Yllä olevat tulokset viittaavat siihen, että CtSus osallistuu fenyylietanoidiglykosidien biosynteettiseen reittiin, jota echinacea edustaa Cistanche tulipiksessa in vivo. Se on yksi monista biosynteettisistä reiteistä. Ensimmäisen vaiheen glykosylaatioreaktio tuottaa aktiivisen glykosyylin luovuttajan UDP-glukoosin. Lyhyesti sanottuna tämä tutkimus

Tutkimuksessa tunnistettiin Cistanche deserticolassa uusi sakkaroosisyntaasigeeni, joka mahdollisti aktiivisten glykosyyliluovuttajien entsymaattisen synteesin in vitro ja tarjosi uusia geneettisiä elementtejä teknisten bakteerien rakentamiseen Cistanche deserticola -glykosidien biosynteesiä varten.

Tekijän panokset: Tian Weisheng vastasi bioinformatiikan analyysistä, ilmentymisanalyysistä, entsyymiaktiivisuusanalyysistä ja CtSus-geenin ensimmäisen luonnoksen kirjoittamisesta; Yan Yaru vastasi geenien seulonnasta ja kloonauksesta; Cui Xiaoxue ja Huang Wenqian osallistuivat bioinformatiikan analyysiin ja ilmentymisanalyysiin; Wang Yingxia ja Zhao Saijing osallistuivat vektorien rakentamiseen ja entsyymien aktiivisuusanalyysiin; Li Jun ja Shi Shepo ohjasivat pääasiassa entsyymiaktiivisuusanalyysiä ja ilmentymisanalyysiä; Tu Pengfei ja Liu Xiao vastasivat paperiidean suunnittelusta, ohjasivat kokeiluja sekä paperin kirjoittamisesta ja tarkistamisesta. Kaikki kirjoittajat osallistuivat paperin tarkistamiseen.

Viitteet

[1] Kappale ZH, Lei L, Tu PF. Edistystä CistancheHoffingin kasvien farmakologisen aktiivisuuden tutkimuksessa. et Link [J]. Chin Tradit Herb Drugs (中草药), 2003, 34: 113-115.

[2] Liu WJ, Liu Y, Song QQ, et ai. Kemoomivertailu viljellyn ja villin Cistanchetubulosan välillä käyttäen1H-NMR-spektroskopiaa [J]. China J Chin Mater Med (中国中药杂志), 2018, 43:3506-3512.

[3] Song Y, Zeng K, Jiang Y ym. Cistanches Herba, uhanalaisesta lajista suureksi kiinalaiseksi lääkemerkiksi [J]. Med Res Rev, 2021, 41: 1539-1577.[4] Liu Y, Wang H, Yang M, et ai. Cistanche deserticola -polysakkaridit suojaavat PC12-soluja OGD/RP-indusoidulta vauriolta [J]. Biomed Pharmacother, 2018, 99: 671-680.

[5] Yin Y, Huang J, Gu X, et ai. Kasvien nukleotidi-sokeri interkonversioentsyymien evoluutio [J].PLoS One, 2011, 6: e27995.

[6] Bar-Peled M, O'Neill MA. Kasvien nukleotidisokerin muodostuminen, keskinäinen muuntaminen ja pelastaminen sokerin kierrätyksellä [J]. Annu Rev Plant Biol, 2011, 62: 127-155.

[7] Guo H, Li L, Wang PG. UDP-GlcNAc/Glc4-epimeraasin biokemiallinen karakterisointi Escherichia colista O86:B7 [J]. Biochemistry, 2006, 45: 13760-13768.

[8] Dong S, Chesnokova ON, Turnbough CL Jr, et ai. Exosporium-proteiinin glykosylaatioon osallistuvan UDP-N-asetyyliglukosamiini4-epimeraasin tunnistaminen Bacillus anthraciksessa [J]. J Bacteriol, 2009, 191: 7094-7101.

[9] Li LN, Kong JQ. Sakkaroosisyntaasigeenien transkription kattava tunnistus Ornithogalumcaudatumissa [J]. RSC Adv, 2016, 6: 18778-18792.

[10]Schmölzer K, Gutmann A, Diricks M, et ai. Sakkaroosisyntaasi: ainutlaatuinen glykosyylitransferaasi biokatalyyttisen glykosylaatioprosessin kehittämiseen [J]. Biotechnol Adv, 2016, 34: 88-111.[11]Cardini CE, Leloir LF, Chiriboga J. Sakkaroosin biosynteesi [J]. J Biol Chem, 1955, 214: 149-155.