Tutkimus Cistanche Deserticolasta (Pseudalkalibacillus Sp. A8) peräisin olevan endofyyttisen bakteerin suolan ja alkalin sietokyvystä

 

Abstrakti

Tavoite:Endofyyttisten bakteerien eristämiseenCistanche deserticolaja tutkia mahdollisia mekanismeja, jotka ovat suola-alkalitoleranssin taustallaPseudalkalibacillussp. A8.
Menetelmät:Endofyyttiset bakteerit eristettiin käyttämällä laimennusmaljausmenetelmää. Kannan A8 luokitus määritettiin morfologisten ominaisuuksien ja 16S rRNA-geenin sekvensoinnin perusteella. Sitten suoritettiin koko genomin sekvensointi ja metabolomianalyysit.
Tulokset:Viisikymmentä endofyyttistä bakteerikantaa eristettiin tuoreestaCistanche deserticolanäytteet, jotka kattavat 4 fylaa, 8 luokkaa ja 35 sukua. Niistä kanta A8 on ensimmäinenPseudalkalibacilluskasveista eristettyjä lajeja, jotka osoittavat poikkeuksellista suola-alkalin sietokykyä. Se kykeni kasvamaan pH-alueella 6,0-13,0 ja NaCl-pitoisuuksissa jopa 17 %. Genomiannotaatio paljasti 10 geeniä, jotka liittyvät suola-alkaliresistenssiin. Aineenvaihdunta-analyysi korkean suolapitoisuuden ja korkean pH:n olosuhteissa tunnisti 186 erilaista metaboliittia, jotka rikastuivat seitsemällä suola-alkalistressin sopeutumiseen liittyvällä toiminnallisella reitillä.
Johtopäätös:Tämä tutkimus tarjoaa arvokkaita mikrobiresursseja viljelykasvien suola-alkalisietokyvyn parantamiseen ja tarjoaa teoreettista tukea suola-alkali-maaperän parantamiseen mikrobien avulla. Se myös luo pohjan suola-alkalit sietävien bakteerien molekyylimekanismien ymmärtämiselle.

Avainsanat: Cistanche deserticola; endofyyttiset bakteerit; suola-alkalin sietokyky; koko genomin sekvensointi; UPLC-MS/MS

 

 

 

Cistanche deserticol -kukka

Johdanto

Maaperän suolaantuminen ja alkalisoituminen ovat suuria maailmanlaajuisia haasteita, jotka edistävät merkittävästi maaperän huononemista ja aavikoitumista. On arvioitu, että noin 20 % maailman peltoalasta vaikuttaa suolapitoisuudelta vaihtelevassa määrin, ja pelkästään Kiinalla on 9,9×10⁷ hehtaaria suola-alkalimaata, joka on maailman suurin. Tällaisilla maaperillä on tyypillisesti huono läpäisevyys, alhainen hedelmällisyys ja kova rakenne, mikä heikentää vakavasti sadon kasvua ja satoa. Siksi tehokkaiden strategioiden kehittäminen suolaisen ja alkalipitoisen maaperän hyödyntämiseksi ja parantamiseksi on edelleen kriittinen kysymys.

Viimeaikaiset tutkimukset viittaavat siihen, että mikrobisiirrosteet, erityisesti suola-alkalit sietävät kannat, voivat parantaa sadon sietokykyä ja parantaa maaperän ominaisuuksia kustannustehokkaalla ja ympäristöystävällisellä tavalla. Endofyyttiset bakteerit - ne, jotka asuvat kasvien kudoksissa aiheuttamatta sairauksia, jakavat ekologisia ja fysiologisia piirteitä isäntäkasveinsa kanssa.Cistanche deserticola, autiomaassa asuva loiskasvi, joka tunnetaan äärimmäisestä suola-alkalikestävyydestään, on lupaava lähde stressiä sietävien endofyyttien eristämiseen.

Tämän tutkimuksen tavoitteena on:

Eristä endofyyttiset bakteeritCistanche deserticola;

Suola-alkalit sietävien kantojen seulonta;

Tutustu valitun kannan jännityskestävyysmekanismeihinPseudalkalibacillussp. A8 koko genomin ja metabolomisten analyysien kautta.

Cistanche deserticol -kukka

Materiaalit ja menetelmät

1.1 Materiaalit

Kasvinäyte: Cistanche deserticolakerätty maaliskuussa 2023 Xiquan Townista, Jingtaixianista, Baiyinista, Gansun maakunnasta, Kiinasta. Tunnistanut prof. Guo Yehong, Gansun maatalousyliopisto.

Media:TSB nestemäinen väliaine; kiinteytettiin käyttämällä 20 g/l agaria.

Reagenssit ja instrumentit:Analyyttistä laatua oleva NaClO, KH2PO4, K2HPO4, TAE-puskuri; Agilent QTOF 1290–6542 -massaspektrometri, R-1001V pyöröhaihdutin, Neofuge 15R -sentrifugi, SureCycler 8800 -gradientti-PCR.

1.2 Endofyyttisten bakteerien eristäminen

TuoreCistanchekudos pintasteriloitiin ja homogenisoitiin. Sarjalaimennokset maljattiin R2A-, TSB-, ISP-2- ja 2216E-alustoille. Pesäkkeet eristettiin ja puhdistettiin kolmen alaviljelmän kautta, minkä jälkeen niitä säilytettiin 20 % glyserolissa -80 asteessa.

1.3 16S rRNA -geenin tunnistus

Genominen DNA uutettiin ja monistettiin käyttämällä yleisalukkeita 27F/1492R. PCR-tuotteet sekvensoitiin ja analysoitiin EzBioCloud-tietokannan avulla.

 

Cistanche-pohja

Wecistanchen tukipalvelu - Lisätietoja yhteistyöstä
Sähköposti:wallence.suen@wecistanche.com
 

 

1.4 Fenotyyppinen ja fysiologinen karakterisointi

SEM:Solujen morfologia havaittiin kultapinnoituksen jälkeen.

NaCl-toleranssi:Kasvu arvioitiin 0–20 % NaCl:lla.

pH-toleranssi:Kasvu mitattuna pH:ssa 4–13.

Lämpötila-alue:Kasvu testattu 4-50 asteessa.

1.5 Koko genomin sekvensointi

Kanta A8 sekvensoitiin käyttämällä PacBio-tekniikkaa. Genomikokoonpano ja annotaatio suoritettiin kuutta suurta tietokantaa vastaan ​​(NR, Swiss-Prot, Pfam, EggNOG, GO, KEGG). Suola-alkalitoleranssiin liittyvät geenit seulottiin.

1.6 UPLC-MS/MS-analyysi

Näytteitä viljeltiin kolmessa olosuhteissa:

A: pH 7,2, NaCl 0,5 %

B: pH 7,2, NaCl 14 %

C: pH 13,0, NaCl 0,5 %

Supernatantit kuivattiin, liuotettiin metanoliin ja analysoitiin käyttämällä UPLC-MS/MS:ää (ZORBAX Eclipse Plus C18, positiivinen ionimoodi).

Tulokset ja analyysi

2.1 Endofyyttien eristäminen

Viisikymmentä kantaa eristettiinCistanche deserticola, joka kuuluu 4 fylaan ja 35 sukuun.

2.2 Kannan A8 tunnistaminen

16S-rRNA-sekvenssi osoitti 99,30 %:n samankaltaisuuttaPseudalkalibacillus salsuginis. Fylogeneettinen analyysi vahvisti sen jäseneksiPseudalkalibacillus. Morfologisesti pesäkkeet olivat sileitä, kellanruskeita, sauvan muotoisia (1–6 µm), joissa oli hieman nukkaa SEM:n alla.

Kasvualue:20-45 astetta (optimaalinen: 30 astetta)

pH-alue:6–13 (optimaalinen: 9,0)

Suolavalikoima:0–17 % NaCl (optimaalinen: 0–5 %)

2.3 Genomianalyysi

Genomin pituus: 6,022,064 bp

GC-sisältö: 40.99%

Proteiinia koodaavat geenit: 5,825 (82.5%)

tRNA/rRNA:76 tRNA:ta, 24 rRNA:ta

ANI-arvot:Kaikki<95%, indicating a potential novel species.

COG-merkintä:4 683 geeniä (80,39 %)

Aminohappojen kuljetus/aineenvaihdunta (556), hiilihydraattiaineenvaihdunta (501), transkriptio (464), lipidiaineenvaihdunta (440), koentsyymiaineenvaihdunta (298), puolustusmekanismit (100)

Tunnistetut suola-alkalitoleranssigeenit:

Glysiini/betaiini kuljettaja

Natriumin välittäjä

Antiportterit

F0F1 ATP-syntaasi

2.4 Metabolinen analyysi

Metaboliitin tunnistus:Yhteensä 986 metaboliittia havaittu

OPLS-DA-analyysi:Selkeä ero ryhmien välillä; R²X > 0,5, R²Y=1, Q² > 0,85,P< 0,005

Differentiaaliset aineenvaihduntatuotteet:

186 yhteensä:

Ryhmä B: 96 (13 ylössäänneltyä, 83 alennettua)

Ryhmä C: 132 (41 ylöspäin, 91 alasääntelyä)

49 säännelty sekä B & C:ssä

196 yksilöllisesti ilmentynyttä metaboliittia B & C:ssä

246 ylisäädeltyä tai ainutlaatuista metaboliittia

Reitin rikastus (KEGG):

Seskviterpenoidi ja triterpenoidibiosynteesi

Puriinin aineenvaihdunta

Lysiinin biosynteesi ja hajoaminen

Pantotenaatin ja CoA:n biosynteesi

Arginiinin ja proliinin aineenvaihdunta

Steroidien biosynteesi

Nämä tulokset viittaavat siihen, että kanta A8 mukautuu suola-alkalistressiin sekä geneettisen että metabolisen säätelyn kautta.

---

Johtopäätös

Tämä tutkimus eristettiin ja tunnistettiin onnistuneestiPseudalkalibacillussp. A8 alkaenCistanche deserticola, potentiaalinen uusi laji, jolla on vahva suola-alkaliresistenssi. Koko genomin ja metabolomisten analyysien avulla on tunnistettu useita geenejä ja aineenvaihduntareittejä sen stressiin sopeutumiseen vaikuttaviksi. Nämä havainnot tarjoavat teoreettisen perustan mikrobien kehittämiselle kasvien sietokyvyn parantamiseksi ja suola-alkalimaaperän talteenottamiseksi.

 

Viitteet

Wang Y., Wang Y., Zhang Q. et ai.Suolaliuos-alkali-maaperän ominaisuudet, joita paransivat synergistiset vaikutuksetPriestia aryabhattaiJL-5,Staphylococcus pseudoxylosusXW-4,Leymus chinensisja maaperän mikrobiota. International Journal of Molecular Sciences, 2023, 24(9): 7737.

Chen Wentao, Guo Lizhuo, Shan Bin, et ai.Maaperän muutosten vaikutukset kauran kasvuun ja maaperän fyysisiin ominaisuuksiin suola-emäksisessä maassa. Gansun maatalousyliopiston lehti, 2024, 59(5): 136–144. (kiinaksi)

Lu Yuxin, Yan Hong, Bai Yani, et ai.Eristys ja suola-alkalin sietomekanismiRhizobiumSiivilöi BFL-3. Journal of Agricultural Biotechnology, 2023, 31(7): 1501–1512. (kiinaksi)

Yu Jiang, Wang Xinzhen, Wang Chun ym.Suola-alkalit sietävän aineen käyttöCitrobakteeriKanta kasvien kasvun edistämisessä ja sen suola-alkalitoleranssigeenien louhinnassa. Mikrobiologia Kiina, 2024, 51(3): 864–879. (kiinaksi)

Wani ZA, Ashraf N., Mohiuddin T. et ai.Kasvien ja endofyyttien symbioosi: ekologinen näkökulma. Soveltava mikrobiologia ja biotekniikka, 2015, 99(7): 2955–2965.

Venieraki A., Dimou M., Katinakis P.Lääkekasveissa elävillä endofyyttisillä sienillä on kyky tuottaa samoja tai samankaltaisia ​​farmakologisesti aktiivisia sekundaarisia aineenvaihduntatuotteita kuin isäntänsä. Hellenic Plant Protection Journal, 2017, 10: 51–66.

Kiinan farmakopean komissio.Kiinan kansantasavallan farmakopea, osa I. Peking: China Medical Science Press, 2020: 79–80.(kiinaksi)

Fu Kejian, Cui Yonghe, Huang Zhihua et ai.Biokontrollibakteerien seulonta, tunnistaminen ja antagonistinen mekanismi tupakan mustavarsipatogeenia vastaan. Journal of Southern Agriculture, 2023, 54(8): 2245–2256. (kiinaksi)

Hu Chunhui, Xu Qing, Sun Xuan ym.Useiden tyypillisten biologisten näytteiden valmistusmenetelmät pyyhkäisyelektronimikroskooppia varten. Hubein maataloustieteet, 2016, 55(20): 5389–5392+5402. (kiinaksi)