Tutkimus Acteosidin (aktiivinen aineosa Cistanche Deserticola) vaikutuksesta NAFLD: llä indusoimalla autofagia

Abstrakti:

 

Tavoite:Tutkitaan aktiivisen acteosidin (ACT) autofágiaa indusoivan toiminnan Cistanche Deserticolassa ja sen vaikutuksen alkoholittomiin rasvamaksasairauksiin (NAFLD).

MenetelmätEchinacosidin ottamiseksi ja tutkimusobjekteina toimimaan 1 0 0 μmol/L-teko ja echinacosid (ECH) yhdistettiin autofagia-lysosomin estäjällä bleomysiini A1: n kanssa interventiohoitoon. Proteiinin immunoblotting käytettiin havaitsemaan autofagian markkeriproteiinimikrotubulusten suhteellinen ekspressiotaso, joka liittyy proteiiniin 1 kevyessä ketjussa 3 (LC 3- II). HepG2 -solut puuttuivat erilaisiin ACT -pitoisuuksiin in vitro, ja solujen elinkyky havaittiin käyttämällä Tetratsoliumsuolan menetelmää. HepG2 -solujen interventiot. Erilaiset ACT -pitoisuudet yhdistettynä balofloksasiini A1: llä ja LC: n 3- II -proteiinin ilmentymistasojen havaitseminen käyttämällä proteiini -immunoblotting -tekniikkaa. Lipidipisaroiden värjäytymiseen käytettiin NAFLD -mallia, joka oli rakennettu in vitro lääkeainekannalla, käyttämällä öljynpunaista O -värjäysmenetelmää ja havaitsemaan solunsisäiset triglyseriditasot. Tarkkaile LC3 -proteiinin ja lipidipisaroiden lokalisointia immunofluoresenssitekniikan kautta. Tuloslaki voi merkittävästi indusoida autofagiaa HepG2 -soluissa, ja LC: n 3- ii -proteiinin ekspressiotaso on merkittävästi verrattuna kontrolliryhmään (käsitelty pelkästään ACT: llä) (1.36 ± 0. 11, 0. 28 ± 0. vastaavasti), tilastollisella merkitsevyydellä (P0.05). 50 μmol/L toimii merkittävästi Autofágiaan HepG2 -soluissa, ja LC: n 3- II proteiinin ekspressiotaso nousi merkittävästi (vastaavasti 1,83 ± 0,53, 0,35 ± 0,18). HepG2 -solujen TG -taso ACT -interventioryhmässä (19,11 ± 1,68) oli merkitsevästi alhaisempi kuin NAFLD: ssä in vitro -solumalliryhmässä (34,15 ± 1,90) ja erot olivat tilastollisesti merkitseviä (P<0.05). The number of positive lipid droplets in HepG2 cells in the ACT intervention group decreased significantly, and the number of autophagosomes inside the cells increased significantly, showing clear co localization with lipid droplets in space. Conclusion Cistanche deserticola ACT has significant autophagy induction ability, and it may have potential preventive and therapeutic effects on NAFLD.

 

Avainsanat:Alkoholittomat rasvamaksatauti;Cistanche Deserticola;Acteoside; Autofagia

 

TCM-yrtti Cistanche alkoholittoman rasvamaksataudin (NAFLD) hoitoon (NAFLD)

Napsauta kuvaa saadaksesi lisätietoja

 

Viime vuosikymmeninä alkoholittomat rasvaisetmaksasairaus(NAFLD) on tullut yleisinkrooninen maksasairaus, globaalin esiintyvyyden ollessa noin 25% aikuisväestöstä, ja sen katsotaan olevan läheisessä yhteydessä metaboliseen oireyhtymään [1]. Vaikka maksaan liittyvien komplikaatioiden todennäköisyys NAFLD-potilailla on alle 10%, NAFLD on maksaan liittyvien sairauksien, kuten maksakirroosin ja primaarisen maksasyövän, riskitekijä, joka asettaa potilaille valtavan taloudellisen taakan [2-5]. Huolimatta NAFLD: lle kiinnitetystä kasvavasta huomiosta NAFLD: n tärkeä krooninen sairaus ei ole saanut riittävää huomiota. Siksi NAFLD: n patogeneesin ja tehokkaiden hoitostrategioiden haku on tullut kiireellisiä ongelmia ratkaistavana [6-7].

Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että solujen autofagialla on tärkeä rooli maksan fysiologiassa ja patologiassa [8]. Autofágian toimintahäiriöt tai häiriöt liittyvät moniin maksasairauksiin, kutenalkoholiin liittyvä maksasairaus[9], NAFLD [10], alkoholittomaton steatohepatiitti [11] ja hepatosellulaarinen karsinooma [12]. NAFLD: n patologiset ominaisuudet ovat triglyseridien (TG) ja muiden neutraalien lipidipisaroiden (LD) liiallinen laskeuma hepatosyytteissä alkoholittoman stimulaation alla. Maksan kohdalla kaksi pääreittiä, jotka säätelevät näiden LD: ien katabolismia, ovat lipolyysi ja autofagia.
Lipolyysireittiä säätelevät sytoplasmisilla neutraaleilla lipaaseilla, kuten hormoniherkällä lipaasilla ja rasva-TG-lipaasilla. Vastaavassa lipoautofagiareitissä LD: t voidaan valikoivasti ottaa käyttöön rekrytoimalla suoraan autofagiaan liittyviä proteiineja autofagosomien muodostamiseksi, ja sitten autofagosomien kapseloidut LD: t toimitetaan edelleen lysosomeihin ja happaman lipaasin hajoamiseksi lysosomeissa. Siksi lipoutofagian aktivoinnista maksasoluissa on tullut tehokas strategia NAFLD: n ehkäisyyn ja hoitoon.
Cistanche Deserticola on arvokas kiinalainen yrttilääke, jota on käytetty laajasti kliinisessä käytännössä perinteisissä kiinalaisten lääketieteen kaavoissa. Samaan aikaan sitä on pitkään käytetty terveysruoka -lisäyksenä. Cistanche Deserticola sisältää erilaisia ​​bioaktiivisia ainesosia, joista tärkein on Cistanche Deserticola -fenyylietanoliglykosidit. Fenyylietanoidien glykosidien edustajina echinacosidilla (ECH) ja verbascosidilla (ACT) on ilmoitettu olevan monia tärkeitä biologisia aktiivisuuksia, kuten antioksidantti-, neuroprotektiivisia, immunomoduloivia ja maksan suojaa [13]. Maksan suojelun kannalta tutkimuksissa on havaittu, että ECH voi suojata maksaa vähentämällä tulehduksellisia välittäjiä estämällä transformoiva kasvutekijä- vähentämällä maksafibroosiin liittyvien geenien ekspressiotasoa. ACT: llä on merkittävä suojavaikutus kemiallisten ja lääkkeiden aiheuttamiin maksavaurioihin, kuten alkoholiin, hiilitetrakloridiin ja lipopolysakkaridiin. ACT vähentää myrkyllisten kemikaalien aiheuttamaa hapettumisstressiä, poistaa maksaan kertyneen reaktiivisen hapen ja vähentää malondialdehydipitoisuutta. Samanaikaisesti se lisää merkittävästi maksan superoksididismutaasiaktiivisuutta ja vähentää glutationipitoisuutta ja parantaa merkittävästi maksan histopatologisia vaurioita ja apoptoosia. Ei kuitenkaan ole merkityksellistä kirjallisuusraporttia siitä, osallistuvatko Cistanche Deserticolan fenyylietanoidiset glykosidit autofagian prosessissa maksan suojaamisessa. Tämän perusteella tässä tutkimuksessa käytettiin tavanomaisia ​​solubiologiamenetelmiä ja in vitro -solimallia, jolla tutkittiin alustavasti Cistanche Deserticola -fenyylietanoidien glykosidien autofágiaa aiheuttavaa vaikutusta ja tutkittiin sen mahdollisia farmakologisia toimintoja, joiden tarkoituksena on tarjota tieteellinen perusta tulevaisuuden lääkekehitykseen.

 

1 Materiaalit ja menetelmät

1.1 Materiaalit

1.1.1 Tutkimusaiheet ECH: ta ja ACT: tä käytettiin tutkimushenkilöinä.

1.1.2 Materiaalit Hepg2 -solut ostettiin Wuhan Punosai Life Science Co., Ltd., ECH (eräluku: B21209) ja ACT (erä numero: B20715, HPLC -puhtaus, joka on suurempi tai yhtä suuri kuin 98%), ostettiin Shanghai Yuanye -biologisesta yrityksestä, DMEM High Glucose -väliaineesta (Batch Number: Batch 30243.01), Phosfate, Phosfate, ja Trypsin -luvulla ja TrypSin -luvulla ja Tryper, Phosfate, ja TrypSin -luvussa, Phosfate, Phosfate, Trypsin (Batthai Yuye). Ostettiin Hyclone Company, USA, Siki -naudan seerumilta (eränumero: 04-002-1 a) ostettiin BI -yritykseltä, Israelilta, penisilliiniltä/streptomysiiniltä (eränumero: SV30010.01), ostettiin Hyclone Company -yritykseltä, USA: sta, MEIJ -yritys: M8180) jauhe, Soleba, BEIJ, TG. (Eränumero: BC0625) Tunnistussarja ostettiin Solebao Company, Peking, Kiina, Oil Red O (eränumero: O 0625-100 g), dimetyylisulfoksidi (eränumero: BCBZ1685) ostettiin Sigma-Aldrichilta, USA; Autofágia-lysosomin estäjä bafilomysiini A1 (BAFA1, eränumero: TLRL-BAF1) ostettiin Invitrogeniltä, ​​USA; Autofágian aktivaattori rapamysiini (eränumero: S17098) ostettiin Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., Kiina; Mikrotubuluksiin liittyvä proteiini 1 kevyt ketju 3 (LC3, eränumero: L7543, lajit: kani, laimennussuhde: 1: 1 000) ja -Actin (eränumero: Zrb1312, lajit: kani, laimennussuhde: 1: 5 000) ANTIIDESTI OSTETTU SIGMA-ALDRICH, USA; Pyhärajoja peroksidaasileimattu toissijainen vasta-aine (eränumero: 4010-05, lajit: vuohen anti-kani, laimennussuhde: 1: {1 000) ostettiin Southern Biotech, USA: n yritykseltä, Alexa Fluoren fluoresoitua leimattu toissijainen vasta-aine: 1: 1: 1: 1: 1: 1 000) Sigma-Aldrich Company, USA ja Bodipy 493/501 (eränumero: D3922) ostettiin Invitrogen Company, USA.

 

1.2 Menetelmät

1.2.1 Soluviljelmä

HepG2 -soluja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa kotkan korkeassa glukoosiväliaineessa, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia, 100 U/ml penisilliiniä ja 100 ug/ml streptomysiiniä 37 asteessa, 5% hiilidioksidi -inkubaattorissa. Kun solukonfluenssi saavutti 85%, suoritettiin subkulttuuri, pinnoitus, interventio ja muut toiminnot.

 

1.2.2 Proteiinin immunoblotting -havaitseminen

1.2.2.1 ACT- ja ECH -hoito

LC 3- ⅱ Proteiiniekspressiotaso HepG2 -soluissa BAFA1, protonipumpun estäjänä voi aiheuttaa LC 3- ⅱ -proteiinia aggregoitumaan suurina määrinä soluissa, mikä lisää autofagian induktiokykyä. Siksi BAFA1: n yhdistettyä käyttöä voidaan käyttää autofagian seurantajärjestelmänä autofagian induktiokyvyn arvioimiseksi. Logaritmisessa kasvuvaiheessa tapahtuva HepG2 -solut siirrettiin 3,5 cm: n soluviljelyastiaan yön yli viljelmään. 100 μmol/L -tekoa, ECH: ta ja BAFA1: tä käytettiin interventioon 12 tuntia. Solut pestiin esjäähdytetyllä fosfaattipuskuriliuoksella (PBS) ja hajotettiin välittömästi RIPA-proteiinin hajotuspuskuriin 10 minuutin ajan. Supernatantti sentrifugoitiin ja kokonaisproteiinipitoisuus määritettiin käyttämällä bicinchoniniinihappoproteiinikonsentraatiomäärityspakkausta. Sen jälkeen kun kvantifiointi natriumdodekyylisulfaattipuskurilla kuumennettiin 95 asteessa 10 minuutin ajan proteiinin denaturoimiseksi. Sitten 30 μl näytettä otettiin mikropipetillä ja elektroforeesoitiin polyakryyliamidigeelillä.
Elektroforeesin jälkeen proteiini siirrettiin geelistä nitroselluloosakalvoon, joka oli tukkeutunut 1 0% maitolla yön yli, inkuboitiin tietyn primaarisen vasta -aineen kanssa huoneenlämpötilassa 1 tunnin ajan, pestiin fosfaattipuskurilla, joka sisälsi 0,5% Tritonia, ja inkuboitiin spesifisen sekundaarisen vasta -aineiden lämpötilan kanssa 1 h. ECL -menetelmää käytettiin värin kehitykseen. Ne asetettiin tyhjäksi kontrolliryhmäksi, rapamysiiniryhmäksi, ECH -ryhmäksi, ACT -ryhmäksi, rapamysiini+BAFA1 -ryhmäksi, ECH+BAFA1 -ryhmä ja ACT+BAFA1 -ryhmä.

 

1.2.2.2 Erilaiset ACT -pitoisuudet puuttuivat LC 3- ⅱ -proteiinin ekspressiotasoon HepG2 -soluissa

Logaritmisten kasvuvaiheen HepG2 -solut siirrettiin 3,5 cm: n soluviljelyastiaan yön yli viljelmään, ja 25, 50 ja 100 μmol/L -toimintaa yhdistettynä BAFA1: n kanssa käytettiin interventiohoitoon 12 tunnin ajan, ja LC: n 3- ⅱ -proteiinin ekspressiotaso havaittiin proteiini -immunoblottingilla. Kontrolliryhmä (CON -ryhmä, tyhjä kontrolli), nälkäryhmä (STA -ryhmä, nälkäkäsittely HepG2 -solut), 25, 50 ja 100 μmol/L ACT -ryhmä ja BAFA1 yhdistettynä 25, 50 ja 100 μmol/L ACT -ryhmään.

1.2.3 MTT -menetelmä HepG2 -solujen eloonjäämisnopeuden havaitsemiseksi, jotka on käsitelty erilaisilla ACT -pitoisuuksilla 24 ja 48 tuntia
Logaritmisessa kasvuvaiheessa oleva HepG2 -solut ympättiin 96- kaivolevyllä kohtalaisella inokulaatiotiheydellä ja viljeltiin inkubaattorissa 12 tunnin ajan. 2 0, 40, 60, 80 ja 100 μmol/L -teko lisättiin 24 ja 48 tuntia. 0,5 mg/ml MTT -liuosta lisättiin pimeään ympäristöön ja inkuboitiin inkubaattorissa. 4 tunnin kuluttua supernatantti hylättiin, jokaiseen kaivoon lisättiin 100 μl dimetyylisulfoksidia ja solut ravistettiin vakiona lämpötilan ravistelijassa 37 asteessa 10 minuutin ajan. Optisen tiheyden (OD) arvo 490 nm: n aallonpituudella havaittiin entsyymimarkkerilla ja solujen eloonjäämisnopeus laskettiin.

 

1.2.4 NAFLD -solumallin in vitro rakenne

Tietty palmitiinihapon (PA) paino punnittiin ja liuennettiin täysin tiettyyn isopropanolin määrään 100 mmol/l PA -varastoliuos, joka sitten jaettiin ja tallennettiin -20 asteen jääkaapissa myöhempää käyttöä varten. PA-varastoliuos laimennettiin 100 μmol/L: ksi käyttämällä täydellistä viljelyalustaa ja lisättiin 1% rasvahappotonta naudan seerumialbumiinia. Soluja inkuboitiin 37 asteessa 3 tunnin ajan induktioliuoksen valmistamiseksi. Logaritmisessa kasvuvaiheessa oleva HepG2 -solut siirrettiin 3,5 cm: n soluviljelyastiaan sopivalla tiheydellä yön yli viljelmään, ja sitten valmistettua induktioliuosta käytettiin interventioon.

 

1.2.5 Toimi interventio NAFLD in vitro -solimalli TG -havaitseminen ja öljynpunainen O -värjäys

 

1.2.5.1 TG -havaitseminen

Logaritmisessa kasvuvaiheessa oleva HepG2 -solut siirrettiin 3,5 cm: n soluviljelmälautaseen viljelmälle tyhjän kontrolliryhmän, malliryhmän ja ACT -interventioryhmän mukaan. Malliryhmä indusoitiin 100 μmol/L PA -induktioliuoksella, ja ACT -interventioryhmä indusoitiin 100 μmol/L PA -induktioliuoksella ja 50 μmol/L -ACT: llä lisättiin samanaikaisesti. Interventioaika oli 24 tuntia. Poista vanha viljelyväliaine varovasti, pese solun pinta hitaasti esjäähdytetyllä PBS: llä kerran, lisää 100 μl/esjäytetyn RIPA-hajotusliuosta, joka on täysin lierossa jäällä 15 minuutin ajan, sentrifugi 4 asteessa ja {12 000 r/min 10 minuutin ajan, kerää supernatantti, ota 10 μL: n TG-tasoa varten, ota huomioon 10 μl: n pitoisuus TG: n pitoisuuksien TG: n säilyttäminen TG: n säilyttämiselle. TG Kit -ohjeet ja korjaa lopulta TG -taso proteiinia kohti.

1.2.5.2 Öljypunainen O -värjäys

Logaritmisessa kasvuvaiheessa tapahtuva HepG2 -solut siirrettiin 3,5 cm: n viljelyastiaan, joka oli peitetty steriilillä peite- ja yön yli viljelmässä. 100 μmol/L PA indusoi solut muodostamaan lipidipisaroita. Samanaikaisesti 50 μmol/L -tekoa lisättiin interventioon 24 tunnin ajan.
Soluluojat kerättiin, pestiin kolme kertaa esjäähdytetyllä PBS: llä, kiinnitettiin 4-prosenttisella formaldehydillä huoneenlämpötilassa 10 minuutin ajan, pestiin solun pinnan PBS: llä, lisäsi valmistetun öljyn punaisen O-värjäysliuoksen, värjättiin huoneenlämpötilassa pimeässä 15 minuutin ajan, Öljyn punainen O-värjäysliuos pestiin ylimääräisen värjäysliuoksen kaksinkertaisella distrattulla vedellä ja 60-prosenttisella vedellä, joka on 60-prosenttinen vedellä, joka on 60-prosenttisesti. sinetöity ja kuvattu mikroskoopin alla.

 

1.2.6 Autofagosomien ja lipidipisaroiden immunofluoresenssin havainto ACT -hoidon jälkeen

Logaritmisessa kasvuvaiheessa tapahtuva HepG2 -solut siirrettiin 3,5 cm: n viljelyastiaan, joka oli peitetty steriilillä peite- ja yön yli viljelmässä. 1 0 0 μmol/L PA: ta käytettiin lipidipisaroiden muodostumisen indusoimiseksi soluissa. Samanaikaisesti lisättiin interventiohoitoa varten 24 tunnin ajan. Soluluolat kerättiin, pestiin 3 kertaa esjäähdytetyllä PBS: llä, kiinnitettiin huoneenlämpötilaan 10 minuutin ajan 4% formaldehydillä, permeabilisoitiin huoneenlämpötilassa 15 minuutin ajan permeabilisointipuskurilla, joka sisälsi 0,1% saponiinia, tukkeutui huoneenlämpötilassa 1 tunnin ajan, joka on varustettu yhden HBS: llä ja 1 HBS: llä, PBS: llä, {14}}}} -sivulla. Lisätty erityisellä fluoresoivalla leimattulla sekundaarisella vasta-aineella, inkuboitu huoneenlämpötilassa ja pois valosta 1 tunnin ajan. Vasta-aineen inkubaation jälkeen levyt pestiin kolme kertaa PBS: llä, vastapäätä lipidipisarpisarin spesifisellä koettimella Bodypy 493/503 huoneenlämpötilassa 10 minuutin ajan, pestiin PBS: llä ja suljettiin hävittämisen vastaisella tiivistysväliaineella, kuivattuna pimeässä, havaittiin laserkonfokaalisella mikroskoopilla ja tallennettuna. Tyhjä kontrolliryhmä, rapamysiinihoitosryhmä ja ACT -interventioryhmä asetettiin.

 

1.3 Tilastollinen analyysi

SPSS25. 0 tilastollista ohjelmistoa käytettiin tietoanalyysiin. Kvantitatiiviset tiedot ilmaistiin x ± s. Käytettiin yksisuuntaista varianssianalyysiä ja LSD-T-testiä. P<0.05 was considered statistically significant.