SLC37A2, fosforiin liittyvä molekyyli, joka lisää sileälihassoluja kalkkeutuneessa aormassa

Verisuonten kalkkiutuminenon tärkeä lähdesydän-ja verisuonitautipotilailla, joilla on krooninen munuaissairaus.Hyperfosfatemiajohtaa lisääntyneeseen solunsisäiseen fosforin sisäänvirtaukseen, mikä johtaa osteoblastien kaltaisten solujen lisääntymiseen verisuonten sileissä lihassoluissa. PiT-1 kuljettaa fosfaattia verisuonten sileissä lihassoluissa. Verisuonten kalkkeutumisen mekanismia ei kuitenkaan täysin ymmärretä. Tässä tutkimuksessa tutkittiin muita mahdollisia fosforiin liittyviä molekyylejä kuin PiT-1. Oletimme, että fosforiin liittyvät molekyylit kuuluvatliuenneen aineen kantaja(SLC) superperhe osallistuisi verisuonten kalkkeutumiseen. DNA-mikrosiruanalyysin tuloksena keskityimme SLC37A2:een ja osoitimme, että näiden solujen mRNA-ilmentyminen lisääntyi kalkkeutuneissa aortan sileissä lihassoluissa (AoSMC). SLC37A2:n on raportoitu kuljettavan sekä glukoosi-6-fosfaatti/fosfaatti että fosfaatti/fosfaatti-vaihtoa. In vitro -analyysi osoitti, että AoSMC:n tulehdus ei vaikuttanut SLC37A2-ekspressioon. SLC37A2-mRNA:n ja proteiinin ilmentyminen lisääntyi kalkkeutuneessa AoSMC:ssä. In vivo -analyysi osoitti, että SLC37A2-mRNA:n ilmentyminen aortassakrooninen munuaissairausrotilla korreloi osteogeenisten markkerigeenien kanssa. Lisäksi SLC37A2 ekspressoitui verisuonten kalkkeutumisalueellakrooninen munuaissairaus rotat. Tämän seurauksena osoitimme, että SLC37A2 on yksi molekyyleistä, jotka lisääntyvätverisuonten kalkkiutuminenin vitro ja in vivo.

Avainsanat: SLC37A2,verisuonten kalkkiutuminen, aortan sileät lihassolut,krooninen munuaissairaus, hyperfosfatemia

NAPSAUTA TÄSTÄ SAADAksesi LUONNOLLISTA ORGAANIISTA KISTANKSIUUTEtta, JOKA SISÄLTÄ 25 % KINAKOOSIDEA JA 9 % AKTEOSIDIA MUUNAISTEN TOIMINTAAN

Wecistanchen tukipalvelu - Kiinan suurin vesisäiliön viejä:

Sähköposti:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Puhelin:+86 15292862950

Osta lisätietoja teknisistä tiedoista:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

Kuten potilaiden määräkrooninen munuaissairaus(CKD) lisääntyy, potilaiden määrädialyysihoitoa vaativatulee myös lisääntymään. Suurin osa kuolemista potilailladialyysijohtuvatsydän-ja verisuonitauditkutensydämen vajaatoiminta, aivoverenkiertohäiriöttai sydäninfarkti. (,2) Suurin lähdesydän-ja verisuonitaution kohdunulkoinen kalkkeutuminen,() poikkeavuus, jonka aiheuttaa kalsiumfosfaattikiteiden muodostuminen ja kerrostuminen pehmytkudoksiin. (4 6) Useat tekijät, kuten tulehdus. Oksidatiivinen stressi ja plasman kalsium- (Ca) ja fosfori (P) pitoisuuksien nousu ovat osallisia verisuonten kalkkeutumisen etenemiseen. Näistä tekijöistä hyperfosfatemia liittyy voimakkaimmin verisuonten kalkkeutumiseen. (7.8) Hyperfosfatemia johtuu P:n liiallisesta saannista, kun munuaisten toiminta on heikentynyt. Siksi dialyysipotilaiden on rajoitettava P:n saantia. (79-12) On kuitenkin raportoitu, ettäverisuonten kalkkiutuminenetenee jo, kun dialyysi aloitetaan; sitä on havaittu myös potilailla, joilla on varhaisen vaiheen krooninen munuaistauti, kun hyperfosfatemia ei ole ilmeinen. (3) Näin ollen on tärkeää estää verisuonten kalkkeutumista potilailla, joilla on varhaisen vaiheen krooninen munuaistauti, jotta voidaan parantaa elämän ennustetta.

mikä johtaa P:n lisääntyneeseen virtaukseen verisuonten sileisiin lihassoluihin (VSMC). P-virtaus tapahtuu PiT{0}}:n kautta, joka on VSMC:n solukalvon pinnalla oleva kuljettaja. PiT- on solute-carrier (SLC) -superperheen jäsen, johon kuuluu SLC20A1.04:n koodaama natriumfosfaattikuljettaja. PiT- kuljettaa fosfaattia Na-riippuvaisten solukalvojen läpi ja sen jälkeen matriisin mineralisaatiota kohonneiden p-tasojen vuoksi. P-tasot nousevat, VSMC alkaa ilmentää osteogeenisiä transkriptiotekijöitä, kuten runtiin liittyvää transkriptiotekijää 2(Runx2)(16) Tätä vaikutusta seuraa osteoblastispesifisten geenien, kuten osteopontiinin ja osteokalsiinin, lisääntynyt ilmentyminen. Lisäksi vähensi sileän lihaksen spesifisten proteiinien ilmentymistä. kuten sileän lihaksen proteiini 22-0 (SM22-0), esiintyy. Tämän seurauksena VSMC transformoituu osteoblastin kaltaisiksi soluiksi. (1718) Viimeaikaiset kliiniset tutkimukset ovat osoittaneet, että veren kalsiumtasot. proteiinipartikkelit (CPP), jotka edustavat kalsiumfosfaattikolloidisia hiukkasia, lisääntyvät munuaisten toiminnan heikkenemisen myötä. (19-21)Lisäksi on raportoitu korrelaatioita veren CPP- ja P-tasojen kanssa.2o2i) On mahdollista, että CpP voi laukaista verisuonten kalkkeutumisen.22-24)

Verisuonten kalkkeutumista on kuitenkin havaittu potilailla, joilla on varhaisen vaiheen krooninen munuaistauti ja joilla on normaalit plasman P-tasot. (13) Lisäksi.PiT-1 mRNA ilmentyy kaikkialla kaikissa kudoksissa. Siten toinen molekyyli voi toimia ensisijaisesti verisuonten kalkkeutumisen alueella. Siitä on raporttejatulehdusedistää verisuonten kalkkeutumista. Tulehdustekijät, kuten interleukiini (IL)-1B, IL-6 ja tuumorinekroositekijä-alfa (TNF-a) aiheuttivat VSMC:n erilaistumisen osteoblastin kaltaisiksi soluiksi (2s26) TNF-a indusoi verisuonten kalkkeutumista cAMP-reitin kautta, jolla on rooli osteoblastien erilaistumisessa.2728) IL-6 säätelee erilaisia ​​reittejä, jotka johtavat VSMC:n verisuonten kalkkeutumiseen2-31) Lisäksi. IllB, IL-6 ja TNF-a ovat myös tekijöitä, jotka liittyvät korkean p-tasojen aiheuttamaan lisääntyneeseen verisuonten kalkkeutumiseen.3233) Kuitenkin. Nykyiset tiedot eivät täysin selitä verisuonten mekanismia

näiden tekijöiden aiheuttamaa kalkkeutumista. Oletimme, että saattaa olla muita P-sukuisia molekyylejä, kuten SLC-superperheeseen kuuluvia, jotka osallistuvat verisuonten kalkkeutumiseen. Keskityimme SLC-superperheen kalvoproteiineihin ja tutkimme muita mahdollisia ehdokas-P-sukuisia molekyylejä kuin PiT-1 verisuonten kalkkeutumiseen. Lisäksi tutkimme ehdokasmolekyylien ja verisuonten kalkkeutumisen välistä suhdetta videossa ja in vivo.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely. Normaalit humanaortan sileälihassolut (AoSMC) saatiin Lonzasta (Basel, Sveitsi). AoSMC:tä viljeltiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. AoSMC:tä ylläpidettiin kasvualustassa (sileälihassolujen peruselatusaine, jota oli täydennetty 5 %:lla naudan sikiön seerumia (FBS), epidermaalista kasvutekijää, insuliinia, fibroblastien kasvutekijä-B:tä ja gentamysiini/amfoterisiini-B:tä). Media vaihtui joka toinen päivä. AoSMC:tä kasvatettiin kostutetussa 5 % CO:n inkubaattorissa 37 asteessa ja pidettiin, kunnes saavutettiin konfluenssi, ja käytettiin sitten kokeissa.

Kalkkiutunut AoSMC. AoSMC:n kalkkiutuminen indusoitiin aiemmin kuvatulla tavalla.435) AOSMC:itä viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen alustassa, johon oli lisätty 15 % FBS:ää ja penisilliini-streptomysiiniä, ja viljeltiin 2,6 mM P:llä 3, 6, 9, 14 päivää ja 12 päivää. P-konsentraatio säädettiin P-puskurilla NaH, PO/Na ja HPO. pH 7,2). Muita AoSMC:itä ei viljelty 2,6 mM P:llä.

DNA-mikrosiru. Käytettiin AoSMC-näytteiden kokonais-RNA:ta, joita oli viljelty ja joita ei viljelty 2,6 mM P:llä. Kokonais-RNA 5.0 ug analysoitiin käyttämällä DNA-mikrosirua (Agilent Technologies, Tokio, Japani). SurePrint G3 Human GE 8 x 60k ver. 2 Microarraya käytettiin noin 26,000 geenin tutkimiseen. Suhde laskettiin jakamalla 12 päivän ajan 2,6 mM:lla viljellyn AoSMC:n ilmentymistaso 2,6 mM P:llä viljelemättömän AoSMC:n ilmentymistasolla

DNA-mikrosiru

Käytettiin AoSMC-näytteiden kokonais-RNA:ta, joita oli viljelty ja joita ei viljelty 2,6 mM P:llä. Kokonais-RNA 5.0 ug analysoitiin käyttämällä DNA-mikrosirua (Agilent Technologies, Tokio, Japani). SurePrint G3 Human GE 8 x 60k ver. 2 Microarraya käytettiin noin 26,000 geenin tutkimiseen. Suhde laskettiin jakamalla 12 päivän ajan 2,6 mM:lla viljellyn AoSMC:n ilmentymistaso AoSMC:n ilmentymistasolla, jota ei viljelty 2,6 mM P:llä. SLC37A2:n ekspressio verisuonitulehduksessa. Tulehdusvasteen indusoimiseksi AoSMC:ssä soluja viljeltiin kasvualustalla, kunnes ne saavuttivat konfluenssin, ja sitten niitä käsiteltiin 1 ugmL:lla lipopolysakkarideja (LPS) (LPS Escherichia coli O111:B4:stä; Sigma, St. Louis, MO) 24 ja 72 ilman 2,6 mM P. Muita AoSMC:itä ei viljelty reaaliaikaisella polymeraasiketjureaktio (PCR) -analyysillä. Kokonais-RNA uutettiin AoSMC:stä, jota oli käsitelty LPS:llä 24 ja 72 tuntia, ja soluista, joita ei käsitelty LPS:llä. SYBR green-pohjainen kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttämällä syntetisoitua cDNA:ta ja sopivaa alukesarjaa kullekin kohdegeenille aStepOnePlus-reaaliaikaisella PCR-järjestelmällä (Applied Biosystems, FosterCity, CA). Alukesekvenssit olivat seuraavat: ihmisen IL-6.5-AATTCGGTACATCCTCGACGG-3' ja 5-GCCATCTTTGGAAGGTTCAGG-3'; ihmisen SLC37A2,5TCACTTTAGTGCCAAGGAGGC-3' ja 5CCATTGGTGTAGTCAGAGACG-3'; glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH5'-CTGCACCACCAACTGCTTAGC- ja 5-CTTCTGGGIGGCAGTGATGGC-3}.IL-6 ja SLC37A2 mRNA:n ilmentymistasot laskettiin normalisoinnin jälkeen SLCcal3:n PD2AGA:lla ilmentymisen jälkeen. AoSMC. Total uutettiin AoSMC:stä, jota ei viljelty 2,6 mM P:llä, ja AoSMC-solut, joita oli viljelty 2,6 mM P:llä 3, 6, 9, 12 ja 14 päivää. Reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttämällä syntetisoitua cDNA:ta. Alukesekvenssit olivat seuraavat: ihmisen Runx2, 5-TGAGAGCCGCTTCTCCAACCC-3' ja 5-CTCTGGCTTTGGGAAGAGCCG-3 Runx2- ja SLC37A2-mRNA-ilmentymistasot laskettiin normalisoinnin jälkeen APPH:lla.

Western blot -analyysi.

Kokonaisproteiini kerättiin AoSMC-näytteistä, joita viljeltiin samoissa olosuhteissa, joita käytettiin reaaliaikaiseen PCR-analyysiin. Nämä näytteet hajotettiin käyttämällä Tris-puskuroitua suolaliuosta (pH 75), jota oli täydennetty 5 % NP-40:lla ja 1 % proteaasi-inhibiittorilla. Proteiinikonsentraationäytteet mitattiin käyttämällä BCA Protein Assay Kit -sarjaa (Thermo FisherScientific. Waltham, MA). ja konsentraatio säädettiin Western blot -menetelmällä, 10 ug proteiinia erotettiin 10-prosenttisessa polyakryyliamidigeelissä käyttämällä natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesia. Kalvo käsiteltiin SLC37A2-vasta-aineella (Novus Biologicals, Centennial, CO) tai GAPDH-vasta-aineella (GeneTex, Irvine, CA) ensisijaisena vasta-aineena, inkuboitiin Rabbit lgG piparjuuriperoksidaasilla konjugoidulla vasta-aineella (R&D Systems, Minneapolis, MN) sekundaarisena vasta-aineena. ja visualisoidaan Amersham ECL Selectillä (GE Healthcare. Buckinghamshire, Englanti) ja luminesenssikuvaanalysaattorilla (LAS-1000 plus, FUNIFILM, Tokio, Japani). Bändi kvantifioitiin käyttämällä lmagelia.

Kokeellinen

Hyogon yliopiston Human Science and Environment Schoolin eettinen komitea hyväksyi kaikki tutkimusprotokollat. Kahdentoista viikon ikäiset urospuoliset Sprague-Dawley-rotat ostettiin Japan SLC:ltä (Shizuoka, Japani). Rottia pidettiin 12-vaalealla, 12-h pimeällä syklillä (09:00-21:00), ja niillä annettiin vapaa pääsy ruokaan ja erittäin puhtaaseen veteen.

Kokeellisiin ruokavalioihin kuuluu kontrolli P-ruokavalio (1.0% P, 0.6Ca, 20% proteiinia), adeniiniruokavalio (0.75% adeniinia) , 1.0% P, 0,6%Ca, 2,5% proteiinia), vähärasvainen (LP) ruokavalio (0.2% P,0 .6 % Ca, 10 % proteiinia) ja korkean P (HP) ruokavalio (1,0 % P, 0,6 % Ca, 10 % proteiinia), joka perustuu AIN93-G-ruokavalioon (itämainen Hiiva, Tokio, Japani), jossa kaseiini proteiinin lähteenä.3637) Vähäproteiinisen ruokavalion on raportoitu edistävän verisuonten kalkkeutumista rotilla, joilla on adeniinin aiheuttama munuaisten vajaatoiminta, joten proteiinirajoitus suoritettiin.3738) Ennen ryhmittelyä kaikki rotat (n)=23) ruokittiin normaalilla MF-ruokavaliolla (itämainen hiiva) viikon ajan sopeutuakseen. Rotat jaettiin 13 viikon ikäisinä kahteen ryhmään: kontrolliryhmään (n=5) ja adeniinin aiheuttamaan kroonisen sairauden ryhmään (n=18). Kontrolliryhmä sai kontrolli P-ruokavaliota 6 viikon ajan. . Adeniinin aiheuttama CKD-ryhmä sai adeniiniruokavalion noin 3 viikon ajan ja jaettiin sitten edelleen kahteen alaryhmään: CKD-LP-ryhmään (n=8) tai CKDHP-ryhmään (n=10). CKD-LP-ryhmän ja CKD-HP-ryhmän rotat saivat LP-ruokavaliota ja HP-ruokavaliota vastaavasti 3 viikon ajan koejakson aikana, ruoan saanti kirjattiin päivittäin. Adeniinidieetin aikana häntälaskimosta otettiin verinäytteitä kello 10:00 ja 11:00 välisenä aikana kerran viikossa toiseen viikkoon asti ja sen jälkeen joka toinen päivä plasman pitoisuuksien seuraamiseksi. LP-dieetin tai HP-dieetin aikana verinäytteitä kerättiin kerran viikossa. Virtsanäytteet kerättiin ja virtsan tilavuus kirjattiin kerran viikossa. Rotat tapettiin anestesialla käyttäen isofluraania (Wako Pure Chemical Industries. Osaka Japan) ja laparotomioita. Verinäytteet, jotka otettiin alemmasta onttolaskimosta ja thoracoabdominaalisesta aortasta, kerättiin analysointia varten.

SLC37A2:n ilmentyminen aortassa.

Noin kolmasosa kerätystä thoracoabdominaalisesta aortasta käytettiin visualisoimaan kalkkeutumista ja suorittamaan immunovärjäys. Aortta upotettiin parafiiniin ja leikattiin 4-um leikkeitä. Leikkeet värjättiin käyttämällä Von Kossa Method for Calcium Kit -sarjaa (Polysciences. Warrington, PA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. immunovärjäysanalyysi suoritettiin sarjaleikkeillä. Leikkeitä inkuboitiin SLC37A2-vasta-aineen kanssa yön yli 4 asteessa ja käsiteltiin sitten Histofine Simple Stain Rat MAX-POMULTI:lla (Nichirei Biosciences, Tokio, Japani) 30 minuuttia huoneenlämpötilassa. Sen jälkeen leikkeitä käsiteltiin DAB-substraattisarjalla (Nichirei).

Kokonais-RNA uutettiin muusta jäädytetystä thoracoabdominaalisesta aortasta. Reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttämällä syntetisoitua cDNA:ta. Alukesekvenssit olivat seuraavat: rotan osteopontiini, 5ACCCATCTCAGAAGCAGAATC-3' ja 5ATCCATGTGGTCATGGCTTTC-3' ja; rotan SLC37A2,5-TAGTCCCAGCTTCGAGTACGG-3' ja 5'-CTGATGGGCTTTCTGGACATG-3. Osteopontiinin mRNA:n ja SLC37A2:n mRNA:n ilmentymistasot laskettiin normalisoinnin jälkeen GAPDH:lla

Tilastollinen analyysi.

Tiedot esitetään keskiarvona + SE. Ryhmien väliset erot analysoitiin t-testillä. Fosfaatti-indusoiduissa kalkkeutuneissa AoSMC-kokeissa erot analysoitiin käyttämällä yksisuuntaista varianssianalyysiä, jota seurasi Dunnettin menetelmä. CKD-mallikokeissa eroja analysoitiin K ruskal-Wallis -testillä ja sen jälkeen Steel-Dwass-menetelmällä. Korrelaatiokertoimet (rs) määritettiin käyttämällä Spearmanin korrelaatiokertoimen arvotestiä. Kaikkiin testeihin. kaksisuuntaiset p-arvot<0.05 were considered statistically significant.