Virtsan solujen yksisoluinen RNA-sekvensointi paljastaa selkeän solujen monimuotoisuuden COVID-19–AKI:ssa Ⅱ

Tulokset

Suoritimme scRNAseq-tutkimuksen virtsasedimentille kahdeksalta sairaalassa olleelta potilaaltaCOVID-19, viisi kanssaAKIja kolme ilman AKI:ta. Neljä muuta virtsanäytettä osoitteestasairaalahoidossa olevat potilaat, joilla ei ole COVIDia-19ja AKI:n kanssa kerättiin myös AKI:n mahdollisten erojen vertaamiseksi COVID-tilanteessa{{0}}. Keskimääräinen sCr potilailla, joilla oli COVID-19:ään liittyvä AKI, oli keräyshetkellä 2,4 mg/dl, kun verrokkipotilailla se oli 0,83 mg/dl. Erityisesti kaksi potilaista, joilla onCOVID 19-liittyvätAKIollut aikaisemminCKD-diagnooseja, joka on osoitettupahentaa COVID-tuloksia-19(39,40). Liitännäissairaudet ja muut muuttujat erosivat hieman AKI- ja ei-AKI-kontrollipopulaatioiden välillä (taulukko 1).

Aiempien raporttien (29) mukaisesti solujen lukumäärä oli erittäin heterogeeninen potilaiden välillä (lisäkuva 1, A ja B). Yhteensä 65 234 solua sekvensoitiin ja 30 076 solua säilytettiin laadunvalvonnan avulla. Kaikkien 12 potilasnäytteen integroitu yhtenäinen moninkertainen approksimaatio ja projektiot paljastivat monipuolisen joukon munuais-, uroteeli- ja immuunisoluja (kuvio 1, A, E ja F). Pystyimme havaitsemaan useimmat munuaissolut, mukaan lukien podosyytit ja VCAM11-munuaissolut, mikä osoitti kyvyn tutkia munuaista ei-invasiivisesti virtsan analyysin avulla. Uroteelisolupopulaatiossa on selvää heterogeenisyyttä, mikä ei kuulu tämän tutkimuksen piiriin, mutta vaatii lisätutkimuksia. Siepatut solutyypit vaihtelivatAKI- ja ei-AKI-ryhmät(Kuva 1, B–D) sekä kunkin potilaan välillä (lisäkuva 1C). Kuten odotettiin, COVID-19:ään liittyvistä AKI-näytteistä havaittiin suurempi määrä immuunisoluja.

PERINTEINEN KIINALAINEN YRTTI MUUNAISVALMISTEENA

GSEA paljasti lisääntyneen säätelynapoptoottiset geenit, IFN-vasteelementit ja monet muut signalointireitit sekä COVID-19:ään liittyvissä että ei-COVID-19 AKI- ja ei-AKI-kontrollinäytteissä (kuva 2C, täydentävä kuva 2). Korkean energiantarpeen ja mitokondriopitoisuuden vuoksi proksimaalinen tubulus on yksi herkimmistä rakenteista loukkaukselle AKI:n aikana (41), ja vamman vakavuus liittyy kokonaistuloksiin (42). AKI-potilaiden proksimaalisten tubulussolujen reittianalyysi paljasti apoptoosiin, DNA:n korjaukseen ja soluvasteisiin liittyvien reaktiivisten happilajien ja stressin reaktioiden rikastumisen toisin kuin potilailla, joilla ei ollut AKI:ta (kuvio 2, A ja B). Samanlainen reitin noususäätely havaittiin muissa munuaisten tubulussoluissa. Vahinkoon liittyvät reitit säädeltiin voimakkaammin AKI:n taustalla, mutta reaktiivisten happilajien rikastuminen, DNA-vaurio ja apoptoottiset reitit proksimaalisissa tubuluksissa, Henlen silmukassa ja keruukanavassa olivat selvempiä COVID{8}}-asioissa. AKI verrattuna muihin kuin COVID{9}} AKI-näytteisiin. Epäilemme, että AKI:ssa on monia päällekkäisiä reittejä vauriomekanismien, mukaan lukien iskemian, tulehduksen tai lääketoksisuuden, yhdistelmän vuoksi. Vahinkoon liittyvien reittien lisärikastuminen COVID-19:ään liittyvässä AKI:ssa voi johtua muista COVID{12}}-tautiprosessissa esiintyvistä tulehdusprosesseista. Tämä saattaa selittää metaboliset erot virtsassa potilailla, joilla on COVID-19:ään liittyvä AKI (43)

Viruksen sisäänpääsyreseptori, ACE2, on runsaasti läsnä useissa kudoksissa, mukaan lukien munuaiset. ACE2- ja TMPRSS2-transkriptit havaittiin erilaisissa munuaisen epiteelisoluissa, ja niitä oli erityisen runsaasti uroteelisoluissa (kuvio 3A). Koska SARS-CoV-2 on RNA-virus, jossa on poly-A-häntä (44), loimme mukautetun genomin kohdistusta varten, jossa SARS-CoV-2-genomi lisättiin eksoniksi hg38-ihmiseen. genomi. Mielenkiintoista on, että vaikka emme havainneet SARS-CoV-2-viruksen transkriptejä munuaissoluissa AKI-potilailla, havaitsimme jälkikopioita potilaan 7 (jolla oli COVID-19 ilman AKI:ta) uroteelisoluista. ), mikä viittaa näiden virtsarakon solujen suoraan infektioon (kuvio 3A). Potilaan 7 yksilöllinen analyysi paljasti muutamia munuaisperäisiä soluja. Suurin osa eristetyistä soluista oli immuuni- ja uroteelisoluja. Viruksen RNA:ta löydettiin yksinomaan uroteelisoluista, joissa oli korkea ACE2-ekspressio (kuvio 3B, täydentävä kuva 3). Tämän potilaan virtsa-analyysi osoitti leukosyturiaa ilman merkkejä bakteeri-infektiosta (negatiivinen leukosyyttiesteraasi ja nitriitti) (kuva 3C). Uroteelisolujen reittianalyysi paljasti tyypin 1 IFN-signalointiin osallistuvien reittien rikastumisen, akuutin tulehdusvasteen ja leukosyyttivasteen (kuva 3D, täydentävä kuva 2B), mikä on yhdenmukainen näiden solujen virusinfektion kanssa.

Kuva 2.|Vaurioihin liittyvien reittien rikastaminen AKI-potilaiden soluissa. Geenijoukon rikastusanalyysi jokaisesta integroidusta UMAP:sta peräisin olevasta soluryhmästä reittien varalta, mukaan lukien (A) tunnusmerkityt reaktiivisten happilajien reitit, (B) tunnusmerkit apoptoosireitit ja (C) tunnusmerkityt DNA:n korjausreitit COVID-potilailla-19 AKI (vasemmat paneelit), COVID-19 ei AKI-säätimiä (keskipaneelit) ja potilaat, joilla on ei-COVID-19 AKI (oikea paneeli). Klusteritunnisteet ovat seuraavat: 1, uroteliaalinen; 2, uroteeli; 3, uroteeli; 4, makrofagi; 5, MHC-luokan 2 positiivinen neutrofiili; 6, Henlen silmukka; 7, neutrofiili; 8, keräyskanava; 9, uroteeli; 10, sateenvarjo; 11, neutrofiili; 12, keräyskanava; 13, munuaisissa asuva makrofagi; 14, neutrofiili; 15, uroteeli; 16, pyöräily; 17, proksimaalinen tubulus; 18, proksimaalinen tubulus; 19, sileä lihassolu; 20, interkaloitu solu; 21, uroteeli; 22, T-solu; 23, podosyytti; 24, punasolut; 25, makrofagi; 26, B-solu; 27, makrofagi; 28, punasolut.todisteita suorasta tartunnasta puuttuu. Mechasisääntulon nismi olisi uroteelin tyvipuoleltasoluja, jos verestä tai luminaalisesta puolelta, jos virtsasta.

Aikaisempi tutkimus ehdotti, että ACE2:ta ilmentyy sekä virtsarakon tyvi- että luminaalisella pinnalla (23). Viruskystiitin havaitseminen scRNAseq-menetelmällä on yhdenmukainen potilaan 7 kliinisten ominaisuuksien kanssa (kuva 3C). Vaikka virus havaittiin vain pienestä määrästä soluja, epäilemme, että suurin osa virustartunnan saaneista soluista on voitu suodattaa pois virtsan käsittelyn ja data-analyysin laadunvalvontavaiheiden aikana, joissa poistimme kuolleita ja kuolevia soluja.