Aktiinin sytoskeleton samanaikainen stabilointi useissa nefronispesifisissä soluissa suojaa munuaista erilaisilta vaurioilta

Krooniset munuaissairaudetjaakuutti munuaisvaurioovat mekaanisestierillisiä munuaissairauksia. Vaikka krooniset munuaissairaudet liittyvätpodosyyttivaurio, akuutti munuaisvauriovaikuttaa munuaisten tubulusepiteelisoluihin. Näistä eroista huolimattakardinaali ominaisuusmolemmistaakuutteja ja kroonisia munuaissairauksiaon säätelemätön aktiinin sytoskeleto. Olemme osoittaneet senGTPaasi-dynamiinin farmakologinen aktivaatioparantaa podosyyttivaurioitakroonisten munuaissairauksien hiiren mallitkirjoittajaedistää aktiinin polymeroitumista. Tässä selvitetään dynamiinin rooli jäykkyyden ja napaisuuden moduloinnissamunuaisten tubulaariset epiteelisolutsilloittamalla aktiinifilamentit haarautuneiksi verkoiksi. Dynamiinin silloituskyvyn aktivointi pienimolekyylisen agonistin toimesta stabiloi apikaalisen kalvon aktomyosiinikuoren vaurioita vastaan, mikä puolestaansäilyttää munuaisten toiminnanerilaisissa akuutin munuaisvaurion hiirimalleissa. Erityisesti dynamiiniagonisti heikentää samanaikaisesti podosyyttejä japutkimainen vammaAlportin oireyhtymän geneettisessä hiirimallissa. Tutkimuksemme tarjoaa todisteita toteutettavuudesta ja korostaauusien holististen nefronia suojaavien hoitojen edut.

NAPSAUTA TÄSTÄ TUTUSTUASI YHTEYDESSÄ, JOKA ON HYVÄ Akuuttiin munuaisvaurioon

Thetärkeimmät akuutin munuaisvaurion syyt(AKI) ovatiskemia, hypoksia, taimunuaistoksisuus1. Vaikka se voidaan kääntää, AKI edustaa merkittävää terveydenhuollon ongelmaa, jolla on korkea kuolleisuus eikä lopullista hoitoa. Etiologiastaan ​​riippumatta AKI vahingoittaa ensisijaisesti munuaistiehyiden polarisoituneita epiteelisoluja, joiden apikaaliset mikrovillit muodostavat putkimaisen harjan rajan, joka osallistuu olennaisten elektrolyytti- ja vedenkuljetusten koordinointiin2. AKI:n varhainen morfologinen piirre on harjan reunan ja solun polariteetin menetys, joka johtuu aktomyosiinikuoren hajoamisesta apikaalisessa kalvossa1.

Solujen polariteetin luomiseen ja ylläpitoon liittyy signalointikaskadeja, kalvoliikennettä ja sytoskeletaalista dynamiikkaa, jotka kaikki ovat erittäin koordinoituja3. Apikaalisen kalvon järjestäytyminen määräytyy suurelta osin aktomyosiiniverkkojen4 arkkitehtuurilla, joka muodostaa aivokuoren jäykkyyden, mikä helpottaa polaarisuusproteiinien klusteroitumista. Vaikka myosiini II -moottoreita pidetään aivokuoren jäykkyyden ensisijaisena generaattorina5,6, aktomyosiinikuoren arkkitehtuuri muodostuu lukemattomista aktiinia sitovista proteiineista (ABP)7.

Tunnettujen ABP:iden lisäksi munuaisten tubulusten harjareuna on runsaasti rikastettu dynamiinilla8, GTPaasilla, joka tunnetaan parhaiten roolistaan ​​endosytoosissa9. Dynamiinilla on luontainen taipumus kokoontua useisiin oligomeroitumistiloihin, kuten dimeereihin, tetrameereihin, renkaisiin ja spiraaleihin9. Tunnistamme ensimmäistä kertaa suorat dynamiinin ja aktiinin vuorovaikutukset10 ja osoitimme, että dynamiinin oligomeroituminen säätelee aktiinin polymeroitumista podosyyteissä11,12, erikoistuneissa soluissa, jotka ovat välttämättömiä munuaissuodattimen selektiivisyydelle. Käyttämällä CKD:n hiirimalleja olemme osoittaneet, että dynamiinista riippuvaisen aktiinin polymerisaation aktivointi kääntää podosyyttivauriot palauttamalla niiden ainutlaatuisen rakenteen ja toiminnan12.

Tässä näytämme senmunuaisten tubulaariset epiteelisolutdynamiini silloittaa filamenttisen aktiinin (F-aktiini) haarautuneiksi verkostoiksi. Dynaminin silloituskyky määritellään sen oligomeroitumistilan ja F-aktiinin pituuden perusteella. Dynamiinin oligomerisaation farmakologinen aktivaatio vastustaa AKI:tä stabiloimalla aktiiniverkostoja ja siten solun eheyttä, mikä suojaa osittain munuaisten epiteelisoluja oksidatiivisen stressin aiheuttamalta vauriolta. Tutkimuksemme tunnistaa munuaisten tubulussolun apikaalisen kalvon aktomyosiinikuoren lääkkeeksi kelpaavana kohteena AKI:ssa dynamiinin kautta välityspalvelimena

Tulokset Dynamiin-oligomerointi määrittää apikaalisen kalvon jäykkyyden ja morfologian.

Tutkiaksemme dynamiinin ja aktiinin välisten vuorovaikutusten roolia polarisoituneissa munuaisten tubulusepiteelisoluissa käytimme Bis-T-23:a, aktiinista riippuvan dynamiinin oligomerisaation allosteerista aktivaattoria uudelleenmuodostetussa järjestelmässä13, soluissa11, 13 ja koko organismi 12. Solufenotyypit arvioitiin Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) -soluissa seuraamalla F-aktiinin tilaa ja tiiviin liitosproteiinin zonula occludens-1 (ZO-1) värjäytymiskuviota, joka on pidetään solupolariteetin biomarkkerina. Sytokalasiini D (CytoD) ja latrunkuliini A (LatA), tunnetut aktiinipolymeraation estäjät, alensivat F-aktiinitasoja ja aiheuttivat epäjatkuvan ZO-1-värjäytymisen (täydentävä kuva 1a). Sitä vastoin Bis-T-23 aiheutti lievän nousun F-aktiinitasoissa ilman, että sillä oli vaikutusta ZO-1-värjäytymiseen. Bis-T-23:n lisääminen ennen LatA:ta mutta ei sen jälkeen, osittain säilynyt F-aktiinitasot ja solupolariteetti. Kumpikaan DMSO-vehikkeli tai dynamiini-inhibiittoridynoli14 eivät osoittaneet mitään vaikutusta (täydentävä kuva 1a).

Pyyhkäisyelektronimikroskoopin (SEM) avulla pystyimme visualisoimaan lääkkeiden aiheuttamia solumorfologian muutoksia keskittyen apikaaliseen kalvoon (kuva 1a). Keskimääräinen MDCK-solukorkeus oli 11 ± 2 µm ja mikrovillien keskimääräinen pituus oli 0,63 ± 0,2 µm (taulukko 1), mikä on munuaisissa havaitun alueen sisällä15. LatA vähensi solun korkeutta ja mikrovillien pituutta ja siirsi tasaisesti jakautuneet mikrovillit klustereiksi, kun taas Bis-T-23 aiheutti päinvastaisia ​​vaikutuksia (taulukko 1, kuva 1a). Kun Bis-T-23 lisättiin ennen LatA:ta, solun korkeus ja mikrovillien pituus säilyivät osittain. Koska mikrovillillä on erinomainen pituussäätely, jonka määrittää aivokuoren aktiini tyvessään16, nämä tiedot osoittavat, että Bis-T-23 muutti aktomyosiinikuorta apikaalisessa kalvossa.

Bis-T-23:n tarkan vaikutuksen määrittämiseksi aivokuoren aktiiniin visualisoimme lamellipodiassa olevan aktomyosiinikuoren käyttämällä platinareplica-elektronimikroskooppia (PR-EM). LatA vähensi aktiiniverkkojen tiheyttä, ja tämä vaikutus kumosi osittain Bis-T-23:n lisäämisellä ennen LatA:ta (kuva 1b). Koska LatA kiihdyttää aktiinifilamenttien depolymeroitumista eristämällä aktiinimonomeerejä, tutkimme seuraavaksi, johtuiko Bis-T-23:n havaittu aktomyosiinikuoren säilyminen sen positiivisesta vaikutuksesta aktiinin polymeroitumiseen. Toisin kuin podosyyttisoluuutteissa 10,11 havaittu voimakas aktiinin polymerisaation stimulaatio, Bis-T-23 lisäsi vain marginaalisesti aktiinin polymeroitumista MDCK-soluuutteessa (täydentävä kuva 1b). Samoin endogeenisen dynamiinin -2 (Dyn2) immuunipuutos uutteesta tai sen GTPaasiaktiivisuuden estäminen dynodilla johti marginaaliseen aktiinin polymerisaation heikkenemiseen (täydentävä kuva 1c). Vaikka LatA ja CytoD heikensivät merkittävästi aktiinin polymerisaatiota, Bis-T-23:n lisääminen ennen LatA:ta tai CytoD:tä ei pystynyt voittamaan niiden estäviä vaikutuksia (täydentävä kuva 1d, e). Jasplakinolidi, lääke, joka indusoi aktiinin polymerisaatiota stimuloimalla aktiinifilamentin ytimiä17, ei merkittävästi lisännyt polymeroinnin yleistä tasoa (täydentävä kuva 1d), mikä viittaa siihen, että MDCK-solulysaatissa on lähes maksimaalista polymeroitunutta aktiinia. Yhdessä nämä tiedot osoittivat, että Bis-T-23:n vaikutukset apikaalisen kalvon morfologiaan MDCK-soluissa johtuivat muusta mekanismista kuin aktiinin polymerisaatiosta.

Ottaen huomioon yleisen tiedon Dyn2:n ja F-aktiinin rikastuneesta lokalisoinnista munuaisten epiteelisolujen siveltimellä8 ja dynamiinin roolista endosytoosissa, tutkimme seuraavaksi, vaikuttiko Bis-T-23 aktiiniin epäsuorasti endosytoosin muutosten kautta. Kuten odotettiin, sekä Dyn2 että F-aktiini lokalisoituivat aktomyosiinikuoressa apikaalisen kalvon alla, mikrovillien sisällä ja klatriinilla päällystetyissä kuopissa (CCP), jotka määritetään niiden erillisen muodon ja koon perusteella (täydentävä kuva 1f). Tutkimme CCP:iden dynamiikkaa käyttämällä kokonaisheijastusfluoresenssimikroskopiaa (TIRF)18,19. Bis-T-23 ei edes korkeimmalla pitoisuudellaan vaikuttanut CCP:iden eliniän jakautumiseen, kun taas dynoli vähensi tuottavien CCP:iden määrää (täydentävä kuva 1g). Tämä korrelaation puute endosytoosin tason ja solumorfologian muutosten välillä vahvistaa, että Bis-T- 23 kohdistuu aivokuoren aktiiniin vaikuttamatta dynamiinin rooliin endosytoosissa.

Koska munuaissolujen polaarisuutta ylläpitävät aktomyosiiniverkkojen arkkitehtuuri ja jatkuva supistuminen, mikä muodostaa solun jäykkyyden apikaalisessa kalvossa20, mittasimme seuraavaksi solujen jäykkyyttä käyttämällä atomivoimamikroskopiaa (AFM). Nanowizard IV -järjestelmää ja JPK-analyysiohjelmistoa käytettiin Youngin Modulus21:n muutosten määrittämiseen erilaisissa kokeellisissa asetuksissa (lisäkuva 2a). LatA-käsittely johti merkittävästi solujen välisten kosketusjäykkyyden ja apikaalisten solujen jäykkyyden vähenemiseen MDCK-soluissa (kuva 1c-e). Sitä vastoin Bis-T-23 lisäsi merkittävästi solujen jäykkyyttä verrattuna DMSO-vehikkeliin (kuvat 1c–e), mikä vastaa sen positiivisia vaikutuksia solun korkeuteen, mikrovillien lukumäärään ja aktiiniverkkojen tiheyteen (taulukko 1 ja Kuva 1b)22. Bis-T-23:n lisääminen ennen LatA:ta vähensi voimakkaasti LatA:n negatiivista vaikutusta solujen jäykkyyteen (kuvat 1c–e) Bis-T-23:n positiivisen vaikutuksen mukaisesti aktiiniverkkoihin. ja apikaalisen solun morfologia (taulukko 1, kuvio lb).

Kuvio 1 Dynamiin-oligomerointi määrittelee solun jäykkyyden vaikuttamalla munuaisten epiteelisolujen aktiiniarkkitehtuuriin. a Edustavia SEM-kuvia DMSO:lla (0,1 %) tai Bis-T-23:lla (30 µM, 0,1 % DMSO) käsitellyistä MDCK-soluista 1 0 min ennen DMSO:n (0,1 %) tai LatA:n (0,2 µM, 0,1 % DMSO) lisäämistä 2{{23} } min. Suurennetut kuvat upoksista (oranssit laatikolliset alueet) osoittavat mikrovillien järjestyksen, jakautumisen ja tiheyden apikaalisella kalvolla. b Edustavia PR-EM-kuvia MDCK-soluista, jotka on käsitelty kohdassa (a) kuvatulla tavalla. Kuvissa näkyy muutoksia aktomyosiinikuoren organisoinnissa MDCK-soluissa osoitetuissa olosuhteissa. c Edustavat kuvat Youngin Modulus-kartoista MDCK-soluista, joita on käsitelty kohdassa (a) kuvatulla tavalla. d, e Pylväsdiagrammit, jotka edustavat Youngin moduulia, jotka kuvaavat solujen jäykkyyttä mitattuna solujen ja solujen liitoksesta (d) tai apikaalisesta kalvosta (e). Jokainen symboli edustaa yksittäisen solun keskimääräistä jäykkyyttä. Kohdissa d, e esitetyt tulokset tuotettiin vähintään 1 0 solusta vähintään kolmelta viljelymaljalta. Virhepalkit, keskiarvo ± SD (*P pienempi tai yhtä suuri kuin 0,05, **P pienempi tai yhtä suuri kuin 0,01, ***P pienempi tai yhtä suuri kuin 0,001, ****P pienempi tai yhtä suuri kuin 0,0001, pariton kaksisuuntainen t-testi). ns, ei merkittävää.

Olemme myös määrittäneet solujen jäykkyyden käyttämällä BioScope II -järjestelmää vaihtoehtoisena kokeellisena lähestymistapana AFM:lle. Tässä tapauksessa voiman sisennyskäyrät saatiin Discherin ja työtovereiden mallin mukaisesti, joka oli laskettu Matlab-ohjelmistolla23. Samanlaisia ​​suuntauksia koskien solujen jäykkyyttä havaittiin LatA:n ja Bis-T-23:n välisessä vuorovaikutuksessa (lisäkuvat 2b, 2c). Lisäksi dynodi ei osoittanut mitään vaikutusta solujen jäykkyyteen, kun taas CytoD vähensi merkittävästi solujen jäykkyyttä (täydentävä kuva 2d, e) aktiinifenotyyppiensä mukaisesti (täydentävä kuva 1a). Yhdessä nämä tiedot vahvistavat korrelaation aktomyosiinikuoren tilan, solujen jäykkyyden, apikaalisen kalvon morfologian ja solun polariteetin välillä. Nämä havainnot osoittavat myös vakuuttavasti dynamiinioligomerisaation roolin epiteelisolujen polaarisuuden mekaanisten parametrien määrittelyssä sen vaikutuksen kautta aktomyosiinikuoreen

Dynamiin silloittaa aktiinifilamentit haarautuneiksi verkoiksi, jotka ovat solun polariteetin taustalla. Selvittääksemme molekyylimekanismia, jolla dynamiinin oligomerointi vaikuttaa aktomyosiinikuoren arkkitehtuuriin, tutkimme seuraavaksi dynamiinin vaikutusta aktiinifilamentteihin uudelleenmuodostetussa järjestelmässä. Nykyisen hypoteesin perusteella aktiinifilamenttien pituus määrittää niiden silloitustavan6. Koska aivokuoren aktiinifilamenttien keskimääräinen pituus verkon sisällä etureunassa on 100 ja 150 nm24 välillä, tutkimme dynamiinin vaikutuksia lyhyempien filamenttien järjestäytymiseen, jotka syntyivät peittämällä F-aktiini gelsoliinilla (Gsn-aktiini) (kuva 1). 2a). Dyn2:n lisääminen johti suurten, haarautuneiden verkkojen muodostumiseen (kuvat 2b, c). Yhdistelmä-Dyn2:n kokojen ja muotojen perusteella (kuva 2d) verkostot muodostuivat pääasiassa Dyn2-dimeereistä (Dyn2DIMER) ja tetrameereistä (Dyn2TETRA), jotka olivat vuorovaikutuksessa useiden aktiinifilamenttien kanssa (kuva 2e): Dyn2DIMER sitoutui kahteen filamenttiin, Dyn2TETRA sidoi enintään neljä filamenttia ja Dyn2RING enintään kuusi filamenttia. Kuvien alhainen suurennus paljasti, että dynamiinista riippuvat verkot muodostavat pienempiä ja suurempia rengasmaisia ​​muotoja (kuva 2c).

Korreloidakseen havaintoja uudelleen muodostetusta järjestelmästä dynamiinin rooliin soluissa, määritimme seuraavaksi endogeenisen Dyn2:n lokalisoinnin aivokuoren aktiiniverkkoihin käyttämällä monoklonaalista anti-Dyn2-vasta-ainetta, jota seurasi kultakonjugoitu sekundaarinen vasta-aine (täydentävä kuva 3a-c). Kuten rekonstituoidussa järjestelmässä nähdään, dynamiini liittyy selkeään määrään F-aktiinia haarautuneissa verkoissa (kuvio 2f). Yhdessä nämä tiedot tunnistavat dynamiinin uuden aktiivisuuden, joka silloittaa F-aktiinin haarautuneiksi verkostoiksi.

Korreloidaksemme dynamiinin silloituskykyä ja Bis-T-23:n suojaavaa vaikutusta aktomyosiinikuoreen ja apikaalisen kalvon morfologiaa tutkimme seuraavaksi Bis-T-23:n vaikutuksia dynamiinivälitteiseen. verkot uudelleen muodostetuissa järjestelmissä (kuva 3a). Perustuu ääriviivakaavioihin, jotka tarjoavat topografisia esityksiä vaihtelevista filamenttiheyksistä, Bis T-23 lisäsi verkon kokonaistiheyttä (kuva 3a), mikä selittyy dynamiiniin sitoutuneen F-aktiinin määrän kasvulla, joka johtuu sen oligomerisaation lisääntyminen. Lisäksi dynamiini silloitti tehokkaammin lyhyempiä filamentteja kuin pitkä F-aktiini (kuvat 3a-c), mikä viittaa siihen, että dynamiinin kyky muodostaa haarautuneita verkkoja määräytyy sen oligomeroitumistilan ja aktiinifilamenttien pituuden perusteella. Kyky ristisilloittaa aktiinifilamentteja verkoiksi jakaa kahdella dynamiini-isoformilla, kaikkialla ilmennetyllä Dyn2:lla ja neuronispesifisellä dynamiinilla -1 (Dyn1) (kuvio 3b, c).

Wecistanchen tukipalvelu - Kiinan suurin vesisäiliön viejä:

Sähköposti:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Puhelin:+86 15292862950

Myymälä:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop