Fluoresoivien proteiinivasta-aineiden tutkimuksen edistyminen ja sovellukset: nano-aineisiin keskittyvä katsaus

Abstrakti: Fluoresoivien proteiinien (FP) löytämisen jälkeen niiden rikkaat fluoresenssispektrit ja fotokemialliset ominaisuudet ovat edistäneet laajalle levinneitä biologisia tutkimussovelluksia. FP:t voidaan luokitella vihreäksi fluoresoivaksi proteiiniksi (GFP) ja sen johdannaisiksi, punaiseksi fluoresoivaksi proteiiniksi (RFP) ja sen johdannaisiksi sekä lähi-infrapuna-FP:ksi. FP:iden jatkuvan kehityksen myötä FP:ihin kohdistuvia vasta-aineita on syntynyt. Vasta-aine, immunoglobuliiniluokka, on humoraalisen immuniteetin pääkomponentti, joka tunnistaa ja sitoo antigeenejä. Yhdestä B-solusta peräisin olevaa monoklonaalista vasta-ainetta on käytetty laajalti immuunimäärityksessä, in vitro -diagnostiikassa ja lääkekehityksessä. Nanobody on uudentyyppinen vasta-aine, joka koostuu kokonaan raskaan ketjun vasta-aineen variaabelista domeenista. Perinteisiin vasta-aineisiin verrattuna nämä pienet ja stabiilit nano-aineet voivat ilmentyä ja toimia elävissä soluissa. Lisäksi he voivat helposti päästä käsiksi kohteen pinnalla oleviin uriin, saumoihin tai piilotettuihin antigeenisiin epitooppeihin. Tämä katsaus tarjoaa yleiskatsauksen erilaisista FP:istä, niiden vasta-aineiden, erityisesti nano-aineiden, tutkimuksen edistymisestä sekä nano-aineiden kehittyneistä sovelluksista, jotka kohdistuvat FP:iin. Tämä katsaus on hyödyllinen lisätutkimuksessa FP:ille kohdistetuista nanokappaleista, mikä tekee FP:istä arvokkaampia biologisessa tutkimuksessa.

cistanche tubulosa - parantaa immuunijärjestelmää

Avainsanat: fluoresoiva proteiini; monoklonaalinen vasta-aine; nanobody; tutkimuksen edistyminen; sovellus

1. Esittely

Fluoresoiva proteiini (FP) on biolääketieteen tutkimuksen yleisimmin käytetty työkaluproteiini. FP:n lisääntyneen käytön jälkeen on myös kehitetty FP-vasta-aineita. Perinteiseen vasta-aineeseen (kuvio 1A) verrattuna kamelin raskaan ketjun vasta-aineista (HCAb) (kuvio 1B) ja haiden immunoglobuliinin uusien antigeenireseptorien (IgNAR) (Kuva 1C) puuttuvat luonnollisesti kevyet ketjut. Single-domain vasta-aine (sdAb) on vasta-aine, joka koostuu kokonaan HCAb:n tai IgNAR:n vaihtelevista domeeneista. Sen molekyylipaino on 12–15 kDa, mikä on noin 1/10 monoklonaalisen vasta-aineen koosta; siksi sitä kutsutaan myös nanobodyksi. Nanobody, jolla on pienempi koko, korkea stabiilisuus happoa ja lämpöä vastaan, vahva tunkeutumiskyky, geenitekniikan ja ilmentymisen helppous sekä korkea affiniteetti, on tieteellisten tutkijoiden käyttänyt useilla aloilla. Se voi helposti päästä käsiksi uriin, saumoihin tai piilotettuihin antigeenisiin epitooppeihin kohteen pinnalla ja tunnistaa monia antigeenejä, joita tavanomaiset vasta-aineet eivät pysty tunnistamaan [1]. Tästä syystä nanoaineita on käytetty biomolekyyleinä organismeissa ja soluviljelyjärjestelmissä kehitysbiologiassa, kiteisiä kaperoneja konformaatiotilaan stabiilissa biologiassa, entsyymitoiminnan säätelijöinä tai estäjinä, immunohistokemiallisina reagensseina biokemialliseen analyysiin ja sekundaarisina vasta-aineina immunoblottauksessa ja immunofluoresenssissa [2 –6]. Nanoaineita, jotka sitovat spesifisesti FP:tä, käytetään laajalti subsellulaarisessa lokalisoinnissa, solunsisäisten signalointireittien tutkimuksissa, elävien solujen kuvantamisessa ja kohdistetuissa nanomateriaaleissa [7–9]. Erityisesti nano-aineilla on ainutlaatuisia etuja perinteisiin IgG-vasta-aineisiin verrattuna erittäin korkearesoluutioisessa kuvantamisessa.

Kuva 1. IgG:n (A), kamelin HCAb:n (B) ja hain IgNAR:n (C) rakennekaaviot. VH, raskaan ketjun vaihteleva alue; VL, kevyen ketjun vaihteleva alue; CH/C, raskaan ketjun vakioalue; CL, kevyen ketjun vakioalue; VHH, HCAb:n vaihteleva domeeni; VNAR, IgNAR:n muuttuva domeeni.

2. Fluoresoivien proteiinien yleiskatsaus

2.1. Fluoresoivien proteiinien löytö

Luminesenssi on yleinen ilmiö meren selkärangattomilla. Coelenteraatit, mukaan lukien meduusat, hydrat ja korallit, säteilevät vihreää fluoresenssia ultraviolettivalossa (UV) tai sinisessä valossa, kun taas ctenoforit säteilevät sinistä fluoresenssia. Vihreä fluoresoiva proteiini (GFP) tunnistettiin ensimmäisen kerran Aequorea victoriassa Shimomura et ai. vuonna 1962 [10], ja sitten kloonattiin ja ekspressoitiin vuonna 1985 [11]. Villityypin GFP:n (wtGFP) ainutlaatuiset ominaisuudet ja vakaa rakenne ovat näin ollen houkutelleet monia tutkijoita tutkimaan sitä. Siitä lähtien Tisen ja hänen kollegansa ovat tuottaneet olemassa olevan tiedon ja sen kiderakenteen perusteella erilaisia ​​GFP-proteiineja, joilla on erilaiset fluoresoivat ominaisuudet mutaatioiden avulla, ja kehittäneet GFP:n luminesenssimekanismia [12]. GFP:hen liittyvästä tutkimuksesta kolme tiedemiestä (Shimomura, Chalfie ja Tsien) voitti vuoden 2008 kemian Nobel-palkinnon GFP:n löytämisestä ja erinomaisesta panoksestaan ​​sen soveltamisessa.

Ancestral red fluorescent protein (RFP), nimittäin DsRed, kloonattiin ei-bioluminoivista riuttakoralleista vuonna 1999 [13]. RFP:tä voidaan käyttää yhdessä GFP:n kanssa ratkaisemaan tieteellisiä ongelmia, joita GFP ei yksin pysty ratkaisemaan. Mikä tärkeintä, solunsisäisen kuvantamisen alhaisen RFP-taustan vuoksi se soveltuu paremmin biotieteiden tutkimukseen [14,15]. Monien tutkijoiden ponnisteluilla FP:iden fluoresenssispektrien on raportoitu kattavan koko näkyvän alueen ja jopa lähi-infrapuna-alueen, mikä tarjoaa runsaasti työkaluja proteiinien visualisointiin ja kvantifiointiin elävissä soluissa [16]. Kuvassa 2 on yhteenveto FP:n kehityksestä.

Kuva 2. Fluoresoivien proteiinien kehitys. GFP, vihreä fluoresoiva proteiini; BFP, sininen fluoresoiva proteiini; EGFP, tehostettu vihreä fluoresoiva proteiini; YFP, keltainen fluoresoiva proteiini; RFP, punainen fluoresoiva proteiini; VHH, raskaan ketjun vaihteleva domeeni; VNAR, muuttuva uusi antigeenireseptori. Vaaleanvihreä merkki osoittaa GFP:n käyttötutkimuksen edistymistä ja keltainen vihreä merkki osoittaa GFP-vasta-ainetutkimuksen edistymistä.

2.2. GFP:n rakenne ja toiminnalliset ominaisuudet

GFP on luonnossa esiintyvä, pallomainen ja liukoinen hapan FP. GFP:n päärakenne koostuu monomeeristä, joka koostuu 238 aminohappotähteestä ja jonka molekyylipaino on 27–30 kDa. Sen kiderakenteessa on keskus, jonka muodostaa 11 vastasuuntaista ketjua, jotka muodostavat sylinterimäisen, tiiviisti pakatun tynnyrirakenteen. Piipun keskusta on suojattu valoa emittoivalla 4-(p-hydroksibentsylideeni)-5--imidatsolinoniryhmällä, joka on liitetty sen -kierteeseen, ja molemmat päät on suljettu lyhyillä kierresegmenteillä [17,18]. Kromoforin kypsyminen ei vaadi muuta kofaktoria kuin O2 [19]. GFP absorboi sinistä valoa tai UV-valoa ja emittoi vihreää fluoresenssia päävirityshuipun ollessa 395 nm, matalin virityshuippu 475 nm:ssä ja emissiohuippu 509 nm:ssä. GFP on erittäin vakaa ja kestää helposti käsittelyn korkeissa lämpötiloissa. Formaldehydikiinnitys tai parafiiniin upottaminen ei vaikuta sen fluoresenssiominaisuuksiin. Tutkimalla perusteellisesti FP:n rakennetta ja kypsymisprosessia, yhä useammat tutkijat suunnittelevat FP:n rakennetta uudelleen tarjotakseen niille uusia toimintoja ja ominaisuuksia, mikä edistää edelleen niiden kehitystä ja soveltamista.

cistanche tubulosa - parantaa immuunijärjestelmää

2.3. GFP-johdannaiset

Rajoittavia tekijöitä GFP-sovelluksissa ovat pH, kloridi-ioniherkkyys ja huono fotostabiilius. GFP:n kohdistetut muutokset korjaavat nämä puutteet lisäämällä sen kvanttisaantoa, kirkkautta, molaarista ekstinktiokerrointa ja fotostabiilisuutta. Lisäksi useita GFP-johdannaisia ​​on perustettu laajentamaan säteilevien värien valikoimaa, mukaan lukien sininen, ultramariini, syaani ja keltainen.

Vasteena wtGFP:n alhaiselle fluoresenssin intensiteetille sinisen valon virityksessä ja sen epävakaalle ilmentymiselle nisäkässoluissa Zhang et ai. kehitti GFP:n (F64L ja S65T) aminohapposubstituution, nimittäin tehostetun GFP:n (EGFP), jonka fluoresenssin intensiteetti on lisääntynyt 35--kertaisesti [20]. EGFP on edelleen yleisimmin käytetty FP-mutantti vihreän valon alueella sen hyvän fotostabiilisuuden ja korkean kirkkauden vuoksi. Lisäksi GFP:n taitto-ominaisuudet on optimoitu, jolloin on saatu superkansio GFP (sfGFP), jolla on supertaittokyky. SfGFP:ssä on kuusi uutta mutaatiota, mukaan lukien S30R, Y39N, N105T, Y145F, I171V ja A206V. sfGFP voi laskostua tehokkaasti jopa ekspressoituessaan fuusiossa liukenemattomien proteiinien kanssa, mikä varmistaa sen fluoresenssin kirkkauden [21]. GFPuv, toinen GFP:n modifioitu muoto, on optimoitu fluoresenssiin UV-valossa. Se tuottaa kirkkaampaa vihreää fluoresenssia UV-valon läsnäollessa virityshuipun ollessa 395 nm:ssä ja emissiohuippuna 509 nm:ssä, ja sitä voidaan käyttää erilaisten solunsisäisten proteiinien sijainnin määrittämiseen [22,23]. GFPuv:ssä tapahtuu kolme aminohapposubstituutiota, mukaan lukien F99S, M153T ja V163A. Nämä mutaatiot indusoivat 18-kertaisesti voimakkaamman GFPuv:n ekspression kuin wtGFP E. colissa. GFPuv-geeni on synteettinen geeni, jossa viisi matalataajuista Arg-kodonia on korvattu E. colille sopivilla kodoneilla GFPuv:n tehokkaan ilmentymisen varmistamiseksi.

cistanche tubulosa - parantaa immuunijärjestelmää

Napsauta tästä nähdäksesi Cistanche Enhance Immunity -tuotteet

【Kysy lisää】 Sähköposti:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Y66H:n kohdennettu mutaatio rakentaa sinisen fluoresoivan proteiinin (BFP), jonka virityshuippu on 384 nm:ssä ja emissiohuippu ~ 445 nm:ssä. Sen viritysspektri on lähellä UV-valoa, joka vahingoittaa soluja käytön aikana, ja sen lyhyt emissioaallonpituus indusoi soluissa autofluoresenssia. Enhanced BFP (EBFP) on heikosti luminoiva ja huonosti valovalkaisua ja happoa kestävä, ja sen taustasignaali on korkea solukuvauksessa. Kolme kirkkaampaa EBFP-mutanttia on kehitetty, mukaan lukien Azurite [24], EBFP2 [25] ja mTagBFP [26], jotka ovat 1.6-, 2.0- ja 3.{13} }kertaa kirkkaampi kuin EBFP. mTagBFP, kirkkain BFP, on peräisin punaisen fluoresoivan proteiinin (RFP) TagRFP [27] mutantista, jonka ekstinktiokerroin on 52,000 M−1 cm−1 ja kvanttisaanto {{19 }}.63, mikä parantaa merkittävästi sen valovalkaisunkestävyyttä. Y66F:n mutaatio wtGFP:ssä johtaa ultramariinifluoresoivaan proteiiniin, jonka emissioaallonpituus on 442 nm [28]. GFP-Y66F-variantin alhainen fluoresenssin kvanttisaanto rajoittaa kuitenkin voimakkaasti sen soveltuvuutta kuvantamiseen. GFP-Y66F:n lisämutaatio T65Q-, Y145G-, H148S- ja T203V-aminohapposubstituutioilla johtaa ultramariinin fluoresoivaan proteiiniin Sirius, joka on 25 kertaa kirkkaampi kuin GFP-Y66F [29].

Syaanin fluoresoivan proteiinin (CFP) virityshuippu on 449 nm:ssä ja emissiohuippu ~ 482 nm:ssä, ja spektriominaisuudet vaihtelevat BFP:n ja EGFP:n välillä. Samoin kuin BFP, Y66W:n kohdennettua mutaatiota käytetään CFP:n rakentamiseen. CFP:llä on laajat sovellukset monivärikuvauksessa ja lokalisointitutkimuksessa erinomaisen fotostabiiliuutensa ansiosta. Esimerkiksi CFP:tä koodaava geeni on optimoitu ihmisen kodonipreferenssille ja on nyt kaupallisesti saatavilla kauppanimellä AmCyan1 (Clontech). Lisäksi on useita mutantteja, jotka ovat kirkkaampia kuin tehostettu CFP (ECFP), kuten Cerulean, mTFP (kaksi kertaa kirkkaampi kuin Cerulean) ja turkoosi (noin kaksi kertaa kirkkaampi kuin ECFP) [21,30].

Keltaisen fluoresoivan proteiinin (YFP) mutaatiot eivät rajoitu kromoforin Y66 ydinmotiiviin, vaan tähteisiin, jotka ovat rakenteellisesti Y66:n vieressä. YFP:n virityshuippu on ~ 518 nm ja emissiohuippu ~ 531 nm. Verrattuna GFP:hen YFP:n fluoresenssi siirtyy kohti punaista spektriä, mikä johtuu pääasiassa Thr:n substituutiosta Tyrillä kohdassa 203. Enhanced YFP (EYFP) on yksi fluoresoivista ja laajimmin käytetyistä FP-biosensoreista solunsisäisen pH:n ja pH:n havaitsemiseen. kloridi-ionipitoisuudet. Se on kuitenkin erittäin herkkä happo- ja kloridi-ioneille ja on vähemmän valostabiili kuin monet meduusoista peräisin olevat FP:t [31]. mCitrine ja mVenus, EYFP:n parannetut versiot, ovat tällä hetkellä eniten käytetyt YFP:t [32,33]. GFP:n ja sen johdannaisten fotofysikaaliset ominaisuudet on yhteenveto taulukossa 1.

Taulukko 1. GFP:n, RFP:n ja niiden johdannaisten fotofysikaaliset ominaisuudet.

Taulukko 1. Jatk.

2.4. RFP johdannaiset

RFP on toinen laajalti käytetty FP. DsRed on tetrameeri, jolla on taipumus muodostaa multimeerejä suoritettaessa proteiinifuusioita ja joka voi olla myrkyllistä solunsisäisesti ekspressoituessaan, joten se on suunniteltu monomeerien saamiseksi. Merkittävin tarjouspyyntö on "mFruit"-perhe, johon kuuluvat mCherry, mBanana, mOrange, dTomato, mTangerine ja mStrawberry (taulukko 1), joista mCherry, jossa on K163Q- ja K83L-mutaatiot, on suosituin. mCherryllä on nopea kypsyminen, hyvät monomeeriominaisuudet ja parempi valonkestävyys, vaikka se on vähemmän kirkas [34]. Kuitenkin TagRFP monomeerimuodossaan on noin kolmesta neljään kertaa kirkkaampi kuin mCherry, mikä tekee siitä suhteellisen kirkkaan monomeerisen RFP:n, joka on tällä hetkellä saatavilla [27]. mKate on uusi monomeerinen kaukopunainen fluoresoiva proteiini, joka on peräisin TagRFP:n neljän kohdan mutaatiosta, jonka virityshuippu on 588 nm:ssä ja emissiohuippu 635 nm:ssä, mikä on vain 45 % yhtä kirkas kuin EGFP; sen dimerisaatioproteiini, Katushka, on 67 % yhtä kirkas kuin EGFP [35]. mKate2:lla, mKaten mutantilla, jossa on aminohapposubstituutioita V38A, S165A ja K238R, on noin kaksinkertainen kirkkaus mKaten [36]. Verrattuna GFP:hen ja RFP:hen, mKate ja Katushka osoittavat paremman kuvantamissyvyyden ja rikkaammat optiset signaalit objektin sisäisessä fluoresenssikuvauksessa [35]. Tästä syystä pitkälle punaisten fluoresoivien proteiinien kehittäminen on arvokkaampaa in vivo -biokuvauksessa.

2.5. Lähi-infrapuna FP:t

Near-infrared (NIR) FP:t ovat erittäin haluttuja proteiinitunnisteita kuvantamissovelluksissa. Useimmat NIR FP:t on suunniteltu bakteerien fytokromivaloreseptoreista (BphP) [37]. Ensimmäinen elävien eläinten kuvantamiseen käytetty NIR FP on IFP1.4, BphP:stä johdettu fluoresoiva proteiini, joka fluoresoi sitoutumalla biliverdiinin (BV) kromoforiin [38]. DNA-sekoituksella ja satunnaisella mutageneesillä kehitetään sitten kirkkaampi IFP2.0 [39]. Vaikka monomeeriset IFP1.4 ja IFP2.{11}} voidaan saavuttaa rikkomalla BphP:n dimerisaatiorajapinta, niillä on silti taipumus dimeroitua korkeissa pitoisuuksissa. Luonnollinen monomeerinen infrapunafluoresoiva proteiini (IFP), mIFP, suunniteltiin vuonna 2015 [40]. mIFP:llä on todistettu olevan äänikuvausvaikutuksia Drosophilan toukissa ja hermosoluissa. Shcherbakova et ai. suunnitteli kolme kirkasta monomeerista NIR FP:tä erillisillä spektreillä, nimittäin miRFP670, miRFP703 ja miRFP709 [41]. BphP-peräiset NIR-FP:t vaativat minimaalisesti kaksi domeenia, PAS (Per-ARNT-Sim) ja GAF (cGMP-fosfodiesteraasi-adenylaattisyklaasi-FhlA), BV-kromoforin kovalenttiseen kiinnittämiseen ja niillä on myös monimutkainen "kahdeksan solmun kuvio" linkittää topologisesti GAF- ja PAS-alueet, mikä vaikuttaa niiden taittumiseen. Tästä syystä NIR FP:iden, kuten smURFP:n, suunnittelussa käytetään toista bakteerien fotoreseptoreiden luokkaa, allofykosyaniinit (APC) [42]. Vaikka APC-pohjaiset NIR FP:t ovat pienempiä, ne sitovat BV:tä vähemmän tehokkaasti, mikä johtaa merkittävästi pienempään kirkkauteen nisäkässoluissa kuin BphP-peräiset NIR FP:t. BphP- ja APC-pohjaisten NIR FP:iden vikojen voittamiseksi kehitettiin syanobakteriokromista (CBCR) yksidomaininen NIR FP, nimeltään miRFP670nano. Se edustaa ensimmäistä CBCR:stä johdettua NIR FP:tä, joka pystyy sitomaan tehokkaasti endogeenisen BV-kromoforin ja lähettämään kirkasta fluoresenssia. nisäkässolut [43]. MiRFP670nanon olennainen etu BphP-peräisiin NIR-FP:ihin verrattuna on korkea valonstabiilius. Tehostettu miRFP670nano3, jossa on 14 mutaatiota suhteessa vanhempiin miRFP670nanoon, osoittaa samanlaista fotostabiilisuutta kuin miRFP670nano [44]. Taulukossa 2 on yhteenveto NIR FP:iden fotofysikaalisista ominaisuuksista.

Taulukko 2. NIR FP:iden fotofysikaaliset ominaisuudet.

FP:iden löytäminen ja soveltaminen on tarjonnut tehokkaan tutkimustyökalun nykyaikaiselle biologialle. Nykyään FP:istä on tullut yksi yleisimmistä työkaluista, joita tutkijat käyttävät laajentaakseen sovelluksiaan monille tutkimusalueille, kuten geeniekspression säätelyyn, organellien leimaamiseen, signaalin siirtoon, lääkeseulomiseen ja biomolekyylien vuorovaikutuksiin. Useimmat FP:itä ilmentävistä kloonausvektoreista on kaupallistettu ja niitä on saatavilla kaupallisilta yhtiöiltä.

3. Fluoresoivan proteiinin vasta-aineen tutkimus edistyy

3.1. Monoklonaalinen vasta-aine kohdistuu fluoresoiviin proteiineihin

Vasta-aine on eräänlainen B-lymfosyyttien erittämä immunoglobuliini. Monoklonaaliset vasta-aineet koostuvat kahdesta raskaasta ketjusta ja kahdesta kevyestä ketjusta, jolloin raskas ketju koostuu yhdestä vaihtelevasta alueesta (VH) ja kolmesta vakioalueesta (CH), ja kevyt ketju koostuu yhdestä vaihtelevasta alueesta (VL) ja yhdestä vakioalueesta (CL). ). Raskasketjut on liitetty kovalenttisesti disulfidisidoksilla, ja kevyen ketjun CL-alue on sitoutunut ei-kovalenttisesti raskaan ketjun CH1-domeeniin stabiilin vasta-ainemolekyylin muodostamiseksi [45]. Spesifisen reseptorisitoutumiskykynsä ansiosta monoklonaaliset vasta-aineet tuottavat erilaisia ​​biologisia aktiivisuuksia, kuten klassista salpausta, neutralointia, komplementin aktivaatiota, kohdesolujen tappamista Fc-reseptorin kautta ja immuuniaktiivisuuden säätelyä. Ne ovat kriittisiä biologisia makromolekyylejä, joita käytetään laajasti immuunimäärityksessä, in vitro -diagnostiikassa ja lääkekehityksessä. Polyklonaaliset vasta-aineet ovat sekoitus heterotyyppisiä vasta-aineita, jotka ovat peräisin useiden B-solujen immuunivasteprosessista, ja jokainen vasta-aine tunnistaa saman antigeenin eri epitoopin [45]. Verrattuna polyklonaalisiin vasta-aineisiin, monoklonaaliset vasta-aineet havaitsevat spesifisesti epitoopin antigeenissä ja ne reagoivat vähemmän todennäköisemmin ristiin muiden proteiinien kanssa, mikä tuottaa alhaisia ​​taustavärjäytymissignaaleja. Lisäksi monoklonaalisia vasta-aineita koskevien tulosten toistettavuus on korkeampi kuin polyklonaalisten vasta-aineiden samoissa koeolosuhteissa.

GFP is a unique in vivo reporter that can be analyzed for gene expression in many species. Gengyoando and Mitani used the glutathione-S-transferase (GST) fusion protein, which contains the full-length GFP coding region and a synthetic peptide corresponding to residues Ser208-His217 of GFP, as an immunogen to create the monoclonal antibody 65B12 against GFP [46]. Immunoblot analysis demonstrates that 65B12 specifically bound the GFP fusion protein. Furthermore, it can recognize the fluorescent cells in transgenic animals expressing the uric-86-gfp reporter construct; hence, it can be applied in immunohistochemistry. Zhuang et al. developed an improved method to purify GFP protein [47]. The monoclonal antibody against GFP, FMU-GFP.5, was prepared by immunizing mice using purified GFP as an antigen. GFP with high purity (>97% homogeneity) and sample yield (>90 %) puhdistetaan käyttämällä suoraviivaista 2-vaihetekniikkaa käyttämällä mAb FMU-GFP:tä.{3}}kytkettyä Sepharose 4B -hartsia. Lisäksi kaikki GFP:hen kytketyt toiminnalliset rekombinanttikohdeproteiinit voidaan helposti ja suoraan eristää soluista GFP-epitoopin ansiosta. Nämä tiedot viittaavat siihen, että tämä menetelmä on tehokkaampi GFP:n puhdistamisessa kuin mikään saatavilla oleva menetelmä ja ratkaisee useimpien GFP-puhdistusmenetelmien alhaisen saannon ja puhtaushaasteen.

cistanche tubulosa - parantaa immuunijärjestelmää

3.2. Nanobody, joka kohdistuu fluoresoiviin proteiineihin

3.2.1. Nanobodyn esittely

Monoklonaalisten vasta-aineiden luontaiset ominaisuudet, kuten niiden suuri molekyylipaino, monimutkainen rakenne ja rajoitettu biologinen aktiivisuus, ovat yhä enemmän rajoittaneet niiden lisäsovelluksia. Siksi on kiireellisesti kehitettävä vaihtoehtoja monoklonaalisille vasta-aineille. Vuonna 1989 Ward et ai. valmisti vain raskaan ketjun vasta-aineen vaihtelevan domeenin, jolla on heikko sitoutumiskyky lysotsyymiin, mikä herätti kiinnostusta sdAb-tutkimukseen [48]. Vuonna 1993 Hamers Casterman et ai. löysi kamelin seerumista ensimmäistä kertaa uuden tyyppisen vasta-aineen, joka on täysin erilainen kuin perinteinen nisäkäsvasta-aine [49]. Tämän tyyppinen vasta-aine on nimeltään HCAb, koska siinä ei ole kevyttä ketjua. HCAb koostuu CH2:sta, CH3:sta, sarana-alueesta ja HCAb:n vaihtelevasta domeenista (VHH), mutta sillä on silti täysi antigeeninsitomiskyky. Vuonna 1995 Greenberg et ai. löysi vain raskaan ketjun vasta-aineita, jotka tunnetaan nimellä IgNAR, hoitajahaista [50]. Sitä esiintyy sekä erittyvässä että kalvoon sitoutuneessa muodossa ja se koostuu vaihtelevasta alueesta, jota kutsutaan vaihtelevan uuden antigeenin reseptoriksi (VNAR), ja useista vakioalueista. Myöhemmin IgNAR on löydetty wobbegong-haista, piikkihaista, sarvihaista ja valkotäplis-bambuhaista, jotka täydentävät sdAbs-valikoimaa. Nanobodylla on pieni molekyylipaino, korkea affiniteetti, vahva stabiilisuus, hyvä liukoisuus, vahva kudostunkeutuminen ja piilotettujen antigeeniepitooppien tunnistaminen. Se on herättänyt lisääntynyttä huomiota sairauksien diagnosoinnissa, immuunireagensseissa, patogeenien havaitsemisessa ja lääkekehityksessä [51]. Molekyylibiologian tekniikoiden kehittymisen ja geneettisesti muunneltujen vasta-aineiden valmistustekniikan parantuessa nanobodysta on tullut suosittu immunomäärityksen tutkimusala. Kuvassa 3 on yhteenveto nanobodyn kehityksestä tähän mennessä.

Kuva 3. Nanobodyn kehitys. Vaaleansininen merkki osoittaa nanobody-lääkkeiden tutkimuksen edistymistä. FDA, Food and Drug Administration; EMA, Euroopan lääkevirasto; NMPA, National Medical Products Administration; HCAb, raskaan ketjun vasta-aine; IgNAR, Ig-uudet antigeenireseptorit; sdAb, yksidomeenivasta-aine; VHH, HCAb:n vaihteleva domeeni; VNAR, IgNAR:n muuttuva domeeni; PD-L1, ohjelmoitu solukuolema 1 ligandi 1.

3.2.2. Nanobody, joka kohdistuu fluoresoiviin proteiineihin

Fluoresoivat proteiinit ovat muuttaneet solubiologiaa ja biokemiaa tarjoamalla helppokäyttöisiä geenikoodattuja fluoresoivia proteiinimarkkereita. Useita tiukasti sitovia aineita tutkimukseen ja lääkekohteisiin on kehitetty synteesin ja valinnan kautta proteiinitelinekirjastoja rinnakkaisen kehityksen aikana [52]. Esimerkkinä on nanobodyn kehittäminen, joka on helpompi valita paremman stabiilisuuden, liukoisuuden ja saannon ansiosta [53]. Toisin kuin perinteiset vasta-aineet, nämä pienet ja vakaat nano-aineet toimivat elävissä soluissa. Siksi nanobody, jolla on spesifinen sitoutumisaktiivisuus FP:hen, on tehokas työkalu FP:n fuusioon, erottamiseen ja solusuunnitteluun useilla biologisen tutkimuksen alueilla.

• Camelidae-peräiset nanokappaleet, jotka kohdistuvat GFP:hen

Erilaisia ​​proteiineja, joilla on erinomaiset subsellulaariset lokalisaatio-ominaisuudet, on fuusioitu GFP:hen, mikä luo visuaalisia antigeenejä proteiinien havaitsemiseksi suoraan erilaisissa solunvälisissä osastoissa. Vuonna 2006 Rothbauer et al. seulottiin GFP-spesifinen vasta-ainefragmentti (cAbGFP4) immunisoimalla alpakka GFP:llä [54]. Pintaplasmoniresonanssimääritys (SPR) cAbGFP4:n ja GFP-antigeenin välisestä vuorovaikutuksesta osoitti korkean affiniteetin (KD=0,23 nM). Lisäksi anti-GFP-nanobody yhdistettiin monomeeriseen RFP:hen, mikä tuotti näkyvän GFP:tä sitovan vasta-aineen, jota käytettiin tutkimaan anti-GFP-nanobodyn jakautumista elävissä soluissa. Geelisuodatuksella, immunoblottauksella ja konfokaalimikroskopialla GFP-spesifisen nanobodyn osoitettiin jakautuneen vakaasti nisäkässoluissa ilman havaittavaa proteiinien hajoamista tai aggregaatiota, jota tavallisesti havaitaan yksiketjuisilla vaihtelevilla fragmenteilla. Lisäksi Kubala et ai. luonnehti GFP:cAbGFP4-kompleksia (kuvio 4A) röntgenkristallografialla ja isotermisellä titrauskalorimetrialla (ITC) [55], mikä paljastaa perustan nanokappaleiden korkealle affiniteetille ja spesifisyydelle proteiinien sitoutumisessa. Vuonna 2020 neljä erillistä anti-GFP-nanokappaletta, nimeltään A12, B9, D5 ja E6, tunnistettiin faaginäytön avulla [56]. Natiivit PAGE- ja immunosaostusmääritykset paljastivat, että nämä nanoaineet voivat sitoa GFP:tä in vitro ja in vivo.

Kuva 4. GFP-nanobody -kompleksin kaavio. (A) cAbGFP4 (PDB:3OGO, oranssi); (B) GBP1 (PDB: 3K1K, vaaleansininen); (C) GBP4 (PDB: 3G9A, vaaleanpunainen); (D) LaG16 (PDB: 6LR7, keltainen); (E) NbsGFP02 (PDB: 7E53, magenta). (F) Yllä olevien nanokappaleiden rakenteellinen superpositio GFP-kompleksin kanssa. GFP näkyy vihreänä.

Proteiinin konformaatio liittyy läheisesti toimintaan, ja sitä säätelevät yleensä säätelytekijät. Axel et ai. tunnisti seitsemän GFP-spesifistä sitojaa, nimittäin GFP:tä sitovia proteiineja (GBP) 1–7 [57]. Niistä GBP1 lisäsi GFP-fluoresenssia 10--kertaiseksi, kun taas GBP4 aiheutti 5--kertaisen laskun GFP-fluoresenssissa; tästä syystä näitä kutsuttiin "tehostajiksi" ja "minimioreiksi". GFP-nanokappalekompleksin rakenneanalyysit (kuvat 4B, C) paljastivat, että nämä kaksi nanokappaletta aiheuttivat vaatimattomia vastakkaisia ​​muutoksia kromoforimiljöössä, mikä muutti sen absorptio-ominaisuuksia [58]. Lisäksi tunnistettiin 25 GFP-spesifistä nanokappaletta (LaG), joiden KD-arvot vaihtelivat välillä 0,5 nM yli 20 µM [59]. Kaksiarvoisella nanokappaleella (LaG-16-LaG-2) oli suurin affiniteetti, jonka KD-arvo oli 36 pM. Lisäksi GFP:n suurin fluoresenssin intensiteetti kasvoi ~ 60 %, kun sitä inkuboitiin ylimääräisen LaG-proteiinin kanssa. Zhang et ai. raportoivat LaG16:n kanssa kompleksoidun GFPuv:n kiderakenteen (kuvio 4D) 1,67 Å:n resoluutiolla [60]. LaG16:n sitoutumiskohta GFP-tynnyrissä sijaitsi GFP-tehostimen toisella puolella. Näin ollen LaG16 ja GFP-tehostaja fuusioitiin (GS)4-linkkerin kanssa. Kaksiarvoisen nanokappaleen affiniteetti oli 0,5 nM, mikä osoittaa, että on mahdollista suunnitella ultrakorkean affiniteetin kohdeproteiinia sitovia aineita dimeroimalla 2 nanokappaletta, jotka sitoutuvat eri epitooppeihin.

Vuonna 2014 Twair et al. valmisti sfGFP:n ja immunisoi aikuisen yksikypäräkamelin. Seitsemän anti-sfGFP-nanokappaletta, jotka kohdistuivat kolmeen epitooppiin (NbsfGFP01, 02, 03, 04, 06, 07 ja 08), eristettiin [61]. ELISA- ja immuuniblottausmääritysten perusteella nämä nanokappaleet tunnistivat sfGFP:n, joka oli leimattu vapaaksi tai fuusioituneeksi kasvuhormoniin. Lisäksi sfGFP:n kanssa kompleksoidun NbsfGFP02:n kiderakenne (kuva 4E) määritettiin 2,2 Å:n resoluutiolla. Affiniteetti NbsfGFP02:n ja sfGFP:n välillä määritettiin olevan 15,8 nM biokerrosinterferometrialla (BLI). NbsfGFP02:n sulamislämpötila oli 75,6 astetta [62]; Tästä syystä se on mahdollinen GFP-nanobody-ehdokas sovelluksissa, jotka vaativat ankaria testausolosuhteita. Useimpia nanokappaleita voidaan ilmentää toiminnallisesti in vivo plasmiditransfektiolla eukaryoottisoluihin. Siksi nanokappaleet ovat erinomainen työkalu elävien solujen rakenteellisten tai dynaamisten piirteiden tunnistamiseen. Vuonna 2020 Zhou et al. ehdotti uutta menetelmää konstruoitujen GFP:tä sitovien nanoaineiden (cAbGFP4) ilmentämiseksi in vitro -transkription (IVT) mRNA:na, jota kutsutaan nanobody-mCherryksi [63]. mRNA, jossa oli transloimattomia alueita ja käänteisiä cap-analogeja, jotka oli suojattu kemiallisesti modifioiduilla nukleotideilla ja poly(A)-hännällä, valmistettiin in vitro ja käytettiin transfektioon. Toisin kuin plasmidi-DNA:ta käyttämällä ekspressoitu nanobodi, IVT-mRNA:ta käyttämällä ekspressoitu anti-GFP-nanobody tunnistettiin 3 tunnin sisällä transfektiosta ja hajosi 48 tunnin kuluessa. Siksi nanobodyn koodatun mRNA:n ilmentäminen elävissä soluissa mahdollistaa nanobodyn tehokkaan kuljetuksen.

• Haista peräisin olevat nanokappaleet, jotka kohdistuvat GFP:hen.

Wei et ai. osoittivat, että bambuhait tuottivat tehokkaan immuunivasteen GFP-immunisaatiota vastaan, jolle on tunnusomaista kohonneet lymfosyyttien määrät ja antigeenispesifiset IgNAR:t [64]. Yhteensä 7 anti-GFP-nanokappaletta, mukaan lukien BsG3, 73, 80, 89, 93, 98 ja 105, joiden affiniteetti oli jopa 0,3 nM, eristettiin immunisoiduista bambuhaista, mikä viittaa siihen, että bambuhait valmistaa korkean affiniteetin IgNAR:eja. Lisäksi konstruoitiin bi-paratooppiset VNAR:t, joilla oli suurin affiniteetti GFP:tä kohtaan (20,7 pM), ja anti-GFP-nanokappaleiden luonne intraboksina validoitiin nisäkässoluissa. Nämä havainnot nopeuttavat bambuhain sdAb-tutkimusta ja -kehitystä, jotta biolääketieteen teollisuudelle saadaan edullisia ja helppokäyttöisiä nanokappaleita.

• Nanokappaleet, jotka kohdistuvat muihin fluoresoiviin proteiineihin.

Masabi on kirkkaan monomeerinen vihreä fluoresoiva proteiini. Li et ai. rakensi onnistuneesti vasta-ainekirjaston, jossa oli 4 × 107 transformanttia immunisoimalla kamelit mWasabilla antigeeninä ja seulottiin 3 korkean affiniteetin mWasabi-spesifistä nanobodia, nimeltään Nb4, Nb6 ja Nb27 [65]. Nämä nanokappaleet tunnistivat wasabin yksinään tai yhdistettynä ohjelmoituun kuolemaan 1 (PD-1). Kaiken kaikkiaan tunnistettiin kuusi korkean spesifisyyden omaavaa mCherryyn kohdistuvaa nanobodia (LaM), joiden KD-arvot vaihtelivat välillä 0,18 nM - 63 nM [59]. Lisäksi eristettiin kolme iRFP713-spesifistä nanokappaletta (BSR1, BSR3 ja BSR4), joilla on nanomolaarinen sitoutumisaffiniteetti [64]. Nämä tiedot viittaavat siihen, että bambuhaiden immunisointi voi tuottaa korkean affiniteetin nanokappaleita. Kaiken kaikkiaan nanokappaleiden kyky sitoa solun proteiineja ja houkutella FP-fuusioproteiineja mahdollistaa soluprosessien ja -rakenteiden tarkan hallinnan elävissä soluissa. Tämä monitoiminen FP-nanoloukku mahdollistaa mikroskooppiset, biokemialliset ja toiminnalliset analyysit saman proteiinin ainutlaatuisella yhdistelmällä. Taulukossa 3 on yhteenveto FP:ille kohdistetuista nanokehoista.

Taulukko 3. Yhteenveto FP:iin kohdistuvista nanokappaleista.

4. Fluoresoivan proteiininanobodyn sovellukset

4.1. Proteiinin havaitsemisen sovellukset

4.1.1. Solunsisäisten proteiinien havaitseminen

Proteiinin toiminnan ymmärtäminen vaatii luotettavan ja kvantifioitavissa olevan korkearesoluutioisen proteiinin lokalisoinnin. Vaikka vasta-aineiden käyttö kohdeproteiinien leimaamiseen on vakiintunut molekyylibiologiassa, tätä tekniikkaa rajoittaa tavanomaisten vasta-aineiden koko ja moniarvoisuus. Nanokappaleiden pienen koon vuoksi niitä voidaan käyttää merkkiaineina intrasellulaarisessa kuvantamisessa fluoresoivien molekyylien, entsyymien, peptidien, reseptoreiden, biotiinin ja muiden lääkkeiden kanssa ligaation jälkeen. Esimerkiksi FP:tä vastaan ​​olevia nanoaineita käytettiin superresoluutioisessa mikroskopiakuvauksessa, kun ne oli merkitty orgaanisilla väriaineilla [66,67]. Ptk2-solut, jotka jatkuvasti ilmentävät tubuliini YFP:tä, kuvattiin käyttämällä tätä lähestymistapaa, ja resoluutio parannettiin 269 ± 37 Å:iin verrattuna noin 450 Å:ään tavanomaisilla vasta-aineilla.

Nanobody-välitteinen leimaus tarjoaa nopean ja monipuolisen menetelmän leimata lähes kaikki yleisesti saatavilla olevat FP-peräiset fuusiorakenteet kehittyneitä yksimolekyylisiä lokalisaatiomikroskopia (SMLM) -kuvauksia varten. Tarkemmin sanottuna kaksivärinen SMLM voi tutkia minkä tahansa toiminnallisen GFP:n ja RFP:n fuusiokonstruktien subsellulaarista lokalisointia, kun GFP:tä ja RFP:tä vastaan ​​olevia nanobodeja käytetään samanaikaisesti [68]. Siten lukuisia biologisia ongelmia voidaan käsitellä nopeasti käyttämällä kaksiväristä SMLM-kuvausta. Ariotti et ai. ehdotti modulaarista lähestymistapaa entsyymipohjaiseen proteiinileimaukseen, mikä mahdollistaa paremman nopeuden ja näytteenoton solunsisäisten proteiinien jakautumisen analysoimiseksi EM-resoluutioon [7]. Suunnittelemalla GBP4 suoraan modifioituun soijapavun askorbaattiperoksidaasi (APEX) -merkkiin, osoitettiin, että APEX voitiin ohjata mihin tahansa kiinnostavaan GFP-leimatuun proteiiniin. APEX-GBP4-fuusio tarjoaa huomattavan korkearesoluutioisen proteiinin lokalisoinnin organellien aladomeeneihin ja lyhentää merkittävästi aikaa subsellulaaristen proteiinijakaumien karakterisointiin. Lisäksi se mahdollistaa endogeenisilla tasoilla ilmentyneiden GFP-leimattujen proteiinien EM-resoluution.

Työkalulaatikko FP-spesifisiä nanokeinoja koodaavia plasmideja luotiin ja fuusioitiin toiminnallisiin moduuleihin. Tämä työkalupakki mahdollistaa solunsisäisten signalointireittien visualisoinnin ja manipuloinnin elävissä soluissa, mikä laajentaa merkittävästi sen käyttöä in vivo [9]. Näitä ovat fluoresoivat sensorit Ca2+-, H+- ja ATP/ADP:n dynaamiseen visualisointiin sekä oligomeeriset tai heterodimeeriset moduulit, jotka mahdollistavat proteiinien keräämisen tai eristämisen ja kalvokontaktikohtien tunnistamisen organellien välillä. Vuonna 2017 Herce et al. käytti soluun tunkeutuvaa peptidiä (CPP) vasta-aineiden kuljettamiseen suoraan soluihin immunoleimausta ja antigeenimanipulaatiota varten [69]. Rakennettiin järjestelmä, joka käytti hyväkseen syklisen arginiinirikkaan CPP:n suurta affiniteettia RNA:ta kohtaan tumassa. Yhdistämällä syklinen arginiinirikas CPP GFP-nanokappaleeseen, GFP:n uudelleen lokalisoituminen ytimessä voidaan havaita suoraan soluissa (kuvio 5A). Siksi tätä visualisoitua järjestelmää voidaan käyttää proteiinin sijainnin seuraamiseen ja eri CPP:iden tehokkuuden vertailuun kvantitatiivisesti.

Fluoresenssiresonanssienergiansiirtotekniikkaa (FRET) käytetään laajasti life science -tutkimuksessa, koska se mahdollistaa signaalimolekyylien dynaamisen reaaliaikaisen havaitsemisen fysiologisissa olosuhteissa elävissä soluissa. Poikkeuksellisen herkkyytensä ja spesifisyytensä ansiosta aikaresoluutioinen Försterin resonanssienergian siirtoon (TR-FRET) perustuva analyysi on tulossa yhä suositummaksi biolääketieteellisessä tutkimuksessa. Nanobody-pohjainen TR-FRET-menetelmä mahdollistaa fluoresoivien (fuusio)proteiinien helpon kvantifioinnin lysaateissa paljon herkemmin kuin tavanomaiset fluoresenssin intensiteetin lukemat [70].

Kuva 5. Fluoresoivan proteiininanobodyn sovellukset. (A) Proteiini-proteiini-vuorovaikutusten visualisointi. Solua läpäiseviin peptideihin (CPP:ihin) sitoutunut anti-GFP-nanobody (Nb) voi tunkeutua solun tumaan. Jos GFP-merkitty proteiini ei ole vuorovaikutuksessa RFP-merkityn proteiinin kanssa, vain GFP-merkitty proteiini lokalisoituu uudelleen tumaan Nb-CPP:n kautta ja näyttää vihreää väriä. Kuitenkin, jos nämä kaksi proteiinia ovat vuorovaikutuksessa, molemmat proteiinit lokalisoituvat uudelleen ytimeen osoittaen keltaista väriä. (B) GFP-nanobody mahdollistaa vasta eksosytoituneiden vesikkeliproteiinien selektiivisen leimaamisen. Vaihe 1: Vesikkeliproteiini kytketään GFP:hen ja inkuboidaan ei-fluoresoivan nanobodyn (NbGFP) kanssa, mikä johtaa siihen, että GFP ei ole saavutettavissa fluoresenssia sitovan nanokappaleen (NbGFP*) kanssa. Vaiheet 2 ja 3: Solun eksosytoosin stimulaation jälkeen uusi vesikkeliproteiini altistetaan plasmakalvolle ja voidaan leimata NbGFP:llä*. (C) Kaaviokuva huonontuneesta. Proteiinien selektiivinen hajoaminen tapahtuu ubikvitiinireitin kautta, jonka suorittaa monimutkainen sarja entsyymejä. SKP1-CUL1-F-box-proteiiniligaasikompleksien (SCF:t) F-box-proteiini (FBP) on fuusioitu anti-GFP-nanokappaleeseen (Nb) GFP-fuusioproteiinin tunnistamiseksi, ja ubikvitiinikonjugoiva entsyymi (E2) yhdistää kovalenttisesti useita ubikitiinimolekyylejä kohdeproteiiniin. Tämän jälkeen proteasomi hajottaa polyubikvitinoituneen proteiinin. (D) BiCAP:n kaavamainen kuvaus. HER-proteiini fuusioidaan GFP:n N-terminaalisiin (GFP1) tai C-terminaalisiin (GFP2) fragmentteihin. Kun nämä kaksi fuusiota muodostavat dimeerin, GFP laskostuu uudelleen ja fluoresoi. HER-dimeeri ja sen vuorovaikutuksessa olevat proteiinit rikastetaan sitten käyttämällä GFP-nanobodya, jolla ei ole sitoutumiskykyä GFP-fragmentteihin ja siten mahdollistaa dimeerin eristämisen. (E) GFP-riippuvainen transkriptiojärjestelmä. DNA:ta sitova domeeni (DBD) ja aktivaatiodomeeni (AD) on fuusioitu GFP-nanobody 1:n (Nb1) ja GFP-nanobodyn 2 (Nb2) kanssa, vastaavasti. GFP:n läsnä ollessa DBD-Nb1 ja AD-Nb2 voivat aktivoida ylävirran aktivointisekvenssin (UAS) reportterigeenin, mikä johtaa kohdegeenien lisääntymiseen. (F) GFP-leimattujen proteiinien tunnistaminen DNA:n nanorakenteissa. DNA-nanorakenteet, joissa on kaksi sitoutumiskohtaa, ligoidaan magneettihartsiin, sidotaan GFP-nanobodyn (Nb) kanssa komplementaarisella emäsparilla ja inkuboidaan sitten GFP-leimattujen proteiinien kanssa. Näin ollen GFP-leimattuja proteiineja voidaan kiinnittää tarkasti nanorakenteisiin.

Kuva 5. Jatk.

4.1.2. Proteiinien havaitseminen solun pinnalla

Bakteeripinnan näyttö on lupaava tekniikka soluankkuroitujen proteiinien tuottamiseen ja kokosolukatalyyttien suunnitteluun. Vaikka pintanäytössä käytetään erilaisia ​​ulkokalvoproteiineja, ei ole saatavilla yksinkertaisia, universaaleja ja suuren suorituskyvyn yhteensopivia menetelmiä pintanäyttöjärjestelmien arvioimiseksi ja kehittämiseksi. Lisäksi on haastavaa erottaa solunsisäiset ja pinnalla näkyvät proteiinit. Wendel et ai. rakensi fluoresenssipohjaisen pintanäytön havaitsemisjärjestelmän yhdistämällä GFP-nanobodyn ulkokalvon ankkureihin [71]. Kaksi yleisesti käytettyä ulkokalvoproteiinia valittiin ankkureiksi: ulkokalvoproteiini A (OmpA) ja autotransportteri (C-IgAP). Tästä syystä kaksi erilaista näyttömoduulia rakennetaan yhdistämällä OmpA tai C-IgAP GFP-spesifisiin nanokappaleisiin, jotka visualisoidaan lisäämällä puhdistettua GFP:tä ulkoisesti. Vaikka itse GFP voidaan näyttää solun pinnalla, tällä uudella menetelmällä vältetään väärien positiivisten tulosten ongelma, koska vain jos GFP sitoutuu solun pinnalla olevaan nanokappaleeseen, solut voivat tuottaa fluoresoivan signaalin. Määritys on yhteensopiva monien fluoresenssin havaitsemismenetelmien kanssa, mukaan lukien koko solun fluoresenssin havaitseminen levyllä, geelin sisäinen fluoresenssi, mikroskopia ja virtaussytometria. Tämä edullinen ja helposti luettava pintaesitysmenetelmä auttaa havainnollistamaan proteiinien kuljetusmekanismia elävien solujen pinnalle, mikä mahdollistaa bakteeripinnan näyttöjärjestelmien ja kestävien kokosolubiokatalyyttien järkevän kehittämisen tulevaisuudessa.

Välittäjäaineiden vapautuminen vaatii eksosytoosia, endosytoosia ja uusien fuusiorakkuloiden muodostumista. Mitä vesikkeliproteiineille tapahtuu eksosytoosin jälkeen, kun ne jätetään plasmakalvolle, ymmärretään huonosti. Nämä proteiinit on usein konjugoitu pH-herkkiin GFP-osiin (fluoriin). Koska pH-luoriinikuvausta rajoittaa yleensä vesikkelejä useaan kertaan suurempien täplien diffraktio, anti-GFP-nanokappaleiden käyttö eksosytoituneiden vesikkelien selektiiviseen leimaamiseen on arvokasta [72]. Yhdistämällä anti-GFP-nanokappaleita kemiallisiin fluoroforeihin, jotka soveltuvat superresoluutiokuvaukseen, pHluoriinilla leimattujen proteiinien koko ja intensiteetti eri olosuhteissa voidaan havaita tavoilla, jotka eivät ole mahdollisia pelkästään pHluoriinilla. Eksosytoosia stimuloitaessa uudet vesikkeliproteiinit altistuvat plasmakalvolle, ja sitten fluoresoivasti leimatut nanokappaleet sitoutuvat pH-luoriiniin (kuvio 5B). Siten nanobody-pohjainen pHluoriinin havaitseminen on lupaava työkalu eksosytoosin jälkeisten tapahtumien tutkimiseen hermosoluissa.

4.2. Sovellukset proteiinimolekyylien kohdennetussa hajotuksessa

Verrattuna geenien muokkaukseen ja RNA-interferenssiin, biomolekyylien suora manipulointi proteiinitasolla on tehokkaampi reitti proteiinien toiminnan tutkimuksiin, jotka ylittävät rajoitukset, kuten mahdolliset kohteen ulkopuoliset vaikutukset, geenin inaktivoituminen ja olennaisen geenin fenotyyppisen toiminnan menettäminen. Kohdennettu proteiinien hajottaminen on tällä hetkellä tärkeä tutkimusstrategia kiinnostavien proteiinien toiminnan menetyksen ja proteolyysin saavuttamiseksi. Nanobody-pohjainen proteiinihajottaja voi auttaa saavuttamaan kiinnostavien proteiinien nopean hajoamisen ja palautuvan säätelyn. Caussinus et ai. kehitti proteiinien hajoamismenetelmän kohde-GFP-fuusioproteiinien suoraa ja nopeaa poistamista varten missä tahansa eukaryoottijärjestelmässä [73]. Lyhyesti sanottuna GFP-fuusioproteiinin kumoamiseksi anti-GFP-nanobody fuusioidaan F-box-proteiiniin (FBP) SKP1-CUL1-F-box-proteiinin (SCF) E3-ligaasikomplekseissa. tunnistamaan GFP-fuusioproteiini. Ubikitiinikonjugoiva entsyymi (E2) liittää kovalenttisesti useita ubikitiinimolekyylejä kohde-GFP-fuusioproteiiniin. Tämän jälkeen SCF-kompleksi hajottaa polyubikvitinoidun proteiinin; siten kohdeproteiinin poistamista on helppo seurata (kuvio 5C). Tätä tekniikkaa, jota kutsutaan nimellä degrade green fluorescent protein (deGradFP), on käytetty GFP:n ja sen fuusioiden hajottamiseen nisäkässoluissa, seeprakalan alkioissa [74] ja kasveissa [75].

4.3. Sovellukset Bimolecular Complementation Affinity Purification System -järjestelmässä

Vuonna 2016 Croucher et al. kehitti bimolekulaarisen komplementaatioaffiniteettipuhdistusjärjestelmän (BiCAP), joka pystyy tehokkaasti erottamaan ihmisen epidermaalisen kasvutekijäreseptorin (HER) dimeerin (homologisen ja heterologisen) monomeerista [76]. Tässä järjestelmässä FP-molekyylin kaksi komplementaarista fragmenttia fuusioidaan kahden HER-proteiinin (HER1, HER2 tai HER3) kanssa. Näitä kahta fragmenttia ei voida koota spontaanisti aktiivisiksi fluoresoiviksi proteiineiksi. Oletetaan kuitenkin, että nämä kaksi HER-proteiinia ovat vuorovaikutuksessa toistensa kanssa. Siinä tapauksessa nämä kaksi fragmenttia ovat spatiaalisesti lähellä toisiaan ja täydentävät toisiaan ja muodostavat ne uudelleen täydelliseksi ja aktiiviseksi fluoresoivaksi proteiiniksi (kuvio 5D). HER-dimeeriä ja sen vuorovaikutuksessa olevia proteiineja voidaan rikastaa käyttämällä GFP-nanobodya, jolla ei ollut affiniteettia GFP-fragmentteihin, mikä mahdollistaa dimeerin eristämisen ja rikastamisen. Analysoimalla tunnistettuja proteiineja paljastui, että kolmella dimeerillä (HER2:HER2, HER2:HER3 ja HER1:HER2) on yhteisiä vuorovaikutuksessa olevia proteiineja ja niiden spesifinen vuorovaikutus. FAM59A, proteiini, joka oli spesifisesti vuorovaikutuksessa HER1:HER3-dimeerin kanssa, välitti solunulkoisen signaalin säätelemän kinaasireitin aktivoitumista ja tarjosi uuden kohteen rintasyövän hoidolle.

cistanche-kasveja lisäävä immuunijärjestelmä

4.4 Sovellukset muilla alueilla

Taudin varhainen in vitro -diagnoosi ja terapeuttisten vaikutusten seuranta on suuri ongelma sairauden diagnosoinnissa. Ihanteellisella varjoaineella tulisi olla hyvä kudosten tunkeutuminen, korkea antigeeniaffiniteetti ja nopea puhdistumakyky normaalien kudosten minimaalisella vauriolla. Nanokehot voivat olla ihanteellisia kuvantamisaineita, jotka voivat ylittää verisuonet ja päästä kudoksiin paremman kuvantamisen ja terapeuttisten sovellusten vuoksi.

FP:t eivät ainoastaan ​​valaise soluja ja biologisia prosesseja, vaan myös muodostavat erinomaisia ​​telineitä, koska niillä ei ole ilmeistä yhteyttä lukuisiin isäntäproteiiniverkkoihin. Käyttämällä GBP:tä ja GFP:tä telineenä ohjaamaan biologisesti aktiivista kompleksin muodostumista, Tang et ai. loi kirjaston hybriditranskriptiotekijöitä, jotka yksinomaan säätelevät geenin ilmentymistä GFP:n ja sen johdannaisten läsnä ollessa [77]. GFP:n tuotanto säätelee soluspesifisten geenien ilmentymistä (kuvio 5E) ja edistää hiiren verkkokalvon ja aivojen toimintahäiriöitä. Lisäksi GFP-siirtogeenisiä hiiriä ja seeprakalakantoja modifioidaan GFP-riippuvaisen transkription saavuttamiseksi hermopiirien fotogeneettistä seurantaa varten. Tämä työ vahvistaa GFP:n aseman monipuolisena telineenä ja avaa oven erilaisten GFP-merkittyjen solujen selektiiviseen manipulointiin siirtogeenisissä kannoissa. Tämän perusteella voidaan kehittää myös muita solunsisäisiä tuotteita soluspesifisiksi tukirakenteiksi monisoluisissa organismeissa.

DNA:n nanorakenteista on tullut olennainen ja tehokas työkalu entsyymitoiminnan ja proteiinien toiminnan tutkimiseen. On kuitenkin vaikeaa kehittää universaaleja strategioita proteiinikompleksien muodostamiseksi DNA-nanorakenteiden päälle. Yksi vaikeuksista on kiinnostavien proteiinien kiinnittäminen DNA:n nanorakenteisiin. Sommese et ai. ehdotti uutta lähestymistapaa DNA-nanorakenteiden leimaamiseen [78]. Funkcionalisoimalla ne GFP-nanobodylla proteiinin kiinnittymiskykyä voidaan ohjata tarkasti (kuva 5F). Verrattuna GFP-spesifisiin DNA-aptameereihin, nanokappaleilla on korkeampi spesifisyys, stabiilisuus ja affiniteetti GFP:tä kohtaan. Siksi DNA-nanorakenteiden soveltamista ohjelmoitavana tukikehyksenä biologisessa tutkimuksessa on yksinkertaistettu dramaattisesti yhdistämällä DNA-nanorakenteet soluissa, kehitysbiologiassa ja proteiinien biokemiassa yleisesti esiintyviin FP:ihin.

5. Keskustelu tulevaisuuden näkymistä

Perinteisiin vasta-aineisiin verrattuna nano-aineilla on paremmat fysikaaliset ja kemialliset ominaisuudet ja niitä on helpompi ilmentää ja seuloa. Nano-aineet ovat rakenteeltaan paljon yksinkertaisempia kuin perinteiset vasta-aineet. Niitä koodaa yksi geeni, ja mikro-organismit voivat helposti tuottaa niitä, mikä vähentää merkittävästi tuotantokustannuksia. Vaikka nanoaineet tarjoavat läpimurron vasta-ainetutkimukselle, joitain ongelmia on vielä ratkaistava. Toisaalta niiden haittapuolena on epämukava toiminta ja eläinten immunisoinnin korkeat kustannukset. Lisäksi, koska HCAb ja IgNAR ovat runsaasti perifeerisen veren monosyyteissä, FP-antigeeneihin kohdistuvat nanoaineet seulotaan yleensä spesifisistä Camelidae- tai haiden immuunikirjastoista. Kirjastojen rakentamisen ja nanokehitysteknologian kypsyessä FP-spesifisten nanokappaleiden seulonta synteettisistä kirjastoista on uusi suunta, joka voittaa eläinten immunisoinnin haitat, lyhentää koeaikaa ja vähentää merkittävästi kustannuksia. Toisaalta, vaikka nanokappaleiden seulonta ja ilmentäminen on suhteellisen yksinkertaista, FP-nanokappaleiden saaminen mahdollisilla käyttöarvoilla on erittäin monimutkainen prosessi. Faagi-nanobodykirjastojen seulonnassa ei voida välttää vääriä positiivisia tuloksia, jotka johtuvat filamenttifaagin pinnan sitoutumisesta antigeeniin, kun taas hiiva- ja bakteeri-nanobodykirjastojen pieni kapasiteetti on toinen vaikea ongelma nanoaineseulonnassa.

Nanokappaleiden sovellukset FP:tä vastaan ​​lisääntyvät edelleen tulevaisuudessa. (1) Intrasellulaarisen vasta-aineteknologian kehittymisen myötä solunsisäisten molekyylien havaitseminen elävistä soluista on tullut saavutettavaksi. Nanoaineilla on tässä suhteessa ainutlaatuisia etuja, sillä (i) nanokappale on pieni ja solujen sisäänpääsyn tehokkuus on paljon suurempi kuin perinteisten vasta-aineiden; ja (ii) nanobody voidaan ilmentää ja toimia elävissä soluissa. (2) Bispesifinen nanobody on eräänlainen keinotekoisesti muunneltu vasta-aine, joka voi spesifisesti sitoa kahta eri antigeeniä samanaikaisesti. Se voidaan helposti rakentaa yksiarvoisista nano-aineista ja ilmentää mikro-organismeissa. Tästä syystä FP:n vastaiset nanobodit tarjoavat laajan sovellusmahdollisuuden bispesifiselle nanokehitykselle.

6. Johtopäätökset

Tässä artikkelissa tarkastellaan FP:iden alkuperää, rakennetta ja ominaisuuksia. Myös FP:hen kohdistuvat monoklonaaliset vasta-aineet ja nano-aineet ja niiden sovellukset esitetään yhteenvetona. Vaikka vasta-aineet ovat arvokkaita työkaluja biologisten komponenttien näyttämiseen immobilisoiduissa soluissa, perinteisten vasta-aineiden käyttöä elävissä soluissa rajoittaa niiden vaihtelevien raskas- ja kevytketjujen tehoton laskostuminen ja kokoaminen. Vasta-aineiden suora mikroinjektio on ensisijainen menetelmä vasta-aineiden solunsisäisissä sovelluksissa, mikä on teknisesti haastavaa ja stressaavaa soluille. Kamelista tai haista peräisin olevat yhden domeenin vasta-aineet tunnistavat antigeenit raskasketjujen vaihtelevien domeeniensa kautta. Nämä pienet ja vakaat nanokappaleet voivat ilmetä ja toimia elävissä soluissa. Siksi FP:ille suunnattujen nanokappaleiden luominen tekee niistä arvokkaampia biologisessa tutkimuksessa.

Viitteet

1. Muyldermans, S. Nanobodies: Natural Single-Domain Antibodies. Annu. Rev. Biochem. 2013, 82, 775–797. [CrossRef] [PubMed]

2. Helma, J.; Cardoso, MC; Muyldermans, S.; Leonhardt, H. Nanobodies and rekombinantti sideaineet solubiologiassa. J. Cell Biol. 2015, 209, 633–644. [CrossRef] [PubMed]

3. Ashour, J.; Schmidt, FI; Hanke, L.; Cragnolini, J.; Cavallari, M.; Altenburg, A.; Brewer, R.; Ingram, J.; Shoemaker, C.; Ploegh, HL Influenssaviruksen nukleoproteiinille spesifisten kamelieläinten yksidomeenivasta-aineiden solunsisäinen ilmentyminen paljastaa sen nukleaarisen lokalisoinnin erityispiirteet. J. Virol. 2015, 89, 2792–2800. [CrossRef] [PubMed]

4. Manglik, A.; Kobilka, BK; Steyaert, J. Nanobodies to Study G Protein-Coupled Receptor Structure and Function. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2017, 57, 19–37. [CrossRef]

5. Harmansa, S.; Hamaratoglu, F.; Affolter, M.; Caussinus, E. Dpp:n leviäminen tarvitaan mediaaliseen, mutta ei lateraaliseen siipilevyn kasvuun. Luonto 2015, 527, 317–322. [CrossRef]

6. Yamagata, M.; Sanes, JR Reporter–nanobody-fuusiot (RANbodies) monipuolisina, pieninä, herkkinä immunohistokemiallisina reagensseina. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2018, 115, 2126–2131. [CrossRef]

7. Ariotti, N.; Hall, TE; Rae, J.; Ferguson, C.; McMahon, K.-A.; Martel, N.; Webb, RE; Webb, RI; Teasdale, RD; Parton, RG GFP-leimattujen proteiinien modulaarinen havaitseminen nopeaa seulontaa varten elektronimikroskopialla soluissa ja organismeissa. Dev. Cell 2015, 35, 513–525. [CrossRef]

8. Früholz, S.; Fäßler, F.; Kolukisaoglu, Ü.; Pimpl, P. Nanokehan laukaisema VSR:ien lukitus paljastaa ligandin uudelleenlataamisen Golgissa. Nat. Commun. 2018, 9, 643. [CrossRef]

9. Prole, DL; Taylor, CW Geneettisesti koodattu työkalusarja funktionalisoituja nanobodia fluoresoivia proteiineja vastaan ​​solunsisäisen signaloinnin visualisointiin ja manipulointiin. BMC Biol. 2019, 17, 41. [CrossRef]

10. Shimomura, O.; Johnson, FH; Saiga, Y. Aequorinin, bioluminesoivan proteiinin, uuttaminen, puhdistus ja ominaisuudet Aequorea-valaisevasta hydromedusanista. J. Cell. Comp. Physiol. 1962, 59, 223–239. [CrossRef]

11. Prasher, D.; McCann, RO; Cormier, MJ. Aequoriinia, bioluminesoivaa kalsiumia sitovaa proteiinia koodaavan cDNA:n kloonaus ja ilmentäminen. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1985, 126, 1259–1268. [CrossRef]

12. Heim, R.; Prasher, DC; Tsien, RY Vihreän fluoresoivan proteiinin aallonpituusmutaatiot ja translaation jälkeinen autoksidaatio. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994, 91, 12501–12504. [CrossRef]

13. Matz, M.; Fradkov, AF; Labas, YA; Savitsky, A.; Zaraisky, AG; Markelov, ML; Lukyanov, SA Fluoresoivat proteiinit ei-bioluminoivista Anthozoa-lajeista. Nat. Biotechnol. 1999, 17, 969-973. [CrossRef]

14. Park, N.; Song, J.; Jeong, S.; Tran, TT; Ko, HW; Kim, EY Vacciniaan liittyvä kinaasi 3 (VRK3) asettaa vuorokausijakson ja amplitudin vaikuttamalla kelloproteiinien subsellulaariseen sijaintiin nisäkässoluissa. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2017, 487, 320–326. [CrossRef]

15. Zhao, D.; Xue, C.; Lin, S.; Shi, S.; Li, Q.; Liu, M.; Cai, X.; Lin, Y. Notch Signaling Pathway säätelee angiogeneesiä endoteelisolujen kautta 3D-yhteiskulttuurimallissa. J. Cell. Physiol. 2016, 232, 1548–1558. [CrossRef]

16. Rodriguez, EA; Campbell, RE; Lin, JY; Lin, MZ; Miyawaki, A.; Palmer, AE; Shu, X.; Zhang, J.; Tsien, RY Fluoresoivien ja fotoaktiivisten proteiinien kasvava ja hehkuva työkalupakki. Trends Biochem. Sci. 2017, 42, 111–129. [CrossRef]

17. Yang, F.; Moss, LG; Phillips, GN, Jr. Vihreän fluoresoivan proteiinin molekyylirakenne. Nat. Biotechnol. 1996, 14, 1246–1251. [CrossRef]

18. Ormö, M.; Cubitt, AB; Kallio, K.; Gross, LA; Tsien, RY; Remington, SJ Aequorea victorian vihreän fluoresoivan proteiinin kristallirakenne. Science 1996, 273, 1392–1395. [CrossRef]

19. Reid, BG; Flynn, GC:n kromoforin muodostuminen vihreässä fluoresoivassa proteiinissa. Biochemistry 1997, 36, 6786-6791. [CrossRef]

20. Zhang, G.; Gurtu, V.; Kain, SR Tehostettu vihreä fluoresoiva proteiini mahdollistaa geeninsiirron herkän havaitsemisen nisäkässoluissa. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996, 227, 707-711. [CrossRef]

21. Pédelacq, J.-D.; Cabantous, S.; Tran, T.; Terwilliger, T.; Waldo, GS Superkansion vihreän fluoresoivan proteiinin suunnittelu ja karakterisointi. Nat. Biotechnol. 2006, 24, 79–88. [CrossRef] [PubMed]

22. Crameri, A.; Whitehorn, EA; Tate, E.; Stemmer, WP parantanut vihreää fluoresoivaa proteiinia Molecular Evolutionilla käyttämällä DNA-sekoitusta. Nat. Biotechnol. 1996, 14, 315-319. [CrossRef] [PubMed]

23. Miura, H.; Inoko, H.; Inoue, I.; Tanaka, M.; Sato, M.; Ohtsuka, M. Yksinkertainen kloonausstrategia käyttäen GFPuv-geeniä positiivisena/negatiivisena indikaattorina. Anaali. Biochem. 2011, 416, 237–239. [CrossRef] [PubMed]

24. Mena, MA; Treynor, TP; Mayo, SL; Daugherty, PS Blue fluoresoivia proteiineja, joilla on parannettu kirkkaus ja valonkestävyys rakenteellisesti kohdistetusta kirjastosta. Nat. Biotechnol. 2006, 24, 1569–1571. [CrossRef] [PubMed]

25. Ai, H.; Shaner, N.; Cheng, Z.; Tsien, RY; Campbell, RE Uusien kromoforirakenteiden tutkiminen johtaa parempien sinistä fluoresoivien proteiinien tunnistamiseen. Biochemistry 2007, 46, 5904–5910. [CrossRef]

26. Subach, OM; Gundorov, IS; Yoshimura, M.; Subach, FV; Zhang, J.; Grüenwald, D.; Souslova, EA; Chudakov, DM; Verkhusha, VV Punaisen fluoresoivan proteiinin muuntaminen kirkkaan siniseksi koettimeksi. Chem. Biol. 2008, 15, 1116–1124. [CrossRef]

27. Merzlyak, E.; Goedhart, J.; Shcherbo, D.; Bulina, ME; Shcheglov, AS; Fradkov, AF; Gaintzeva, A.; Lukyanov, K.; Lukyanov, S.; Gadella, T.; et ai. Kirkkaan monomeeripunainen fluoresoiva proteiini, jolla on pidempi fluoresenssin käyttöikä. Nat. Methods 2007, 4, 555–557. [CrossRef]

28. Cubitt, AB; Heim, R.; Adams, SR; Boyd, AE; Gross, LA; Tsien, RY Vihreiden fluoresoivien proteiinien ymmärtäminen, parantaminen ja käyttö. Trends Biochem. Sci. 1995, 20, 448–455. [CrossRef]

29. Tomosugi, W.; Matsuda, T.; Tani, T.; Nemoto, T.; Kotera, I.; Saito, K.; Horikawa, K.; Nagai, T. Ultramariinifluoresoiva proteiini, jolla on lisääntynyt valostabiilisuus ja pH-herkkyys. Nat. Methods 2009, 6, 351–353. [CrossRef]

30. Goedhart, J.; van Weeren, L.; Hink, MA; Vischer, NOE; Jalink, K.; Gadella, TWJ Kirkkaan syaanin fluoresoivan proteiinin variantit tunnistettu fluoresenssin elinkaaren seulonnalla. Nat. Methods 2010, 7, 137–139. [CrossRef]

31. Day, RN; Davidson, MW Fluoresoiva proteiinipaletti: työkalut solukuvaukseen. Chem. Soc. Rev. 2009, 38, 2887–2921. [CrossRef]

32. Griesbeck, O.; Baird, GS; Campbell, RE; Zacharias, DA; Tsien, RY Keltaisen fluoresoivan proteiinin ympäristöherkkyyden vähentäminen. J. Biol. Chem. 2001, 276, 29188–29194. [CrossRef]

33. Nagai, T.; Ibata, K.; Park, ES; Kubota, M.; Mikoshiba, K.; Miyawaki, A. Variantti keltaisesta fluoresoivasta proteiinista, jossa on nopea ja tehokas kypsyminen solubiologisiin sovelluksiin. Nat. Biotechnol. 2002, 20, 87–90. [CrossRef]

34. Shaner, NC; Campbell, RE; Steinbach, PA; Giepmans, BN; Palmer, AE; Tsien, RY Parannetut monomeeriset punaiset, oranssit ja keltaiset fluoresoivat proteiinit, jotka on johdettu Discosoma sp. punainen fluoresoiva proteiini. Nat. Biotechnol. 2004, 22, 1567–1572. [CrossRef]

35. Shcherbo, D.; Merzlyak, EM; Chepurnykh, TV; Fradkov, AF; Ermakova, GV; Solovieva, EA; Lukyanov, KA; Bogdanova, EA; Zaraisky, AG; Lukyanov, S.; et ai. Kirkkaan punaisena fluoresoivaa proteiinia koko kehon kuvantamiseen. Nat. Methods 2007, 4, 741–746. [CrossRef]

36. Shcherbo, D.; Murphy, CS; Ermakova, GV; Solovieva, EA; Chepurnykh, TV; Shcheglov, AS; Verkhusha, V.; Pletnev, VZ; Hazelwood, KL; Roche, PM; et ai. Kaukanpunaiset fluoresoivat tunnisteet proteiinikuvaukseen elävissä kudoksissa. Biochem. J. 2009, 418, 567–574. [CrossRef]

37. Oliinyk, OS; Chernov, KG; Verkhusha, VV:n bakteerifytokromit, syanobakteerikromit ja allofykosyaniinit lähi-infrapunafluoresoivien koettimien lähteenä. Int. J. Mol. Sci. 2017, 18, 1691. [CrossRef]

38. Shu, X.; Royant, A.; Lin, MZ; Aguilera, TA; Lev-Ram, V.; Steinbach, PA; Tsien, RY Bakteerifytokromista valmistettujen infrapunafluoresoivien proteiinien ilmentyminen nisäkkäissä. Tiede 2009, 324, 804–807. [CrossRef]

39. Yu, D.; Gustafson, WC; Han, C.; Lafaye, C.; Noirclerc-Savoye, M.; Ge, W.-P.; Thayer, DA; Huang, H.; Kornberg, TB; Royant, A.; et ai. Parannettu monomeerinen infrapunafluoresoiva proteiini hermosolujen ja kasvainten aivojen kuvantamiseen. Nat. Commun. 2014, 5, 3626. [CrossRef]

40. Yu, D.; Baird, MA; Allen, JR; Howe, ES; Klassen, kansanedustaja; Reade, A.; Makhijani, K.; Song, Y.; Liu, S.; Murthy, Z.; et ai. Luonnollisesti monomeerinen infrapunafluoresoiva proteiini proteiinien leimaamiseen in vivo. Nat. Methods 2015, 12, 763–765. [CrossRef]

41. Shcherbakova, DM; Balaban, M.; Emelyanov, AV; Brenowitz, M.; Guo, P.; Verkhusha, VV Kirkkaat monomeeriset lähi-infrapunafluoresoivat proteiinit tunnisteina ja biosensoreina moniskaalakuvaukseen. Nat. Commun. 2016, 7, 12405. [CrossRef] [PubMed]

42. Rodriguez, EA; Tran, GN; Gross, LA; Crisp, JL; Shu, X.; Lin, JY; Tsien, RY Kaukopunainen fluoresoiva proteiini kehittyi syanobakteerien fykobiliproteiinista. Nat. Methods 2016, 13, 763–769. [CrossRef] [PubMed]

43. Oliinyk, OS; Shemetov, AA; Pletnev, S.; Shcherbakova, DM; Verkhusha, VV Pienin lähi-infrapunafluoresoiva proteiini kehittyi syanobakteriokromista monipuoliseksi tunnisteeksi spektrin multipleksointiin. Nat. Commun. 2019, 10, 279. [CrossRef]

44. Oliinyk, OS; Balaban, M.; Clark, CL; Carey, E.; Pletnev, S.; Nimmerjahn, A.; Verkhusha, VV Yksidomeenin lähi-infrapunaproteiini tarjoaa tukikehyksen antigeeniriippuvaisille fluoresoiville nanokappaleille. Nat. Methods 2022, 19, 740–750. [CrossRef] [PubMed]

45. Tiller, KE; Tessier, PM edistyy vasta-ainesuunnittelussa. Annu. Rev. Biomed. Eng. 2015, 17, 191–216. [CrossRef]

46. ​​Gengyo-Ando, ​​K.; Mitani, S. 1020 Vihreän fluoresoivan proteiinin (GFP) vastaisen monoklonaalisen vasta-aineen tuotanto ja karakterisointi. Neurosci. Res. 1997, 28, S122. [CrossRef]

47. Zhuang, R.; Zhang, Y.; Zhang, R.; Song, C.; Yang, K.; Yang, A.; Jin, B. GFP-fuusioproteiinien puhdistus korkealla puhtaudella ja saannolla monoklonaalisella vasta-aineella kytketyllä affiniteettipylväskromatografialla. Protein Expr. Purif. 2008, 59, 138–143. [CrossRef]

48. Ward, ES; Güssow, D.; Griffiths, AD; Jones, PT; Winter, G. Escherichia colista erittyneiden yksittäisten immunoglobuliinin variaabelidomeenien valikoiman sitomisaktiivisuudet. Nature 1989, 341, 544–546. [CrossRef]

49. Hamers-Casterman, C.; Atarhouch, T.; Muyldermans, S.; Robinson, G.; Hammers, C.; Songa, EB; Bendahman, N.; Hammers, R. Luonnossa esiintyvät vasta-aineet, joissa ei ole kevyitä ketjuja. Nature 1993, 363, 446–448. [CrossRef]

50. Greenberg, AS; Avila, D.; Hughes, M.; Hughes, A.; McKinney, EC; Flajnik, MF Uusi antigeenireseptorigeeniperhe, joka käy läpi uudelleenjärjestelyn ja laajan somaattisen monipuolistumisen haissa. Nat. Cell Biol. 1995, 374, 168-173. [CrossRef]

51. De Meyer, T.; Muyldermans, S.; Depicker, A. Nanobody-pohjaiset tuotteet tutkimus- ja diagnostiikkatyökaluina. Trends Biotechnol. 2014, 32, 263–270. [CrossRef]

52. Skerra, A. Vaihtoehtoiset ei-vasta-ainetelineet molekyylien tunnistamiseen. Curr. Opin. Biotechnol. 2007, 18, 295–304. [CrossRef]

53. Muyldermans, S.; Baral, T.; Retamozzo, VC; De Baetselier, P.; De Genst, E.; Kinne, J.; Leonhardt, H.; Magez, S.; Nguyen, V.; Revets, H.; et ai. Kamelieläinten immunoglobuliinit ja nanobody-tekniikka. Veter. Immunol. Immunopatoli. 2009, 128, 178–183. [CrossRef]

54. Rothbauer, U.; Zolghadr, K.; Tillib, S.; Nowak, D.; Schermelleh, L.; Gahl, A.; Backmann, N.; Conrath, K.; Muyldermans, S.; Cardoso, MC; et ai. Antigeenien kohdistaminen ja jäljitys elävissä soluissa fluoresoivilla nanokappaleilla. Nat. Methods 2006, 3, 887–889. [CrossRef]

55. Kubala, MH; Kovtun, O.; Aleksandrov, K.; Collins, BM GFP:n rakenne- ja termodynaaminen analyysi: GFP-nanobody-kompleksi. Protein Sei. 2010, 19, 2389–2401. [CrossRef]

56. Fang, Z.; Cao, D.; Qiu, J. Nanokappaleiden kehittäminen ja tuotanto erityisesti vihreää fluoresenssiproteiinia vastaan. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2020, 104, 4837–4848. [CrossRef]

57. Kirchhofer, A.; Helma, J.; Schmidthals, K.; Frauer, C.; Cui, S.; Karcher, A.; Pellis, M.; Muyldermans, S.; Casas-Delucchi, CS; Cardoso, MC; et ai. Proteiiniominaisuuksien modulointi elävissä soluissa nano-kehikon avulla. Nat. Rakenne. Mol. Biol. 2009, 17, 133–138. [CrossRef]

58. Rothbauer, U.; Zolghadr, K.; Muyldermans, S.; Schepers, A.; Cardoso, MC; Leonhardt, H. Monipuolinen nanoloukku biokemiallisiin ja funktionaalisiin tutkimuksiin fluoresoivien fuusioproteiinien kanssa. Mol. Cell. Proteom. 2008, 7, 282–289. [CrossRef]

59. Fridy, P.; Li, Y.; Keegan, S.; Thompson, MK; Nudelman, I.; Scheid, JF; Oeffinger, M.; Nussenzweig, MC; Fenyö, D.; Chait, BT; et ai. Vankka putki monipuolisten nanobody-ohjelmistojen nopeaan tuotantoon. Nat. Methods 2014, 11, 1253–1260. [CrossRef]

60. Zhang, Z.; Wang, Y.; Ding, Y.; Hattori, M. Anti-GFP nanobody tandemien rakennepohjainen suunnittelu ultrakorkean affiniteetin reagensseina puhdistukseen. Sci. Rep. 2020, 10, 6239. [CrossRef]

61. Twair, A.; Al-Okla, S.; Zarkawi, M.; Abbady, AQ Superfolder GFP -fuusioproteiineille spesifisten kamelin nanokappaleiden karakterisointi. Mol. Biol. Rep. 2014, 41, 6887–6898. [CrossRef] [PubMed]

62. Zhong, P.; Wang, Z.; Cheng, S.; Zhang, Y.; Jiang, H.; Liu, R.; Ding, Y. Rakenteellisia näkemyksiä kahdesta erillisestä nanokappaleesta, jotka tunnistavat saman vihreän fluoresoivan proteiinin epitoopin. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2021, 565, 57–63. [CrossRef] [PubMed]

63. Zhou, X.; Hao, R.; Chen, C.; Su, Z.; Zhao, L.; Luo, Z.; Xie, W. Nanobodies/VHH:iden nopea toimittaminen eläviin soluihin ekspressoimalla in vitro -transkriptoitua mRNA:ta. Mol. Ther.-Methods Clin. Dev. 2020, 17, 401–408. [CrossRef] [PubMed]

64. Wei, L.; Wang, M.; Xiang, H.; Jiang, Y.; Gong, J.; Su, D.; Al Azad, MAR; Dong, H.; Feng, L.; Wu, J.; et ai. Bambuhai pieneläinmallina yhden alueen vasta-aineiden tuotantoon. Edessä. Bioeng. Biotechnol. 2021, 9, 792111. [CrossRef]

65. Li, S.; Shan, H.; Wang, T.; Zheng, X.; Shi, M.; Chen, B.; Lu, H.; Zhang, Y.; Zhao, S.; Hua, Z. Generation of mWasabi fluoresoiva proteiinia sitovia nanobodies. Anaali. Biochem. 2020, 608, 113875. [CrossRef]

66. Ries, J.; Kaplan, C.; Platonova, E.; Eghlidi, HM; Ewers, H. Yksinkertainen, monipuolinen menetelmä GFP-pohjaiseen superresoluutiomikroskooppiin nanokappaleiden kautta. Nat. Methods 2012, 9, 582–584. [CrossRef]

67. Beghein, E.; Getamans, J. Nanobody Technology: Monipuolinen työkalusarja mikroskooppiseen kuvantamiseen, proteiinien ja proteiinien välisen vuorovaikutuksen analysointiin ja proteiinitoimintojen tutkimiseen. Edessä. Immunol. 2017, 8, 771. [CrossRef]

68. Platonova, E.; Winterflood, CM; Junemann, A.; Albrecht, D.; Faix, J.; Ewers, H. GFP- tai RFP-johdannaisilla merkittyjen molekyylien yhden molekyylin mikroskopia nisäkässoluissa käyttäen nanobodisideaineita. Methods 2015, 88, 89–97. [CrossRef]

69. Herce, HD; Schumacher, D.; Schneider, AF; Ludwig, AK; Mann, FA; Fillies, M.; Kasper, M.-A.; Reinke, S.; Krause, E.; Leonhardt, H.; et ai. Solua läpäisevät nanoaineet kohdennettuun immunoleimaukseen ja antigeenimanipulaatioon elävissä soluissa. Nat. Chem. 2017, 9, 762–771. [CrossRef]

70. Payne, NC; Mazitschek, R. Tiny Titans: Nanobodies as Powerful Tools for TR-FRET Assay Development. Anaali. Sens. 2022, 2, e202200020. [CrossRef]

71. Wendel, S.; Fischer, EC; Martínez, V.; Seppälä, S.; Nørholm, MHH Nanobody: GFP-bakteerialusta, joka mahdollistaa toimivan entsyyminäytön ja näyttökapasiteetin helpon kvantifioinnin. Microb. Cell Factories 2016, 15, 71. [CrossRef]

72. Seitz, KJ; Rizzoli, SO GFP-nanokappaleet paljastavat äskettäin eksosytoidut pH-luoriinimolekyylit. Sci. Rep. 2019, 9, 7773. [CrossRef]

73. Caussinus, E.; Kanca, O.; Affolter, M. Anti-GFP-nanobodyn välittämä fluoresoiva fuusioproteiini knockout. Nat. Rakenne. Mol. Biol. 2011, 19, 117–121. [CrossRef]

74. Shin, YJ; Park, SK; Jung, YJ; Na Kim, Y.; Kim, KS; Park, OK; Kwon, S.-H.; Jeon, SH; Trinh, LA; Fraser, S.; et ai. Nanokehiin kohdistettu E3-ubikvitiiniligaasikompleksi hajottaa tuman proteiineja. Sci. Rep. 2015, 5, 14269. [CrossRef]

75. Baudisch, B.; Pfort, I.; Sorge, E.; Conrad, U. Nanobody-Directed Specific Degradation of Proteins by 26S-Proteasome in Plants. Edessä. Plant Sci. 2018, 9, 130. [CrossRef]

76. Croucher, DR; Iconomou, M.; Hastings, JF; Kennedy, SP; Han, JZR; Shearer, RF; McKenna, J.; Wan, A.; Lau, J.; Aparicio, S.; et ai. Bimolecular komplementaatioaffiniteettipuhdistus (BiCAP) paljastaa dimeerispesifisiä proteiinivuorovaikutuksia ERBB2-dimeerien kanssa. Sci. Signaali. 2016, 9, 436. [CrossRef]

77. Tang, JC; Szikra, T.; Kozorovitskiy, Y.; Teixeira, M.; Sabatini, BL; Roska, B.; Cepko, CL Nanobody-pohjainen järjestelmä, joka käyttää fluoresoivia proteiineja tukirakenteina soluspesifiseen geenimanipulaatioon. Cell 2013, 154, 928–939. [CrossRef]

78. Sommese, RF; Hariadi, RF; Kim, K.; Liu, M.; Tyska, MJ; Sivaramakrishnan, S. Patterning proteiinikompleksit DNA-nanorakenteilla käyttäen GFP-nanobodya. Protein Sei. 2016, 25, 2089–2094. [CrossRef]