Abstrakti

Masennus on maailmanlaajuisesti erittäin yleinen ja vammauttava psykiatrinen häiriö. Kasvava näyttö osoittaa, että liiallinen hermoston tulehdusaktivaatio hippokampuksessa edistää merkittävästi masennusoireiden ilmaantumista ja etenemistä. Cistanche-fenyylietanoliglykosidit (CPhG), tärkeimmät bioaktiiviset ainesosat, jotka on uutettu perinteisistä syötävistä lääkeyrteistäCistanche deserticolajaCistanche tubulosa, ovat osoittaneet aiemmissa tutkimuksissa useita neuroprotektiivisia farmakologisia ominaisuuksia. Tämän esillä olevan tutkimuksen tarkoituksena oli tutkia CPhG:iden terapeuttisia vaikutuksia ja molekyylimekanismeja kroonisen arvaamattoman lievän stressin (CUMS) laukaisemiin masennuksen kaltaisiin käyttäytymisfenotyyppeihin C57BL/6-hiirillä.

Kuusikymmentä SPF-luokan C57BL/6-hiirtä jaettiin satunnaisesti kuuteen kohorttiin: kontrolliryhmä, CUMS-malliryhmä, suuren annoksen CPhGs-ryhmä (700 mg/kg), keskiannoksen CPhGs-ryhmä (350 mg/kg), pieniannoksisten CPhGs-ryhmä (175 mg/kg), 5 mg/kg-kontrolliryhmä (175 mg/kg) ja ox-positiivinen ryhmä. Neljä viikkoa kestäneen CUMS-mallinnuksen jälkeen suoritetun lääkeleukon avulla toteutettiin kattavat hermostolliset käyttäytymisarvioinnit, mukaan lukien sakkaroosipreferenssitesti (SPT), avoimen kentän testi (OFT), hännän ripustustesti (TST) ja pakkouintitesti (FST). Entsyymi-immunosorbenttimääritys (ELISA) -sarjat mittasivat seerumin monoamiinin välittäjäainepitoisuudet sekä hippokampuksen tulehdusta edistävät sytokiinit ja tulehdusvälittäjät. Hematoksyliini-eosiini (HE) värjäys ja Nissl-värjäys visualisoivat neuronaalisia patologisia vaurioita hippokampuksen hammaskiven alueilla. Immunohistokemia havaitsi gliafibrillaarisen happaman proteiinin (GFAP), ionisoidun kalsiumia sitovan adapterimolekyylin-1 (Iba-1), NLRP3- ja kaspaasi-1-proteiinien ilmentymisintensiteetin. Immunofluoresenssivärjäys arvioi edelleen ylävirran TLR4/NF-κB-signalointikaskadin aktivaatiotilaa.

Kokeilutuloksemme osoittivat, että CPhG:n anto suun kautta lievensi huomattavasti masennukseen liittyviä käyttäytymispoikkeavuuksia. CPhG:t nostivat sakkaroosin mieltymysprosenttia ja lyhensivät liikkumattomuuden kestoa epätoivoon perustuvissa käyttäytymisparadigmoissa. Lisäksi CPhG-hoito palautti seerumin ja hippokampuksen serotoniinin (5-HT) sekä dopamiinin (DA) tason. Biokemiallinen havaitseminen paljasti hippokampuksen pro-inflammatoristen välittäjien merkittävän tukahdutuksen ja sytokiinien ylituotannon. Histopatologiset havainnot osoittivat CUMS:n aiheuttaman hippokampuksen hermosoluvaurion annoksesta riippuvaa helpotusta. Immunohistokemialliset tulokset osoittivat, että CPhG:t lisäsivät GFAP:n leimaamaa astrosyyttitiheyttä, estivät Iba-1-positiivisen mikroglian patologista hyperaktivaatiota ja vähensivät NLRP3-tulehdusperäisten proteiinien runsautta. Immunofluoresenssimääritykset vahvistivat, että CPhG:t hillitsivät liiallista TLR4:ää ja fosforyloivat NF-κB p65 -aktivaatiota aivotursokudoksessa.

Yhdessä nämä havainnot vahvistavat, että CPhG:illä on huomattava masennuslääkkeen kaltainen teho CUMS:n stimuloimia masennuksen kaltaisia ​​ilmenemismuotoja vastaan ​​hiirillä. Sen farmakologista mekanismia välittävät osittain kaksi säätelytoimintoa: monoamiinin välittäjäaineen homeostaasin palauttaminen ja TLR4/NF-κB/NLRP3-signalointiakselin välittämien hermotulehdusvasteiden hillitseminen. Tämä eläintutkimus tarjoaa esikliinisen kokeellisen perustan, joka tukee CPhG:iden edelleen hyödyntämistä lupaavina luonnollisina ehdokasaineina tai funktionaalisten elintarvikkeiden ainesosina masennuksen adjuvanttihoitoon.

Avainsanat: Cistanche-fenyylietanoliglykosidit (CPhGs); masennus; krooninen arvaamaton lievä stressi; hermoston tulehdus; astrosyytit; mikroglia; TLR4/NF-κB/NLRP3-tulehdusreitti

1. Johdanto

Masennus on monitahoinen affektiivinen psykiatrinen sairaus, jolle on tunnusomaista keskeisiä kliinisiä ilmenemismuotoja, joita ovat jatkuva huono mieliala, anhedonia, psykomotorinen hidastuminen, uni-valveiluhäiriö ja somaattinen toimintahäiriö. Vakavat masennusjaksot voivat johtaa itsensä vahingoittamiseen ja itsemurha-ajatuksiin, mikä aiheuttaa valtavia kansanterveydellisiä rasitteita maailmanlaajuisesti. Kiinasta saadut epidemiologiset tutkimukset raportoivat kansallisen masennuksen esiintyvyyden nousevan 2,1 prosenttiin, ja Maailman terveysjärjestö on luokitellut vakavan masennushäiriön parhaiden sairauksien joukkoon, jotka vaikuttavat maailmanlaajuiseen vammaisuuteen perustuvaan elinvuosien menetykseen.

Siitä huolimatta masennuksen patogeneesin taustalla oleva täydellinen molekyylinen etiologia on edelleen epätäydellisesti selvitetty, mikä estää täydellisiä kliinisiä terapeuttisia ratkaisuja. Nykyiset patofysiologiset hypoteesit ovat siirtäneet painopistettä kohti neuroimmuuni-ylikuulumismekanismeja. Esikliiniset ja kliiniset tutkimukset korostavat jatkuvaa hermoston tulehdusta masennushäiriöiden elintärkeänä patogeenisenä tekijänä. Kroonisten psykologisten tai fysiologisten stressihaasteiden alaisena aivotursokampuksen gliasolupopulaatiot aktivoituvat epänormaalisti. Yliaktivoitunut mikroglia ja toimintakyvyttömät astrosyytit laukaisevat useiden proinflammatoristen välittäjien voimakkaan vapautumisen, mikä luo tulehdusta edistäviä sytokiinisarjan monistusvaikutuksia. Tällaiset hermo-inflammatoriset loukkaukset aiheuttavat edelleen hermosolujen morfologista heikkenemistä, välittäjäaineiden aineenvaihdunnan häiriötä ja synaptisen plastisuuden heikkenemistä, mikä lopulta helpottaa masennuksen kaltaista patologista etenemistä.

Nykyiset valtavirran kliiniset masennuslääketoimet perustuvat pääasiassa synteettisiin kemiallisiin masennuslääkkeisiin, joita edustaa fluoksetiini, selektiivinen serotoniinin takaisinoton estäjä (SSRI). Huolimatta joidenkin potilaiden osittaisesta oireiden lievittymisestä, synteettisillä masennuslääkkeillä on hyvin tunnistettuja haittoja: epätyydyttävät täydelliset remissiosuhteet, usein esiintyvät jäännösmasennusoireet, suuri uusiutumisen todennäköisyys lääkityksen lopettamisen jälkeen sekä haitalliset maha-suolikanavan, maksan ja metaboliset sivuvaikutukset pitkäaikaisen käytön aikana. Sitä vastoin perinteisillä kasviperäisillä lääkkeillä on usean kohteen moduloivat ominaisuudet ja suhteellisen lievät turvallisuusprofiilit, mikä herättää kasvavaa tutkimuskiinnostusta mielialahäiriöiden adjuvanttihoitoon.

Cistanche deserticolajaCistanche tubulosa, yleisesti nimeltään "aavikon ginseng", kuuluvat Orobanchaceae-perheeseen. Niiden mehevät varret toimivat klassisina homologisina lääkeruoan raaka-aineina perinteisessä aasialaisessa yrttikäytännössä. Nykyaikaiset farmakologiset tutkimukset dokumentoivat useita neuroprotektiivisia bioaktiivisuuksiaCistancheuutteet, mukaan lukien neurodegeneraatiota estävät vaikutukset Alzheimerin tautia ja Parkinsonin tautia vastaan. Fenyylietanoliglykosidit muodostavat tärkeimmät bioaktiiviset fraktiot sisälläCistancheuutteet, jotka sisältävät pääasiassa ekinakosidia ja verbaskosidia. Cistanche-fenyylietanoliglykosideilla (CPhG:t) on kasvaimia estäviä, antioksidantteja, immunomoduloivia ja hermoja suojaavia bioaktiivisuuksia useilla koealustoilla.

Aikaisempi alustava laboratoriotyö on osoittanut, että CPhG:t voivat nostaa striatalin dopamiinipitoisuutta ja lievittää vaihdevuosiin liittyviä masennusta muistuttavia fenotyyppejä jyrsijäeläinmalleissa. Kuitenkin, tuottavatko CPhG:t suojaavia vaikutuksia kroonisen stressin laukaisemaan masennukseen, ja yksityiskohtaisia ​​signaalinsiirtokaskadeja, jotka välittävät tällaisia ​​​​bioaktiivisuutta, ei vieläkään ole systemaattista tutkimista. Krooninen ennakoimaton lievä stressi (CUMS) -eläinparadigma on yksi vakiintunut prekliinisen masennuksen malli. Altistamalla laboratoriojyrsijät erilaisille satunnaisille lieville stressitekijöille peräkkäisten viikkojen ajan, CUMS toistaa luotettavasti keskeiset masennuksen tunnusmerkit, kuten anhedonia, epätoivo käyttäytymisessä ja hippokampuksen neuropatologiset vauriot.

Tämän mukaisesti tämä tutkimus rakensi CUMS-indusoidun masennushiirimallin arvioimaan systemaattisesti kolmen CPhG-gradienttiannoksen in vivo masennuslääkkeen kaltaista tehoa. Keskityimme erityisesti monoamiinin välittäjäaineiden palautumiseen, hippokampuksen gliasolujen fenotyyppiseen transformaatioon ja TLR4/NF-κB-hallittuun NLRP3-tulehdusreittiin. Tämän tutkimuksen tarkoituksena on tarjota objektiivista kokeellista näyttöä, joka tukee masennusoireiden parantamiseen tähtäävien CPhG-lääkkeiden tulevaa lääkekehitystä ja funktionaalisia elintarvikkeita.

2. Materiaalit ja menetelmät

2.1 Koemateriaalit, reagenssit ja instrumentit

Standardoitu CPhGs-raakauute hankittiin Hotan Dichen Pharmaceutical Biological Co., Ltd:ltä (erä nro . 20231221, Xinjiang, Kiina). Fenyylietanoliglykosidin kokonaispitoisuus Enintään 85 %, joka sisältää ekinakosidia enintään 40 % ja verbaskosidia suurempi tai yhtä suuri kuin 16 %. Fluoksetiinihydrokloridikapselit hankittiin Patheon Francelta. Kaupalliset ELISA-määrityssarjat 5-HT:lle, DA:lle, iNOS:lle, COX-2:lle, PGE2:lle, TNF-, IL-1:lle, IL-18:lle, IL-6:lle ja IFN:lle hankittiin päteviltä biologisten reagenssien toimittajilta. Immunohistokemiaan ja immunofluoresenssiin käytetyt ensisijaiset vasta-aineet sisälsivät anti-GFAP-, anti-Iba-1-, anti-NLRP3-, anti-kaspaasi-1-, anti-TLR4- ja anti-fosfo-NF-κB p65-vasta-aineet. Histologiset värjäyssarjat HE- ja Nissl-värjäystä varten valmistettiin parafiini-aivoleikkauksen käsittelyä varten.

Tärkeimmät laboratorion analyyttiset instrumentit käsittivät erittäin tarkan elektronisen analyyttisen vaa'an, Milli-Q-ultrapuhtaan vedenpuhdistustyöaseman, SpectraMax-monimuotoisen mikrolevylukijan, Leica-pystyfluoresenssimikroskoopin sekä täydellisen jyrsijän käyttäytymisen analysointilaitteiston ja SMART 3.0 -liikkeenseurantaohjelmistojärjestelmän.

Kuusikymmentä urospuolista SPF-luokan C57BL/6 hiirtä, seitsemän viikon ikäisiä, joiden alkuperäinen painoalue oli 18–22 g, ostettiin Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd:ltä. Kaikille hiiren kokeellisille manipuloinneille myönnettiin muodollinen eettinen hyväksyntä Shaanxin kiinalaisen lääketieteen yliopiston Animal Ethics Committeelta. Hiiret pidettiin tietyissä taudinaiheuttajista vapaissa eläinhuoneissa. Ympäristöparametreja pidettiin ympäristön lämpötilassa (21 ± 2) asteessa, suhteellisessa kosteudessa 60 % ± 10 %, jolloin toteutettiin standardi 12 tunnin valo-pimeä valaistusjaksot. Jyrsijäruokaa ja juomavettä oli saatavilla ad libitum. Yhden viikon mukautuva sopeutumisjakso suoritettiin ennen virallisten kokeellisten työnkulkujen aloittamista.

2.2 Eläinten ryhmittely, CUMS-mallinnus ja lääkehallinto

Viikon mukautuvan kasvatuksen jälkeen alustava sakkaroosin mieltymysseulonta sulki pois yksittäiset hiiret, joilla oli luonnostaan ​​alhainen sokerin juominen. Hyväksytyt koehiiret satunnaistettiin kuuteen tutkimusryhmään (n = 10 eläintä jokaisessa ryhmässä):

Kontrolliryhmä (Con): ei CUMS-stressiä, isovolummetrisen deionisoidun veden anto mahalaukunsisäisesti;

CUMS-malliryhmä (Mod): saa täyden CUMS-stimulaation, letkulla yhtä suurella deionisoidulla vedellä;

Suuriannoksisten CPhGs-ryhmä (CPhGs-H): CUMS-altistus, CPhG:t 700 mg/kg ruumiinpainoa päivittäisellä letkulla;

Keskiannoksen CPhG-ryhmä (CPhGs-M): CUMS-altistus, CPhG:t 350 mg/kg päivittäisellä letkulla;

Pienen annoksen CPhG-ryhmä (CPhGs-L): CUMS-altistus, CPhG:t 175 mg/kg päivittäisellä letkulla;

Fluoksetiinipositiivinen kontrolliryhmä (FLX): CUMS-altistus, fluoksetiini 15 mg/kg letkulla kerran päivässä.

CUMS-mallin rakentamiseen otettiin käyttöön kymmenen erilaista lievää stressitekijää: fyysinen rajoitus (60 min), vaakasuora ravistelu (60 min), hännän jousitus (60 min), häkki kallistettu 45 asteen kulmaan (24 h), kostea vuodeympäristö (24 h), tyhjän häkin eristys (24 h), yön yli valossa (1 2 h), 4 min valossa. kylmävesiuinti 4 asteessa 5 minuuttia ja häntäklipsistimulaatio 2 minuuttia. Kahta erillistä stressitekijää käytettiin satunnaisesti joka ikinen päivä; identtinen stressitekijä ei ilmesty peräkkäin kahtena vierekkäisenä päivänä. CUMS-mallinnusmenettely jatkui neljä viikkoa.

Neljän viikon stressimallinnuksen päätyttyä vastaavia testiaineita tai liuotinvehikkeliä annettiin mahalaukun sisään kerran päivässä jatkuvan neljän viikon ajan. Kahdeksannella koeviikolla kaikki neurokäyttäytymishavaintoprojektit toteutettiin peräkkäin.

2.3 Neurokäyttäytymistestiakku

2.3.1 Sakkaroosin etusijatesti (SPT)

Sakkaroosin mieltymystesti arvioi anhedoniaa muistuttavan depressiivisen ydinfenotyypin jyrsijöillä. Ennen virallista mittausta jokainen hiiri sijoitettiin erikseen. Kolmipäiväinen sakkaroosijuoman mukautusvaihe suoritettiin. Ensimmäinen päivä: kaksi pulloa 1 % sakkaroosiliuosta jokaiseen häkkiin 24 tunniksi. Toinen päivä: yksi sakkaroosiliuospullo yhdistettynä yhteen puhdistetun veden pulloon. Kolmas päivä: vaihda sokerivesi- ja puhdasvesisäiliöiden asentoa sijaintivirheen poistamiseksi. Sopeutumissyklin jälkeen hiiret paastosivat ruoasta ja vedestä 24 tuntia. Sen jälkeen toimitettiin esipunnittu 1 % sakkaroosivesipullo ja puhdistettu vesipullo. Pullon paikat vaihdettiin 12 tunnin kuluttua. 24 tunnin testauksen kokonaiskeston jälkeen molempien pullojen jäljellä oleva nestepaino kirjattiin tarkasti. Sakkaroosin suositusprosentti (%)=(sakkaroosiliuoksen kulutus)/(sakkaroosiliuoksen kulutus + puhdistetun veden kulutus) × 100 %.

2.3.2 Avoimen kentän testi (OFT)

Avokenttälaitteet muodostivat 50 cm × 50 cm × 50 cm avoimen kuutiolaatikon. Keskusneliöalue määriteltiin 25 cm × 25 cm:n keskusvyöhykkeeksi, joka oli keskitetty areenan sisälle. Jokainen hiiri asetettiin varovasti avoimen kentän laatikon keskipinnalle. Viiden minuutin vapaa sopeutumisaika sallittiin. Käyttäytymisen tallentaminen ja tietojen analysointi keskittyivät myöhempään viiden minuutin havaintojaksoon. Ensisijaiset lukuilmaisimet sisälsivät kokonaisliikeetäisyyden, keskivyöhykkeellä vietetyn ajan ja keskusvyöhykkeen sisääntulojen tiheyden. Nämä parametrit heijastavat spontaania lokomotorista aktiivisuutta ja tutkimushalua tuntemattomissa ympäristöolosuhteissa.

2.3.3 Hännän jousituksen testi (TST)

Hiiren hännän osa kiinnitettiin tukevasti, jolloin eläin sai roikkua ylösalaisin maanpinnan yläpuolella. Kokonaisnauhoitusaika oli kuusi minuuttia. Liikkumattoman ajan kesto myöhemmän neljän minuutin jakson aikana dokumentoitiin. Lisääntynyt liikkumattomuusaika edustaa lisääntynyttä käyttäytymis-epätoivon masennusta kaltaista tilaa.

2.3.4 Pakkouintitesti (FST)

Läpinäkyvä sylinterimäinen uimatynnyri (halkaisija 15 cm, korkeus 50 cm) täytettiin vedellä, jota pidettiin (25 ± 2) asteessa; veden syvyys oli 20 cm. Jokainen hiiri asetettiin varovasti uimasäiliöön kuuden minuutin kokonaistallennusväliksi. Viimeisen neljän minuutin kelluva liikkumattomuusaika kvantifioitiin tilastollisesti. Pidempi liikkumattomuusjakso osoittaa tehostunutta epätoivoon liittyvää käyttäytymiskykyä.

2.4 Näytteenotto ja kudosten valmistelu

Viikon 8 kokeen päätepisteessä hiirille annettiin intraperitoneaalinen injektio 3 % pentobarbitaalinatriumia (10 ml/kg) syväanestesiaa varten. Verinäytteet otettiin silmämunan poistoverenvuototekniikalla. Sen jälkeen tehtiin kohdunkaulan dislokaatioeutanasia. Kylmä normaali-suolaliuos sydämen perfuusio puhdisti kiertävän veren aivokudoksissa. Täydelliset kokoaivonäytteet leikattiin nopeasti pois. Puolet aivokudoksia upotettiin 4-prosenttiseen paraformaldehydiliuokseen 72 tunnin ajaksi kudoskiinnitykseen myöhempää histologiaa varten. Hippokampuksen aivoalueet eristettiin nopeasti jäljellä olevista aivonäytteistä esijäähdytetyllä jääalustalla ja säilytettiin nestemäisen typen varastointiympäristössä. Biokemiallista mittausta varten 10 mg hippokampuksen kudosnäytettä sekoitettiin esijäähdytettyyn normaaliin suolaliuokseen massa-tilavuussuhteella 1:9, jolloin suoritettiin mekaaninen homogenointi jäähauteessa. Kudoshomogenaattia sentrifugoitiin nopeudella 4 000 r/min 15 minuuttia, ja supernatanttifraktiot kerättiin ELISA-biomarkkerin kvantifiointia varten.

2.5 Biokemiallisen indeksin mittaus

Kaupallisten ELISA-pakkausten valmistajan käyttöohjeiden mukaan seerumin ja hippokampuksen homogenaatin supernatanttinäytteet mitattiin monoamiinin välittäjäaineiden, mukaan lukien 5-HT:n ja DA:n, pitoisuusarvojen saamiseksi. Hippokampuksen homogenaattisupernatantista tutkittiin edelleen tulehdusvälittäjäindikaattoreita iNOS, COX-2, PGE2 sekä proinflammatorisia sytokiineja TNF-, IL-1, IL-18, IL-6 ja IFN-. Optisen tiheyden absorbanssilukemat kerättiin mikrolevyspektrofotometrillä. Näytteen proteiinipitoisuus kalibroitiin käyttämällä BCA-proteiinin kvantifiointipakkausta ennen sytokiinien havaitsemista.

2.6 Hippokampuksen histopatologinen värjäys

Kiinteät aivokudosnäytteet upotettiin parafiinivahaan ja leikattiin 4 μm:n paksuisiksi histologisiin leikkeisiin. HE-värjäystä varten: parafiinileikkeistä tehtiin ksyleenin vahanpoisto, gradienttietanolihydrataatio, hematoksyliiniydinvärjäys, eosiinisytoplasminen vastavärjäys, kloorivety-alkoholi-differentiointi, etanoligradienttidehydratointi, ksyleenin läpinäkyvyyskäsittely ja neutraali purukumi kiinnitys. Mikroskooppinen havainto keskittyi solun morfologiaan, tuman tilaan ja sytoplasmiseen rakenteelliseen eheyteen hippokampuksen hammaskiven alueella.

Nissl-värjäys visualisoi hermosolujen Nissl-solut, jotka heijastavat hermosolujen biosynteettistä aktiivisuutta ja solujen elinvoimaa. Parafiiniviipaleista, joista oli poistettu vaha, inkuboitiin Nissl-värjäystyöliuoksessa. Tislatulla vedellä suoritettujen pesuvaiheiden jälkeen osat kuivattiin, läpinäkyvyys tehtiin ja suljettiin. Hippokampuksen hermosolujen histomorfologisia vaihteluita havaittiin optisella mikroskoopilla.

2.7 Immunohistokemiallinen määritys

Parafiiniin upotetuista hippokampuksen kudosleikkeistä poistettiin vaha ja ne hydratoitiin. Antigeenin haku, endogeenisen peroksidaasin esto ja ei-spesifinen proteiinia sitova estovaihe toteutettiin peräkkäin. Kudosviipaleita inkuboitiin yön yli 4 asteen lämpötilassa laimennettujen primääristen vasta-aineiden kanssa: anti-GFAP (1:400), anti-Iba-1 (1:400), anti-NLRP3 (1:300), anti-kaspaasi-1 (1:400). Sekundaarisen vasta-aineinkuboinnin jälkeen suoritettiin DAB-kromogeeninen reaktio. Tuman vastavärjäys, dehydratointi ja kiinnitystoimenpiteet saatiin päätökseen. Valomikroskoopilla otetut digitaaliset näkökentän kuvat. Image-J-kuvankäsittelyohjelmisto laski keskimääräiset optisen tiheyden arvot arvioidakseen puolikvantitatiivisesti kohdeproteiinin ilmentymisintensiteettiä.

2.8 Immunofluoresenssivärjäys

Valmistetuissa parafiinihippokampusleikkeissä tehtiin vahanpoisto, antigeenin haku ja esto. Primaarisia vasta-aineita anti-TLR4 (1:400) ja anti-fosfo-NF-κB p65 (1:200) levitettiin ja inkuboitiin yön yli neljän celsiusasteen olosuhteissa. Fluoresoivilla leimattuja sekundaarisia vasta-aineita lisättiin tunnin inkubaatioon valosuojaustilassa. DAPI ydinvastaväri sisältyi kiinnitysaineeseen. Laserfluoresenssimikroskoopilla kuvatut fluoresenssisignaalit. Image-J-ohjelmisto laski keskimääräisen fluoresenssin intensiteetin, joka edustaa TLR4- ja p-NF-κB p65 -proteiinin aktivaation suuruutta.

2.9 Tilastollinen analyysi

Alkuperäiset kokeelliset tiedot käsiteltiin SPSS 26.0 -tilastoohjelmistolla ja GraphPad Prism 9.0 -grafiikkaohjelmalla. Kaikki kvantitatiiviset tulostiedot ilmaistiin keskiarvona ± standardipoikkeama (\\(\\bar{x} \\pm s\\)). Ryhmien väliset tilastolliset vertailut suoritettiin asianmukaisilla tilastollisilla testeillä. P-arvo alle 0,05 arvioitiin tilastollisesti merkitseväksi eroksi; P< 0.01 represented highly significant statistical distinction.

3. Kokeelliset tulokset

3.1 CPhG:t paransivat Anhedonia-oiretta ja palautuivat monoamiinin neurotransmitteritasot

Ennen CUMS-mallinnuksen aloittamista perussakkaroosin mieltymysarvot eivät osoittaneet selvää tilastollista vaihtelua kaikissa koe-eläinryhmissä. Neljän viikon CUMS-stressin ja neljän viikon interventiosyklien jälkeen CUMS-malliryhmässä oli selvästi pienempi sakkaroosin mieltymyssuhde verrattuna stressaantumattomiin kontrollieläimiin (P< 0.01), demonstrating successful establishment of anhedonia depressive‑like phenotype. Serum and hippocampal tissue 5‑HT and DA concentrations in Mod group were significantly reduced compared with Con group (P < 0.05 or P < 0.01).

Verrattuna Mod-mallin kohorttiin, korkean, keskisuuren ja pienen annoksen CPhG-hoitoryhmät sekä fluoksetiinipositiiviset ryhmät saivat aikaan huomattavan nousun sakkaroosipreferenssiprosentissa, seerumin 5-HT-, seerumin DA-, hippokampuksen 5-HT- ja hippokampuksen DA-pitoisuuksissa (P< 0.05 or P < 0.01). Pharmacological improvement effect exhibited apparent dose‑dependent tendency; high‑dose CPhGs group achieved more robust biomarker‑rescue outcome than medium‑dose and low‑dose subgroups. This set of findings illustrated CPhGs could ameliorate anhedonic behavioral performance and reverse stress‑provoked depletion of key mood‑regulating monoamine neurotransmitters inside peripheral circulation and hippocampal brain tissue.

3.2 CPhGs Enhanced Exploration Activity Open-Field Test

Avokenttäkäyttäytymisen arvioinnissa CUMS-mallin hiiret vähensivät merkittävästi kokonaisliikeetäisyyttä, keskivyöhykkeellä viipymisaikaa ja keskusalueen sisääntulotiheyttä vertailuhiiriin verrattuna (P< 0.01). Chronic unpredictable stress suppressed spontaneous exploratory behaviors. Following CPhGs or fluoxetine intervention, those three open‑field‑test indicators increased observably (P < 0.05 or P < 0.01). High‑dose CPhGs‑treated mice displayed 46.63 % increase of total travel distance, 127.92 % growth of central‑zone residence time compared against Mod group. Medium‑dose and low‑dose CPhGs also produced measurable but weaker improvement effects. It indicated CPhGs alleviated stress‑induced suppression of autonomous exploration activity.

3.3 CPhG:t lyhentävät liikkumattomuusaikaa epätoivoon perustuvissa käyttäytymisparadigmoissa

Hännän jousituksen testi ja pakkouintitesti havaitsevat epätoivon käyttäytymisessä, mikä edustaa keskeisiä masennusta muistuttavia käyttäytymislukemia. Mod-ryhmällä oli dramaattisesti pidentynyt liikkumattomuusaika sekä TST:ssä että FST:ssä (s< 0.01) relative to Con group. After drug intervention, CPhGs‑H, CPhGs‑M, CPhGs‑L and FLX groups generated statistically significant shortening of immobility durations (P < 0.05 or P < 0.01). For forced‑swim immobility time, high‑dose CPhGs brought 34.67 % reduction; medium‑dose 30.71 % reduction; low‑dose 20.78 % reduction. For tail‑suspension immobile time: CPhGs‑H achieved 35.91 % decrease. Results suggested CPhGs mitigated despair‑related passive coping behavioral patterns triggered by long‑term unpredictable stress stimulation.

3,4 CPhG:t vähentävät yli-ilmennettyjä hippokampuksen pro-inflammatorisia sytokiineja

Hippokampuksen pro-inflammatoriset sytokiinipitoisuudet (TNF-, IL-1, IL-18, IL-6, IFN-) CUMS-mallin eläimillä olivat dramaattisesti kohonneet verrokkivastaaviin (P)< 0.01). After CPhGs intervention, these pro‑inflammatory cytokine contents descended in dose‑responsive fashion. High‑dose CPhGs generated the most powerful inhibitory influence. For instance, relative to Mod group, CPhGs‑H decreased TNF‑α level by 42.93 %, lowered IL‑1β by 45.72 %, and reduced IL‑18 by 35.17 %. Medium‑dose CPhGs delivered moderate anti‑inflammatory potency, and low‑dose group exerted limited but detectable inhibitory impacts. This data demonstrated CPhGs could suppress excessive pro‑inflammatory‑cytokine release inside hippocampal tissue under chronic‑stress challenge.

3,5 CPhG:n alas säädellyt hippokampuksen tulehdusvälittäjäbiomarkkerit

Hippokampuksen tulehdusvälittäjät iNOS, COX-2 ja PGE2 lisääntyivät merkittävästi CUMS-mallihiirissä (P< 0.01). After drug intervention, CPhGs‑H, CPhGs‑M markedly diminished iNOS, COX‑2 and PGE2 concentrations (P < 0.05 or P < 0.01). Low‑dose CPhGs‑L group showed limited statistical significance for partial indicators. High‑dose CPhGs treatment group exhibited iNOS reduction rate reaching 49.55 %, COX‑2 reduction 39.58 %. Collectively, CPhGs suppressed stress‑induced up‑regulation of inflammatory‑mediator molecules inside hippocampus.

3,6 CPhG:n heikennetty CUMS:n laukaisema hippokampuksen hermoston patologinen vamma

HE-värjäystulokset: Mod-ryhmän hippokampuksen dentate-gyrus -neuronit esittivät vakavia patologisia vaurioita: solujen epäjärjestystä, tuman pyknoosia, sytoplasmista vakuolaarista rappeutumista, mikä ilmeni näkyvästi hermosolujen vaurioita. CPhGs-L-ryhmä osoitti vain triviaalia parantavaa vaikutusta. Keskiannoksiset ja suuret CPhG-annokset kumosivat sellaiset patologiset muutokset; suuren annoksen CPhGs-H-ryhmällä oli ylivoimainen hermosolujen suojavaikutus verrattuna fluoksetiiniryhmään osittaisilla näkökentillä.

Nissl-värjäytymistulokset: Mod-ryhmän aivotursohermosolut osoittivat epäjärjestynyttä järjestelyä, Nissl-solujen määrän selvää vähentymistä, mikä heijasti hermosolujen synteettisen toiminnan heikkenemistä ja alhaista solujen elinvoimaisuutta. CPhG:n antaminen annoksesta riippuvaisesti palautti Nissl-kehon runsauden. Neuronaalinen morfologia ja Nissl-korpuskkelitiheys CPhGs-H-ryhmän sisällä lähestyivät normaalia kontrolliryhmän tasoa. Histopatologiset löydökset vahvistivat, että CPhG:t suojasivat hippokampuksen hermosolujen eheyttä kroonisen stressin välittämää tuhoa vastaan.

3.7 CPhG:n säätelemä hippokampuksen gliasolujen aktivointitila

GFAP on spesifinen biomarkkeri astrosyyttipopulaatiolle. Con-ryhmään verrattuna Mod-ryhmän hippokampuksen GFAP-positiivisen signaalin intensiteetti laski merkittävästi (P< 0.01), indicating massive astrocyte functional impairment induced by CUMS stress. CPhGs‑H and CPhGs‑M intervention groups distinctly elevated GFAP expression level (P < 0.05 or P < 0.01); high‑dose CPhGs‑H enhanced GFAP average optical density by 64.23 % relative to Mod group. Low‑dose CPhGs‑L generated upward trend without statistical significance.

Iba-1-proteiinimerkki edustaa mikrogliaa. CUMS-malliryhmä näytti dramaattisesti lisääntyneen Iba-1-positiivisen ilmentymän signaalin (P< 0.01), implying robust microglia hyper‑activation. After CPhGs intervention, Iba‑1 expression intensity decreased dose‑dependently. CPhGs‑H produced 23.73 % reduction of Iba‑1 optical‑density value versus Mod group. It illustrated CPhGs preserved astrocyte abundance while dampening pathological microglia over‑activation inside hippocampal compartments.

3,8 CPhG:n estämä hippokampuksen NLRP3-tulehdukseen liittyvä proteiiniekspressio

Immunohistokemian havaitseminen osoitti NLRP3:n ja kaspaasi-1-proteiinin ilmentymisen Mod-ryhmän hippokampuksen sisällä huomattavasti säädeltyä (P< 0.01). Following CPhGs treatment, NLRP3 and Caspase‑1 protein abundance declined dose‑responsively. High‑dose CPhGs‑H decreased NLRP3 expression by 50.00 %, lowered Caspase‑1 expression level by 57.65 %. It demonstrated CPhGs suppressed pathological NLRP3 inflammasome complex activation in CUMS‑damaged hippocampal tissue.

3,9 CPhG:t estävät TLR4/NF-κB-signalointireitin yliaktivoinnin

Immunofluoresenssin havaitseminen osoitti, että CUMS-mallin hiirillä oli merkittävästi lisääntynyt TLR4-reseptorin ja fosforyloidun NF-κB p65-alayksikön fluoresenssin intensiteetti (P< 0.01). CPhGs intervention obviously reduced TLR4 and p‑NF‑κB p65 fluorescence signal strength (P < 0.05 or P < 0.01). Combined with above‑mentioned NLRP3 inflammasome‑protein detection results, these observations supported the inference: CPhGs inhibited TLR4/NF‑κB upstream signal‑cascade hyper‑activation, which sequentially restrained downstream NLRP3 inflammasome assembly and neuro‑inflammatory cascade amplification.

4. Keskustelu

Vakava masennushäiriö on vakava neuropsykiatrinen sairaus. Viime vuosina masennuksen neuro-inflammatorinen teoria on herättänyt laajaa tutkimushuomiota. Krooninen toistuva psyykkinen stressi voi laukaista synnynnäisen immuunijärjestelmän aktivoitumisen keskushermostossa. Hippokampus, yksi aivoalue, joka on erittäin herkkä stressiin kohdistuville loukkauksille, korreloi tiukasti mielialan modulaatioon, palkkioiden käsittelyyn ja muistitoimintoihin. Jatkuvassa stressistimulaatiossa hippokampuksen gliasolujen homeostaasi romahtaa. Hyperaktivoitunut mikroglia ja vaurioituneet astrosyytit erittävät suuria määriä proinflammatorisia sytokiinejä, mikä aiheuttaa hermosolujen rakenteellisia vaurioita, monoamiini-neurotransmitteri-aineenvaihduntahäiriöitä, mikä lopulta edistää masennuksen kaltaista käyttäytymistä.

Perinteisillä kasviperäisistä lääkkeistä johdetuilla aktiivisilla luonnontuotteilla on monia farmakologisia etuja, ja niistä on tulossa lupaavia ehdokasresursseja masennuslääkkeiden keksimiseen. CPhG:t ovat tunnusomaisia ​​bioaktiivisia komponentteja, joista on eristettyCistanchelääkekasvi. Tämä tutkimus rakensi CUMS:n aiheuttaman kroonisen stressin masennuksen hiirimallin, jolla varmistettiin kattavasti gradienttiannostettujen CPhG:iden masennuslääkettä muistuttava in vivo -tehokkuus. Käyttäytymiskokeet osoittivat, että CPhG-hoito paransi merkittävästi anhedonia-oireita, paransi tutkimusaktiivisuutta ja lyhensi epätoivoon liittyvää liikkumattomuusaikaa masennusmallihiirillä, mikä osoitti selkeän annosvaikutuksen korrelaation.

Monoamiinin välittäjäainehypoteesi on klassinen masennuksen patogeneesiteoria. Serotoniinilla ja dopamiinilla on kriittisiä säätelyrooleja, jotka kattavat emotionaalisen vakautuksen, palkintopalautteen havaitsemisen ja motivaatioon liittyvän käyttäytymisen moduloinnin. CUMS-stressi johti 5-HT- ja DA-pitoisuuksien ilmeiseen laskuun seerumin ja hippokampuksen kudoksissa mallieläimissämme. CPhG-interventio palautti tehokkaasti nämä kaksi monoamiinin välittäjäainetasoa. Tämä tulos on yhdenmukainen aiemmin julkaistujen tutkimusraporttien kanssaCistancheuutteet moduloivat aivojen monoamiinin välittäjäaineita.

Biokemiallinen lisätestaus paljasti, että CUMS aiheutti useiden tulehdusta edistävien sytokiinien (TNF-, IL-1, IL-18, IL-6, IFN-) sekä tulehdusvälittäjien (iNOS, COX-2, PGE2) voimakkaan nousun aivotursokudoksessa. CPhG-interventio muutti merkittävästi tällaisen tulehduksellisen yli-ilmentymisen tilan. Histopatologinen HE- ja Nissl-värjäys osoitti intuitiivisesti, että CPhG:t lievensivät stressin aiheuttamaa aivoturso-hermosolujen vaurioita ja suojasivat hermosolujen morfologista eheyttä.

Gliasolupopulaatiot toimivat hermo-inflammatorisia vasteita välittävinä keskeisinä osallistujina. Astrosyytit ylläpitävät välittäjäaineiden kierrätystä, veri-aivoesteen rakenteellista vakautta ja hermosolujen ravinnon saantia. Mikrogliat toimivat vakiintuneina synnynnäisinä immuuniefektorisoluina aivojen parenkyymin sisällä. Krooninen stressi aiheuttaa astrosyyttien menetystä tai toiminnallista epäpätevyyttä yhdessä mikroglian patologisen hyperaktivaation kanssa. Immunohistokemiamme tietomme osoittivat, että CPhG-hoito nosti GFAP-positiivisten astrosyyttien tiheyttä ja alensi samalla Iba-1-merkittyä yliaktivoitunutta mikrogliaa aivotursossa. Tämä gliasolujen fenotyyppiä säätelevä ominaisuus voi osittain olla taustalla CPhG:n hermostoa suojaavan ja masennusta ehkäisevän farmakologisen tehon.

NLRP3-tulehdus edustaa elintärkeää molekyylialustaa, joka välittää neuro-inflammatorisen kaskadin. Sen aktivaatio edistää IL-1:n ja IL-18:n proinflammatoristen sytokiinien kypsymistä ja erittymistä. TLR4/NF-κB-signaaliakseli toimii olennaisena ylävirran esisytytyssignaalina NLRP3-tulehdusaktivaatiolle. TLR4-reseptorin stimulaatio edistää NF-κB-alayksikön fosforylaatiota ja tuman translokaatiota, transaktivoi edelleen NLRP3-, pro-IL-1-geenin transkriptiota. Tässä tutkimuksessamme CUMS-stressi laukaisi samanaikaisesti TLR4:n, fosforyloidun NF-κB p65:n, NLRP3:n ja Caspase-1-proteiinin ilmentymisen. CPhG:n interventio esti selvästi tämän koko signaalikaskadin aktivoitumisen. Siksi päättelemme, että CPhG:t lievittävät hermo-inflammatorisia vaurioita osittain hillitsemällä TLR4/NF-κB-välitteistä NLRP3-tulehdusaktivaatiota.

Kaiken kaikkiaan eläinmallimme kokeellinen näyttö tukee mekanistista mallia: CPhG:t tuottavat masennuslääkkeiden kaltaisia ​​vaikutuksia CUMS-indusoiduissa masennushiirissä kahden ensisijaisen ulottuvuuden kautta: (1) mielialaan liittyvien monoamiinin välittäjäaineiden (5-HT, DA) homeostaasin palauttaminen; (2) moduloi hippokampuksen gliasolujen homeostaasia ja tukahduttaa TLR4/NF-κB-ohjatun NLRP3-tulehdusriippuvaisen neuro-inflammatorisen patologisen kaskadin.

Useat tämän tutkimuksen rajoitukset ansaitsevat huomion. Tämä työ toteutti vain eläintason in vivo -kokeita. Emme ole suorittaneet solutason mekaanista validointia emmekä kliinisiä ihmiskokeita. Siksi ihmisen masennuksen hoitoa koskevien translaatioiden päätelmien tulee pysyä varovaisina. Lisäksi tämä tutkimus ei eritellyt yksittäisten monomeeriyhdisteiden (ekinakosidi, verbaskosidi) osuutta seka-CPhG-uutteen sisällä. Tulevaisuuden tutkimus voi keskittyä soluviljelymekanistiseen verifiointiin, yksittäisten komponenttien aktiivisuuden vertailuun sekä alustavaan ihmisen ja koehenkilön pilottihavaintoon.

5. Johtopäätös

Cistanche-fenyylietanoliglykosidit (CPhG:t) tuottavat merkittäviä masennuslääkkeiden kaltaisia ​​farmakologisia vaikutuksia kroonisia, arvaamattomia lievän stressin aiheuttamia masennuksen kaltaisia ​​käyttäytymisfenotyyppejä vastaan ​​C57BL/6-hiirillä. Sen terapeuttiset mekanismit liittyvät seerumin ja hippokampuksen serotoniini- ja dopamiinin välittäjäainetasojen palautumiseen, hippokampuksen hermosolujen rakenteen eheyden säilyttämiseen, astrosyyttien ja mikroglioiden funktionaalisen tasapainon modulointiin sekä TLR4/NF-KB/NLRP3-tulehduspatologisten tulehduskakadien aiheuttamien neurologisten kakadien tukahduttamiseen. Tämä prekliininen eläintutkimus tarjoaa kokeellisen referenssin CPhG:iden jatkokehittämiseen luonnollisena terapeuttisena apuaineena tai funktionaalisena ruoan ainesosana, jolla pyritään parantamaan masennuksen oireita.

Viitteet

Ren L, Shao YT, Qin SH. Tutkimus kohteen tunnistamisesta ja saponiini A:n vaikutuksesta masennushäiriöön. Nat Prod Res Dev, 2024, 36:44-51.

Fan L, Peng Y, Wang JW, et ai. Cistanche tubulosan varresta peräisin olevat glykosidit lievittävät masennuksen kaltaista käyttäytymistä: fytokemikaalien ja suoliston mikrobiston kaksisuuntaista vuorovaikutusta. Phytomedicine, 2021, 83:153471.

Fan L, Peng Y, Chen XN, et ai. Fytokemiallisen koostumuksen, farmakokinetiikan ja verkkofarmakologian integroitu analyysi Cistanche deserticolan ja C. tubulosan varsien välisten erojen tutkimiseksi masennuslääkeaktiivisuuden perusteella. Food & Function, 2022, 13:8542-8557.

Yirmiya R, Rimmerman N, Reshef R. Masennus mikroglia-taudina. Trends in Neurosciences, 2015, 38:637-658.

Jia XN, Gao ZH, Hu HL. Microglia masennuksessa: nykyiset näkymät. Science China-Life Sciences, 2021, 64:911-925.

Wu B, Gan AN, Wang RX, et ai. Alpinia oxyphylla Miq. haihtuva öljy parantaa masennuskäyttäytymistä ja estää hermoston tulehdusta CUMS:lle altistuneissa hiirissä estämällä TLR4-välitteisen MyD88/NF-κB-signalointireitin. Journal of Chemical Neuroanatomy, 2023, 130:102270.