Wen-Lan Li, Jing-Xin Ding, Jing Bai, Yang Hu, Hui Song, Xiang-Ming Sun, Yu-Bin Ji

Yhteystiedot: joanna.jia@wecistanche.com

Abstrakti

LC Technology on maailmanlaajuisesti tunnustettu menetelmä perinteisten kiinalaisten lääkkeiden (TCM) laadun arvioimiseksi. TCM:n laadulla on suora vaikutus sen tehokkuuteen. Siksi TCM:n tehokkuuden perusteellisen paljastamiseksi on ensinnäkin ymmärrettävä sen tehokkuuden aineellinen perusta ja sitten valvottava aktiivisten yhdisteiden laatua. Spektri-vaikutussuhdemenetelmän soveltaminen on ratkaisevan tärkeää farmakologisen materiaaliperustan määrittämisessä. Tämän artikkelin tavoitteena oli tutkia taustalla olevia korrelaatioita kemiallisten profiilien ja estrogeenisen aktiivisuuden välillä.Cistanche, paljastaa aktiiviset yhdisteet. Kemialliset profiilitCistanchemitattiin käyttämällä HPLC/Q-TOF-MS/MS:ää, ja estrogeeniaktiivisuus määritettiin kohdun kasvutestillä ja MTT-määrityksellä. Sitten yhdistämällä kaksimuuttujaanalyysin, pääkomponenttianalyysin ja harmaakorrelaatioanalyysimenetelmän tulokset tunnistettiin viisitoista aktiivista yhdistettä. Ne ovat 8-epilogaanihappo, salidrosidi, syringalidi A 3'- -l-ramnopyranosidi, cistanosidi A,ekinakosidi, cistanosidi F, cistanosidi B, cistanosidi C, osmantusidi B, akteosidi, isoakteosidi, tubulosidi B, 2'-asetyylilakteosidi ja kaksi tuntematonta yhdistettä. Tämä tutkimus luo perustan in vivo -tutkimuksilleCistancheja sen kliinisen sovelluksen kehittämiseen.

Cistanche voi lisätä estrogeenia, napsauta tästä saadaksesi lisätietoja

Avainsanat:Cistanchedeserticola; LC/Q-TOF-MS; estrogeeninen aktiivisuus; pääkomponenttianalyysi (PCA); Kohdun kasvutesti.

Lyhenteet

TCM: Perinteinen kiinalainen lääketiede

HPLC/Q-TOF-MS: Korkean suorituskyvyn nestekromatografia/kvadrupolin lentoajan massaspektrometria

BA: kaksimuuttujaanalyysi

PCA: pääkomponenttianalyysi

GCAM: harmaa korrelaatioanalyysimenetelmä

MTT: trypsiini, 3-(4, 5-dimetyylitiatsol-2-yyli)-2, 5-difenyylitetratsoliumbromidi

DMSO: dimetyylisulfoksidi

RPMI1640 Roswell Park Memorial Institute 1640

1. Esittely

Viime aikoina TCM:stä on tullut yhä suositumpi Aasiassa ja länsimaissa sen vakaiden terapeuttisten vaikutusten ja alhaisen toksisuuden vuoksi klinikalla. Tämän seurauksena on tarpeen kehittää uusia TCM-tyyppejä ja ymmärtää niiden kliinisen käytön aikana käytetyt tehokkaat koostumukset [1-6].

Ensinnäkin tutkitaan spektri-vaikutussuhdetta kromatografisen sormenjäljen ja farmakodynamiikan tehokkuuden välisen korrelaation havaitsemiseksi. Käytä sitten suhdetta tehokkaiden komponenttien etsimiseen TCM:stä ja ohjausstandardien muotoiluun, joka kuvastaa niiden sisäistä laatua. Spektri-vaikutussuhdetta on sovellettu monilla TCM-tutkimuksen osa-alueilla, kuten yksittäisen ja yhdistetyn TCM:n materiaaliperustassa, komponenttien yhteensopivuudessa, prosessointimekanismissa, farmakologisten vaikutusten ennustamisessa ja teknologian optimoinnissa [7-12]. Spektri-vaikutussuhdetta käytetään uusien ideoiden ja menetelmien esittämiseen vaikuttavien aineiden tutkimiseen, kaavojen optimointiin, valmistusprosessien parantamiseen, kohdeainesosien seurantaan ja erottamiseen sekä uusien TCM-lääkkeiden kehittämiseen [13-17].

CistancheSitä on käytetty laajalti seksuaalisen toimintahäiriön, ummetuksen, eturauhastulehduksen ja munuaisten vajaatoiminnan hoitoon. Sillä on laaja kirjo bioaktiivisuutta, mukaan lukien estrogeeninen vaikutus, ikääntymistä estävä, antioksidantti ja immuunivaikutus [18-19]. Yleensä fenyylietanoidiglykosideja (kuten cistanosidi A, tubulosidi A), lignaaneja ja iridoidiglykosideja pidettiin farmakologisina aineosina ja kemiallisina merkkiaineina Cistanchen ja sen tuotteiden laadunvalvonnassa [20-21]. Kemialliset spektritCistancheeri alueilta tallennettiin käyttämällä korkean suorituskyvyn nestekromatografiaa (HPLC) [22-23]. Tässä tutkimuksessa valitsemme kohdun kasvutestin ja MCF7-soluproliferaatiomäärityksen arvioidaksemme niiden estrogeenista aktiivisuutta. Pääkomponenttianalyysiä, kaksimuuttujaanalyysiä ja harmaakorrelaatioanalyysimenetelmiä käytettiin estrogeenisen aktiivisuuden korreloimiseksi yksittäisten komponenttien kanssa. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli tunnistaa Cistanchen bioaktiiviset yhdisteet, jotka ovat vastuussa estrogeenisista vaikutuksista in vivo. Tutkimus luo pohjan syvälliselle tutkimukselleCistanche.

Harbin University of Commercen eläineettinen komitea tarkasteli ja hyväksyi kaikki kokeelliset menettelyt.

Cistanchedeserticola(cd-20120227-005) ostettiin huumemarkkinoilta ja tunnisti professori Zhang Delian (Harbin University of Commerce). Dietyylistilbestroli ostettiin yhtiöltä HEFEI JIULIAN PHARMACEUTICAL CO., LTD. RPMI1640 ja RPMI1640 ilman fenolipunaista ostettiin HyClone Companylta (USA). MTT ja DMSO ostettiin kaikki Sigma-Aldrich Co. LLC:ltä (St Louis, USA). Ihmisen rintasyövän MCF7-solulinjan toimitti Biotieteiden ja ympäristötieteiden tutkimuskeskus (Harbin University of Commerce). Käytetyt standardit olivat seuraavat: akteosidi (111530- 200505), ekinakosidi (111670-200503) ja salidrosidi (110736-200628) saatiin National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products -instituutista (Peking). , Kiina). Asetonitriili, metanoli ja muurahaishappo olivat MS-laatua, kun taas vesi oli ultrapuhdasta. Muut reagenssit olivat analyyttistä laatua ja niitä oli kaupallisesti saatavilla.

EkinakosidisisäänCistanchetubulosalla on monia vaikutuksia

2 Kokeellinen menettely

2.1 Materiaalit

Agilent 1290 HPLC -järjestelmää, Agilent 6530 Series Quadrupole Time-of-Flight LC/MS (Q-TOF) -järjestelmää ja Chemical HPLC{5}}D -työasemia käytettiin analyyttisiin kemiallisiin kokeisiin ja tietojenkäsittelyyn. Näytteiden ja standardien valmistukseen käytettiin Ultrapuhdasta Milli-Q-vettä. Muita instrumentteja olivat elektroninen Analytical Balance AR1140 (Ohaus International Ltd), 680 Microplate Reader (Bio-Rad Corporation) ja 64R High-Speed ​​Centrifuge (Beckman Coulter Allegra).

Epäkypsät naaraspuoliset Kunming-hiiret (noin 21 päivää syntymästä, vieroitettuja), jotka painoivat (12 ± 2) g, ostettiin Changchun National Biological Industry Base Laboratory Animal Centeristä (Changchun, Kiina). Hiiret pidettiin lämpötilasäädellyssä huoneessa (22 ± 2 astetta), jossa oli rajoittamaton pääsy ruokaan ja veteen. Eläinkokeet aloitettiin viiden päivän totuttelun jälkeen. Hiiriä paastottiin yön yli, jolloin heillä oli vapaa pääsy veteen ennen testiliuosten antamista. Tämä tutkimus suoritettiin tiukasti National Institutes of Healthin laboratorioeläinten hoito- ja käyttöoppaan suositusten mukaisesti.

2.2 Näyteliuoksen valmistaminen

Cistanche-näytteet kerättiin kymmenestä erilaisesta elinympäristöstä, nimittäin Neimeng, Xinjiang, Ningxia, Guizhou, Chaidamu, Xizang, Alashan, Qinghai, Sichuan ja Hubein maakunta.

Cistanche-näytteen liuos (1.0 g/ml) valmistettiin tislattuun veteen oraalista antoa varten. Dietyylistilboestrolin pitoisuus oli 20 ug/ml ja sitä käytettiin positiivisena kontrolliliuoksena. Cistanche-näytteen liuos (1.{7}} g/ml) valmistettiin 50-prosenttiseen asetonitriiliin. Akteosidi, ekinakosidi ja salidrosidi (kukin 2,0 mg) liuotettiin 10 ml:aan 50-prosenttista asetonitriililiuosta. Sekä näyte- että standardiliuos suodatettiin 0.{11}}μm:n suodattimella ennen analysointia.

2.3 LC-MS-olosuhteet

Näytteiden analysointiin käytettiin Waters Symmetry Shield RP18 -laitetta (3,9 mm × 15{5}} mm, 5 μm; Waters Corporation, Milford, MA, USA). Liikkuva faasi koostui asetonitriilistä (A) ja 0,2 % (v/v) muurahaishapon vesiliuoksesta (B) ja sitä pumpattiin virtausnopeudella 0,5 ml/min. Kunkin näytteen injektiotilavuus oli 10 µl. Gradienttieluointiohjelma oli seuraava: Liikkuva faasi A aloitettiin 5 prosentissa ja nostettiin lineaarisesti 23 prosenttiin 35 minuutin kohdalla. Liuos A nostettiin tämän jälkeen 25 prosenttiin (35 - 65 min). Liikkuva faasi A laskettiin sitten 5 prosenttiin ajon viimeisen 5 minuutin ajaksi (65 - 70 min). Kolonnin lämpötila pidettiin 30 asteessa. Kromatogrammeja tarkkailtiin aallonpituudella 254 nm. Sumutuskaasun paine oli 30 psi ja kapillaarijännite 3,5 kV. Kuivan kaasun virtausnopeus asetettiin 8 l/min lämpötilaan 30 astetta. Massaspektrit tallennettiin skannausalueella 100- 3,000 Da ja ne olivat negatiivisten ionien skannaustilassa.

2.4 Sormenjälkien arviointi

Kymmenestä eri erästä kerättyjen näytteiden LC-sormenjäljet ​​määritettiin ja täsmäytettiin automaattisesti käyttämällä TCM:n kromatografisen sormenjäljen samankaltaisuuden arviointijärjestelmää (versio 2012; China Pharmacopoeia Committee, Peking, Kiina). Lisäksi referenssikromatogrammikartta luotiin mediaanimenetelmällä. Lisäksi klusterianalyysillä arvioitiin kymmenestä eri elinympäristöstä otettujen näytteiden laatua.

2.5 Pääkomponenttianalyysi (PCA)

PCA on monimuuttuja tilastollinen menetelmä. Se voi säilyttää riittävästi tietoa tiedonkeruusta. Tässä tutkimuksessa LC-kromatogrammeista tyypillisiä piikkejä seulottiin edelleen PCA:lla ja pyrittiin tunnistamaan aktiiviset yhdisteet spektri-vaikutussuhteen perusteella.

2.6 Kohdun kasvutesti

Hiiret jaettiin 12 ryhmään (1 0 ryhmää kohden). Cistanchesta valmistetut näyteliuokset kerättiin kymmenestä eri elinympäristöstä ja niitä annettiin kahdesti päivässä (aamulla ja illalla) letkuruokinnalla annoksella 30 g/kg ruumiinpainoa neljän päivän ajan. Nollakoeryhmä ja positiivinen kontrolliryhmä käsittivät yhtä suuret tilavuudet tislattua vettä ja dietyylistilboestroliliuosta, ja niitä annettiin kahdesti päivässä neljän päivän ajan. Viidentenä päivänä nukutetuista hiiristä otettiin lääkettä sisältävät verinäytteet. Näytteet sentrifugoitiin (5, 000 rpm, 10 min) ja supernatantit (lääkettä sisältävät seeruminäytteet) erotettiin. Lääkettä sisältävät seeruminäytteet inaktivoitiin kuumentamalla 56 asteessa vesihauteessa 30 minuuttia ja suodatettiin 022-μm suodattimen läpi ennen MTT-määritystä. Samanaikaisesti hiirten kohtut leikattiin välittömästi ja punnittiin kohdun painoindeksien laskemiseksi. Eläinkokeet aloitettiin viiden päivän sopeutumisen jälkeen. Hiiret ovat paastonneet yön yli vapaalla vedellä ennen testiliuosten antamista. Tämä tutkimus tehtiin tiukasti Kansallisten terveyslaitosten koe-eläinten hoito- ja käyttöoppaan suositusten mukaisesti. Harbin University of Commercen eläineettinen komitea tarkasteli ja hyväksyi kaikki kokeelliset menettelyt. Kaikki mahdollisesti stressaavat toimenpiteet suoritettiin natriumpentobarbitaalipuudutuksessa.

2,7 MTT-määritys

MCF7-soluja viljeltiin yhdessä RPMI 1640:n kanssa ilman fenolipunaista (joka sisälsi 5 % CDT-FBS:ää) neljän päivän ajan. Solut kylvettiin 96-kuoppalevyille tiheydellä 2,000 solua/kuoppa. Saavutettiin tarttuva viljelmä, ja 72 tunnin viljelyn jälkeen soluja viljeltiin yhdessä RPMI 1640 -elatusaineessa, joka sisälsi seeruminäytteitä Cistanchella käsitellyistä hiiristä. Kokeet suoritettiin kuudessa toistossa. Sen jälkeen kuhunkin kuoppaan lisättiin 20 µl MTT-liuosta (5 mg/ml PBS:ssä) ja soluja inkuboitiin 4 tuntia. Väliaineen poistamisen jälkeen lisättiin 150 ui DMSO:ta formatsaanituotteen tuottamiseksi, ja levyjä ravisteltiin pimeässä, jotta ne liukenisivat kokonaan. Absorbanssi mitattiin aallonpituudella 570 nm käyttäen Microplate Reader -laitetta. Proliferaationopeus laskettiin lääkettä sisältävän seerumin ryhmän keskimääräisenä absorbanssiarvona jaettuna nollakokeen kontrolliryhmän (solut, joita viljeltiin yhdessä RPMI 1640:ssä ilman seerumia) keskimääräisellä absorbanssiarvolla.

2.8 Tilastollinen analyysi

Parinäytteen t-testiä (kaksipyrstöä) käytettiin tunnistamaan tilastollisesti merkitseviä eroja arvojen välillä nollakontrolli- ja koeryhmissä. Erot katsottiin merkittäviksi 95 prosentin luottamustasolla (p <>

PCA:ta käytettiin arvioimaan tyypillisiä huippualueita kymmenestä eri elinympäristöstä otettujen näytteiden kromatogrammeissa. Bivariate-analyysiä ja Gray-korrelaatioanalyysiä käytettiin huippualueiden ja niiden estrogeenisen aktiivisuuden korrelaation arvioimiseen. Korrelaatio laskettiin SPSS-tilastoohjelmiston tilastotiedoilla (SPSS for Windows 21.0, SPSS Inc., USA). Erot katsottiin merkittäviksi 95 prosentin luottamustasolla (kaksisuuntainen).

Eettinen hyväksyntä: Suoritettu tutkimus ei liity ihmisten tai eläinten käyttöön.

cistanche akteosidilla on monia toimintoja

3 Tulokset ja keskustelu

3.1 Klusterianalyysi ja samankaltaisuuden arviointi

Retentioajan ja tunnusomaisten huippujen piikin alueen suhteellinen keskihajonta oli {{0}},58 ja 0,34 prosenttia tarkkuudella, 0,52 ja {{8} },31 prosenttia toistettavuuden osalta ja {{10}},19 ja 0,13 prosenttia stabiilisuuden osalta. Nämä havainnot osoittivat, että LC-menetelmämme sormenjälkien määrittämiseen oli kohtuullinen ja luotettava. Kymmenen näytteen kromatogrammien yhtäläisyydet olivat suurempia kuin 0,9. Kaikkien näytteiden yhteiset piikit eivät voineet täysin edustaa Cistanchen tyypillisiä ainesosia, koska piikki olisi voinut kadota. Siksi näytteen täsmäytysluku säädettiin 26:sta 20:een tarkemman kromatogrammikartan saamiseksi. Saatiin yhteensä 26 huippua, ja niiden pinta-alojen summa oli suurempi kuin 0,8 verrattuna näytteen piikkien kokonaispinta-alaan. Siksi päätimme, että nämä kromatografiset piikit voisivat tehokkaasti heijastaa Cistanchen tärkeimpiä kemiallisia ainesosia. Klusterianalyysin tulokset on esitetty kuvassa 1. Yhteensä kymmenen erilaista luontotyyppiä jaettiin kolmeen luokkaan seuraavasti: (A) 2, Guizhou; 3, Qinghai; 4, Chaidamu; 10, Neimeng; 7, Xinjiang ja 6, Sichuan. (B) 1, Xizang; 8, Ningxia ja 5, Alashan. (C) 9, Hubei. Klusterianalyysin trendi osoitti, että lääkeyrttien elinympäristöt ovat samanlaisia ​​kynnyksen alaosassa. Mutta kynnyksen noustessa elinympäristöjen ilmasto- ja kasvuolosuhteet ovat lähellä. Se osoittaa, että klusterianalyysi ei pysty ainoastaan ​​erottamaan hyvin erilaisia ​​elinympäristöjä, vaan myös heijastaa niiden välisiä affiniteetteja.

3.2 Kemiallisten aineosien tunnistaminen

Based on the synergy between components, TCM exerted pharmacological effects. Certain studies have been conducted to identify the chemical compositions of C. deserticola [24-26]. The correlation of inherent constituents with their activities indicated that they could be identified based on the combination of LC with the corresponding indices of pharmacological activity. Q-TOF-MS is suitable for multi-constituent identification of TCM since it can provide the exact molecular mass because of its high resolution. A total of 26 compounds were identified by analyzing the primary and secondary MS data. PCA was used to assess whether these compounds concerning their oestrogenic activity. A contribution of the activity is indicated by an eigenvalue higher than 1 (> 1) and a cumulative contribution rate of variables higher than 0.8 (>0.8). Mitä suurempi Eigen-kuormituksen absoluuttinen arvo on, sitä suurempi on yhdisteiden vaikutus estrogeenisiin indekseihin.

Cistanchen ja standardinäytteiden kromatogrammeja verrattiin yksittäisten komponenttien tunnistamiseksi samoissa LC-MS-olosuhteissa. Kuten taulukosta 1 käy ilmi, yhteensä 26 ainesosaa tunnistettiin retentioajan ja MS-tietojen [24-26] perusteella. Vaikuttavat aineet annetaan suun kautta seosten muodossa monomeerien sijaan, koska perinteinen kiinalainen lääketiede on seoksen muodossa terapeuttisen roolin saavuttamiseksi. Yhdellä yhdisteellä yksittäisen erotuksen jälkeen ei havaittu olevan merkitystä. Tavoitteemme on paljastaa yhdisteet, joilla on estrogeenista aktiivisuutta tunnetuissa Cistanchen [23-30] komponenteissa, eivätkä siksi valinneet NMR:ää tai muita teknisiä keinoja niiden identiteetin vahvistamiseksi. Piikki 1 osoitti vallitsevan deprotonoidun ionin m/z-suhteella 373 (C16H22O10), joka oli identtinen geniposidihapon alkuainekoostumuksen kanssa. Tätä tuki glukoosiosan menetys, joka tuotti fragmentti-ionin, jonka m/z-suhde oli 211. Piikki 2 osoitti vallitsevan deprotonoidun ionin m/z-suhteella 461 (C20H30O12), joka oli identtinen alkuainekoostumuksen kanssa. dekofeoyylilakteosidia, ja sitä tuki ramnosyyliosan menetys, jolloin muodostui fragmentaatio m/z-suhteella 315. Piikki 4 osoitti vallitsevan deprotonoidun ionin m/z-suhteella 375 (C16H24O10), joka oli identtinen 8-epilogaanihapon alkuainekoostumus. Glukoosiosan menetys, joka muodosti fragmentoitumisen m/z-suhteella 213, tuki edelleen päätelmää. Piikki 6 osoitti vallitsevan deprotonoidun ionin m/z-suhteella 607 (C29H36O14), joka oli identtinen syringalidi A3'- - l-ramnopyranosidin alkuainekoostumuksen kanssa.

Caff-osan menetys, joka muodosti fragmentti-ionin m/z-suhteella 445, tuki edelleen päätelmää. Piikki 8 osoitti vallitsevan deprotonoidun ionin m/z-suhteella 799 (C36H48O20), joka oli identtinen cistanosidi A:n alkuainekoostumuksen kanssa. Caff-osan menetys muodosti fragmentti-ionin, jonka m/z-suhde oli 637, tuki edelleen päätelmää. Piikki 11 osoitti vallitsevan deprotonoidun ionin m/z-suhteella 487 (C21H28O13), joka oli identtinen cistanosidi F:n alkuainekoostumuksen kanssa. Tätä tuki ramnosyyliosan menetys, joka tuotti fragmentti-ionin, jonka m/z suhde 341, ja toisen caff-osan menetys muodosti fragmentti-ionin, jonka m/z-suhde oli 179, tuki edelleen päätelmää. Piikki 12 osoitti vallitsevan deprotonoidun ionin m/z-suhteella 813 (C37H50O20), joka oli identtinen cistanosidi B:n alkuainekoostumuksen kanssa. Glukoosiosan menetys muodosti fragmentti-ionin, jonka m/z-suhde oli 651, tuki edelleen päätelmää. Piikki 13 osoitti vallitsevan deprotonoidun ionin m/z-suhteella 827 (C37H48O21), joka oli identtinen tubulosidi A:n alkuainekoostumuksen kanssa. Ramnosyyliosan menetys muodosti fragmentoitumisen m/z-suhteella 681. tuki johtopäätöstä. Piikki 14 osoitti vallitsevan deprotonoidun ionin m/z-suhteella 637 (C30H38O15), joka oli identtinen cistanosidi C:n alkuainekoostumuksen kanssa. Ramnosyyliosan häviäminen muodosti fragmentti-ionin, jonka m/z-suhde oli 491, tuki edelleen päätelmää.

Piikki 15 osoitti vallitsevan deprotonoidun ionin m/z-suhteella 591 (C29H36O13), joka oli identtinen osmantusidi B:n alkuainekoostumuksen kanssa. Ramnosyyliosan häviäminen muodosti fragmentti-ionin, jonka m/z-suhde oli 445, tuki edelleen päätelmää. Piikki 16 osoitti vallitsevan deprotonoidun ionin m/z-suhteella 623 (C29H36O15), joka oli identtinen akteosidin alkuainekoostumuksen kanssa. Caff-osan menetys muodosti fragmentti-ionin, jonka m/z-suhde oli 461,tuki edelleen päätelmää. Piikki 18 osoitti vallitsevan deprotonoidun ionin m/z-suhteella 623 (C29H36O15), joka oli identtinen isoakteosidin alkuainekoostumuksen kanssa. Caff-osan menetys, keulapiikki15 osoitti vallitsevan deprotonoidun ionin m/z-suhteella 591 (C29H36O13), joka oli identtinen osmantusidi B:n alkuainekoostumuksen kanssa. Ramnosyyliosan häviäminen muodosti fragmentti-ionin, jonka m/z-suhde oli 445. tuki johtopäätöstä. Piikki 16 osoitti vallitsevan deprotonoidun ionin m/z-suhteella 623 (C29H36O15), joka oli identtinen akteosidin alkuainekoostumuksen kanssa. Caff-osan menetys, joka muodosti fragmentti-ionin m/z-suhteella 461, tuki edelleen päätelmää. Piikki 17 osoitti vallitsevan deprotonoidun ionin m/z-suhteella 623 (C29H36O15), joka oli identtinen cis-akteosidin alkuainekoostumuksen kanssa. Caff-osan menetys muodosti fragmentin ioda-fragmentti-ioni, jonka m/z-suhde oli 461, tuki edelleen päätelmää. Piikki 21 osoitti vallitsevan deprotonoidun ionin m/z-suhteella 653 (C30H38O16), joka oli identtinen kampneosidin Ⅰ alkuainekoostumuksen kanssa.

Caff-osan menetys muodosti fragmentti-ionin, jonka m/z-suhde oli 491, ja toisen ramnosyyliosan menetys muodosti fragmentti-ionin, jonka m/z-suhde oli 345, mikä tukee edelleen päätelmää. Piikki 22 osoitti vallitsevan deprotonoidun ionin m/z-suhteella 665 (C31H38O16), joka oli identtinen tubulosidi B:n alkuainekoostumuksen kanssa. CH3CO-osan häviäminen muodosti fragmentti-ionin, jonka m/z-suhde oli 623, ja toisen caff-osan menetys muodosti fragmentti-ionin m/z-suhteella 461, mikä tukee edelleen päätelmää. Piikki 23 osoitti vallitsevan deprotonoidun ionin m/z-suhteella 639 (C29H36O16), joka oli identtinen kampneosidin alkuainekoostumuksen kanssa. Ramnosyyliosan menetys, joka muodosti fragmentti-ionin m/z-suhteella 493, tuki edelleen päätelmää. Piikki 24 osoitti vallitsevan deprotonoidun ionin m/z-suhteella 665 (C31H38O16), joka oli identtinen 2'-asetyylilakteosidin alkuainekoostumuksen kanssa. Ac-osan menetys muodosti fragmentti-ionin, jonka m/z-suhde oli 623, ja toisen caff-osan menetys muodosti fragmentti-ionin, jonka m/z-suhde oli 461, mikä tukee edelleen päätelmää. Piikki 25 osoitti vallitsevan deprotonoidun ionin m/z-suhteella 445 (C20H30O11), joka oli identtinen cistanosidi G:n alkuainekoostumuksen kanssa. Ramnosyyliosan häviäminen muodosti fragmentti-ionin, jonka m/z-suhde oli 299, tuki edelleen päätelmää. Yhdisteiden rakenteet on lueteltu kuvassa 2.

3.3 PCA

As shown in Table 2, the eigenvalues of the first eight principal components were higher than 1(> 1), and the cumulative contribution rate of the first six principal components was 93.417%. Therefore, the first six principal components were evaluated further. Table 2 indicates their eigenvalues and factor loadings. The first principal component exhibited a higher load based on the eigenvalues of the eight peaks (>0.9). Nämä piikit olivat seuraavat: 9, 12, 14 ja 15. Näin ollen ekinakosidi, cistanosidi B, osmantusidi B ja akteosidi, jotka vastaavat yhteensä 4 piikkiä, valittiin edustaviksi muuttujiksi estrogeeniselle aktiivisuudelle (kuvio 3).

.

3.4 Estrogeeniaktiivisuuden määrittäminen

Kohdun märkäpainon suhde kunkin hiiren ruumiinpainoon laskettiin (kuvio 4). Eläimet, jotka altistettiin Cistanchelle yhdeksästä elinympäristöstä, osoittivat merkittäviä estrogeenisiä aktiivisuuksia lisäämällä niiden kohdun painoa verrattuna nollakontrolliryhmän hiiriin. Kuvio 4 esittää lisäksi Cistanchella käsiteltyjen hiirten seerumilla käsiteltyjen MCF7-solujen proliferaationopeuden. Solut, joita käsiteltiin hiirten seerumeilla, joille annettiin Cistanchea kymmenestä elinympäristöstä, osoittivat merkittävästi nopeampaa kasvua verrattuna soluihin, joita ei ollut käsitelty.

3.5 Kaksimuuttuja-analyysi

Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että kypsymättömien naaraspuolisten Kunming-hiirten kohdun painot lisääntyivät ja ihmisen MCF7-rintasyöpäsolujen lisääntyminen edisti. Nämä havainnot vahvistivat Cistanchen estrogeenisen aktiivisuuden. Kuvio 5 osoitti näiden aineosien kohdun indeksit ja MCF7-solujen lisääntymisnopeudet. Suhteellisten huippupintojen laskemiseen käytettiin Pearsonin korrelaatiokerrointa, joka vastasi näytteiden estrogeenista aktiivisuutta. Yli 0,3 suurempia korrelaatiokertoimia pidettiin merkitsevinä (p < 0.05),="" kun="" taas="" korrelaatiokertoimia,="" jotka="" olivat="" korkeampia="" kuin="" 0,5,="" pidettiin="" erittäin="" merkitsevänä="" (p).="">< 0,01).="" tulosten="" perusteella="" cistanchen="" osoitettiin="" olevan="" estrogeenista="">

Yhteensä yhdeksän yhdistettä korreloi merkitsevästi kohdun painon nousun kanssa (p < {0}},05),="" kun="" taas="" kymmenen="" yhdistettä="" korreloi="" merkittävästi="" mcf7-solujen="" lisääntymisen="" kanssa="" (p="">< 0,05).="" kohdun="" painon="" ja="" solujen="" lisääntymisen="" kanssa="" merkittävästi="" korreloivat="" yhdisteet="" olivat="" 8-epilogaanihappo,="" salidrosidi,="" syringalidi="" a3'-="" -="" l-ramnopyranosidi,="" cistanosidi="" a,="" cistanosidi="" b,="" cistanosidi="" c,="" osmantusidi="" b,="" akteosidi,="" isoakteosidi,="" tubulosidi="" b,="" 2'-asetyylilakteosidi="" ja="" kaksi="" tuntematonta="" yhdistettä="" (kuvio="" 5).="" näillä="" kolmellatoista="" yhdisteellä="" oli="" estrogeenisiä="">

3.6 Harmaan korrelaatioanalyysimenetelmä

Kuvio 6 esittää 26 yhdisteen tunnusomaisten piikkien suhteellista korrelaatiota kohdun indeksien kanssa, ja kuvio 7 esittää 26 yhdisteen tunnusomaisten piikkien suhteellista korrelaatiota niiden soluproliferaationopeuksien kanssa. Yhteensä kolmella yhdisteellä oli suurin korrelaatio kohdun indeksien kanssa, nimittäin 8-epilogaanihappo, cistanosidi F ja akteosidi (kuvio 6, laskevassa järjestyksessä); kun taas kuusi yhdistettä, jotka osoittivat korkeimman korrelaation MCF7-solujen lisääntymisen kanssa, olivat ekinakosidi, cistanosidi F, sistanosidi B, osmantusidi B, isoakteosidi ja tubulosidi B (kuvio 7, laskevassa järjestyksessä). Ekinakosidin, osmantusidi B:n, akteosidin ja isoakteosidin suhteelliset korrelaatiot olivat korkeammat kuin 0,5.

3.7 LC-MS-olosuhteiden optimointi

Paremman kromatogrammikartan saamiseksi verrattiin metanolia ja asetonitriiliä. Lopulta vesipitoisen muurahaishapon (0,2 %, tilavuus/tilavuus) ja asetonitriilin yhdistelmä oli paras liikkuva faasi erottamiseen. 200-400nm:n täyden aallonpituuden skannauksen alueella 254 nm valittiin optimaaliseksi. Lisäksi MS-parametreja parannettiin. Negatiivisten ionien skannaustila valittiin, koska se paransi useimpien Cistanchen ainesosien vastearvoja.

4. Yhteenveto

LC-Q-TOF-MS-tekniikkaa käytettiin Cistanchen estrogeenisten aktiivisten aineosien tunnistamiseen. Tämä tutkimus osoitti, että 8-epilogaanihappo, salidrosidi, syringalideA3'- -l-ramnopyranosidi, sistanosidi A, ekinakosidi, sistanosidi F, sistanosidi B, sistanosidi C, osmantusidi B, akteosidi, isoakteosidi, tubulosidi B, 2'-asetyylilakteosidi ja kaksi tuntematonta yhdistettä olivat Cistanchen tärkeimmät aktiiviset ainesosat. Nämä havainnot edellyttävät kuitenkin lisätutkimuksia ainesosien in vivo -vaikutusten ja vaikutusmekanismin tutkimiseksi.

cistancheakteosidilla on monia tehtäviä, kuten immuunijärjestelmää vahvistava

Kiitokset:

Tätä hanketta tukivat Kiinan kansallinen luonnontieteellinen säätiö (nro 81073015), Heilongjiangin maakunnan luonnontieteellinen säätiö (ZD2017014) ja Heilongjiangin maakunnan Collegen nuorten innovatiivisten kykyjen koulutussuunnitelma (UNPYSCT{2}}). . Kirjoittajat vakuuttavat, että tämän artikkelin julkaisemisessa ei ole eturistiriitaa.

Viitteet

[1] Wang Z., Xia Q., Liu X., Liu W., Huang W., Mei X., Luo J., Shan M., Lin R., Zou D., Ma Z., Phytochemistry, farmakologia , laadunvalvonta ja Forsythia suspensan (Thunb.) tuleva tutkimus Vahl: A Review, J. Ethnopharmacol., 2018, 210, 318- 339.

[2] Shu Y., Liu Z., Zhao S., Song Z., He D., Wang M., Zeng H., Lu C., Lu A., Liu Y., Integrated and global pseudotargeted metabolomics strategy used Citrus TCM:ien laadunvalvontamerkkien seulomiseen, Anal. Bioanal. Chem., 2017, 409(20), 4849-4865.

[3] Yang B., Wang Y., Shan L., Zou J., Wu Y., Yang F., Zhang Y., Li Y., Zhang Y., A Novel and Practical Chromatographic "Fingerprint-ROC-SVM Perinteisen kiinalaisen lääketieteen injektioiden laatuanalyysiin sovellettu strategia: KuDieZi-injektion käyttö tapaustutkimuksena, Molecules., 2017, 22(7). PII: E1237.

[4] Zhuo L., Peng J., Zhao Y., Li D., Xie X., Tong L., Yu Z., QiShenYiQi tippuvien pillereiden bioaktiivisten laadunvalvontamerkkien seulonta perustuu erittäin korkean suorituskyvyn väliseen suhteeseen nestekromatografia sormenjälki ja verisuonia suojaava aktiivisuus, J. Sep. Sci., 2017, 40(20), 4076-4084.

[5] Liu N., Li J., Li BG, Monimuuttujatilastollisen analyysin ja ajattelun soveltaminen kiinalaisen lääketieteen laadunvalvonnassa, Zhongguo. Zhong. Yao. Za. Zhi., 2014, 39 (21), 4268-4271.

[6] Wang DD, Liang J., Yang WZ, Hou JJ, Yang M., Dai J., Wang Y., Jiang BH, Liu X., Wu WY, Guo DA, HPLC/qTOF-MS-suuntautuneiden ominaiskomponenttien tiedot sarja ja kemometrinen analyysi monimutkaisten TCM-valmisteiden kokonaisvaltaista laadunvalvontaa varten: Niuhuang Shangqing -pilleri esimerkkinä, J. Pharm. Biomed. Anal., 2014, 89, 130-141. [7] Hernaez R., Thrift AP, korkea negatiivinen ennustearvo, alhainen esiintyvyys ja spektrivaikutus: Caution in the Interpretation, Clin. Gastroenteroli. Hepatol., 2017, 15(9), 1355-1358.

[8] Liang J., Chen Y., Ren G., Dong W., Shi M., Xiong L., Li J., Dong J., Li F., Yuan J., Screening Hepatotoxic Components in Euodia rutaecarpa by UHPLC-QTOF/MS, joka perustuu spektri-toksisuussuhteeseen, Molecules., 2017, 22(8). PII: E1264.

[9] Li W., Sun X., Liu B., Zhang L., Fan Z., Ji Y., Evodia rutaecarpa maksatoksisen komponentin seulonta ja tunnistaminen spektri-vaikutussuhteen ja UPLC-Q-TOFMS:n perusteella, Biomed . Chromatogr., 2016, 30(12), 1975-1983.

[10] Chopard G., Puyraveau M., Binetruy M., Meyer A., ​​Vandel P., Magnin E., Berger E., Galmiche J., Mauny F., Spectrum Effect and Spectrum Bias in the Screening Test Performance for Spectrum Effect and Spectrum Bias in the Screening Test Performance for Amnestinen lievä kognitiivinen häiriö: mitkä ovat kliiniset vaikutukset?, J. Alzheimers. Dis., 2015, 48(2), 385-393.

[11] Xu GL, Xie M., Yang XY, Song Y., Yan C., Yang Y., Zhang X., Liu ZZ, Tian YX, Wang Y., Jiang R., Liu WR, Wang XH, hän GM, Spektri-vaikutussuhteet systemaattisena lähestymistapana perinteisen kiinalaisen lääketieteen tutkimukseen: nykytila ​​ja tulevaisuuden näkymät, Molecules., 2014, 19(11), 17897-17925.

[12] Zheng Q., Zhao Y., Wang J., Liu T., Zhang B., Gong M., Li J., Liu H., Han B., Zhang Y., Song X., Li Y. , Xiao X., Spektri-vaikutussuhteet UPLC-sormenjälkien ja Aconitum carmichaelii Debeaux'n (Fuzi) ja sen kolmen prosessoidun tuotteen mitokondrioiden kasvuun bioaktiivisuuden välillä yhdistettynä kanoniseen korrelaatioanalyysiin, J. Ethnopharmacol., 2014, 153(3) , 615-623.

[13] Shi Z., Liu Z., Liu C., Wu M., Su H., Ma X., Zang Y., Wang J., Zhao Y., Xiao X., Spectrum-Effect Relationships Between Chemical Fingerprints ja Lonicerae Japonicae Flos- ja Lonicerae Flos -pohjan antibakteeriset vaikutukset UPLC- ja mikrokalorimetriassa, edessä. Pharmacol., 2016, 7, 12.

[14] Usher-Smith JA, Sharp SJ, Griffin SJ, Spektrivaikutus riskien ennustamista, seulontaa ja diagnoosia koskevissa testeissä, BMJ, 2016, 353, i3139.

[15] Chen Y., Yu H., Wu H., Pan Y., Wang K., Liu L., Jin Y., Zhang C., Tracing novel hemostaattiset yhdisteet kuumennustuotteista Flos Sophoraen kokonaisflavonoidien perusteella spektrin perusteella -vaikutussuhteet ja pylväskromatografia, J. Sep. Sci., 2015, 38(10), 1691-1699.

[16] Liu X., Wang XL, Wu L., Li H., Qin KM, Cai H., Pei K., Liu T., Cai BC, Tutkimus Da-Huang-Fu-spektri-vaikutussuhteista Zi-Tang rotissa UHPLC-ESI-Q-TOF-MS-menetelmällä, J. Ethnopharmacol., 2014, 154(3), 606-612.

[17] Xie RF, Zhou X., Shi ZN, Li YM, Li ZC, tutkimus rhizoma Rhein, cortex Magnoliae Officinalisin, Fructus Aurantii Immaturusin ja niiden kaavan spektrivaikutussuhteesta, J. Chromatogr. Sci., 2013, 51(6), 524-532. [18] Li F., Yang X., Yang Y., Guo C., Zhang C., Yang Z., Li P., Antiosteoporotic activity of Echinacosid in ovariectomized rott, Phytomedicine., 2013, 20(6), { {9}}.

[19] Xiong WT, Gu L., Wang C., Sun HX, Liu X., Cistanche tubulosan antihyperglykeemiset ja hypolipideemiset vaikutukset tyypin 2 diabeettisilla DB/DB-hiirillä, J. Ethnopharmacol., 2013, 150(3) , 935- 945.

[20] Morikawa T., Ninomiya K., Imamura M., Akaki J., Fujikura S., Pan Y., Yuan D., Yoshikawa M., Jia X., Li Z., Muraoka O., asyloidut fenyylietanoidiglykosidit , ekinakosidi ja akteosidi Cistanche tubulosasta, parantavat glukoosin sietokykyä hiirillä, J. Nat. Med., 2014, 68(3), 561-566.

[21] Nan ZD, Zeng KW, Shi SP, Zhao MB, Jiang Y., Tu PF, fenyylietanoidiglykosidit, joilla on anti-inflammatorisia vaikutuksia Tarimin autiomaassa viljellyn Cistanche deserticolan varresta, Fitoterapia., 2013, 89, {{4 }}.

[22] Lu D., Zhang J., Yang Z., Liu H., Li S., Wu B., Ma Z., Cistanches Herban kvantitatiivinen analyysi käyttämällä korkean suorituskyvyn nestekromatografiaa yhdistettynä diodirivitunnistukseen ja korkeaan resoluutiomassaspektrometria yhdistettynä kemometrisiin menetelmiin, J. Sep. Sci., 2013, 36(12), 1945-1952.

[23] Han L., Boakye-Yiadom M., Liu E., Zhang Y., Li W., Song X., Fu F., Gao X., Cistanches deserticola YC Ma:n fenyylietanoidiglykosidien rakenteellinen karakterisointi ja tunnistaminen UHPLC/ESI-QTOF-MS/MS, Phytochem. Anal., 2012, 23(6), 668-676.

[24] Xiang Y., Jing Z., Haixia W., Ruitao Y., Huaixiu W., Zenggen L., Lijuan M., Yiping W., Yanduo T., Antiproliferative Activity of Phenylpropanoids Isolated from Lagotis brevituba Maxim, Phytother . Res., 2017, 31(10), 1509-1520.

[25] Yan Y., Song Q., Chen X., Li J., Li P., Wang Y., Liu T., Song Y., Tu P., Simultaneous determination of komponents with large polarity and content ranges in Cistanche tubulosa käyttäen sarjakytkettyä käänteisfaasi-hydrofiilistä vuorovaikutusta kromatografia-tandem-massaspektrometriaa, J. Chromatogr. A., 2017, 1501, 39-50.

[26] Zou P., Song Y., Lei W., Li J., Tu P., Jiang Y., 1H NMR-pohjaisen metabolomiikan soveltaminen eri osien erottamiseen ja uuden käsittelytyönkulun kehittäminen Cistanche deserticolalle, Acta. Pharm. Synti. B., 2017, 7(6), 647-656.

[27] Pan YN, tutkimukset tuoreen Cistanche tubulosan ainesosista ja bioaktiivisuudesta, Ph.D. opinnäytetyö, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang, Kiina, 2011.

[28] Cui Q., ​​Pan Y., Xu X., Zhang W., Wu X., Qu S., Liu X. Ihmisen tai rotan suolistobakteerien tai suoliston entsyymin tuottaman akteosidin metabolinen profiili in vitro käytettiin UPLC:tä Q-TOF–MS, Fitoterapia., 2016, 109, 67-74.

[29] Cui Q., ​​Pan Y., Bai X., Zhang W., Chen L., Liu X., Cistanche tubulosan ekinakosidin ja akteosidin metaboliittien systemaattinen karakterisointi rotan plasmassa, sapessa, virtsassa ja ulosteessa. UPLC-ESI-Q-TOF-MS, Biomed. Chromatogr., 2016(9), 1406-1415.

[30] Cui Q., ​​Pan Y., Yan X., Qu B., Liu X., Xiao W., metabolinen tapa tutkia liittyviä esteitä, jotka aiheuttavat huonon biologisen hyötyosuuden isoakteosidin oraalisessa annostelussa rotilla, jotka käyttävät ultrakorkeaa nestekromatografiaa/ kvadrupoli lentoajan tandemmassaspektrometria, Rapid. Commun. Mass. Spectrom., 2017(4), 371-380.