Isoliquiritigeniinin renoprotektiivinen vaikutus sisplatiinin aiheuttamaan akuuttiin munuaisvaurioon FPR2:n estämisen kautta makrofageissa

Lisätietoja saat ottamalla yhteyttä: ali.ma@wecistanche.com

Tan Rui-Zhi et ai

Napsauta Cistanchea munuaissairauksien hoitoon

Abstrakti

Akuutti munuaisvaurio (AKI) on vakava komplikaatio kriittisesti sairailla potilailla. Kertyvä näyttö osoitti, että makrofageilla on tärkeä tulehdusta edistävä rooliAkuutti munuaisvaurioja isoliquiritigenin (ISL) voivat estää makrofagista tulehdusta, mutta sen rooliAkuutti munuaisvaurioja taustalla olevaa mekanismia ei tunneta. Tämän tutkimuksen tavoitteena on tutkia ISL:n renoprotektiivista vaikutusta AKI:hen ja formyylipeptidireseptorien 2 (FPR2) roolia tässä prosessissa. Tässä tutkimuksessa sisplatiinin aiheuttamaa AKI-mallia ja lipopolysakkaridien aiheuttamaa makrofagien tulehdusmallia käytettiin in vivo- ja in vitro -kokeiden suorittamiseen. Tulokset osoittivat, että ISL helpotti voimakkaastimunuaisvaurioja inhiboivat munuaistulehdusta in vivo ja suppressoivat makrofagista tulehdusvastetta in vitro. Tärkeää on, että havaittiin, että FPR2:n säätely lisääntyi merkittävästi verrattuna kontrolliryhmään AKI- ja LPS-indusoiduissa makrofageissa, kun taas ISL suppressoi sitä voimakkaasti. Mielenkiintoista on, että FPR2:n yli-ilmentyminen pcDNA3:n transfektiolla.1-FPR2 kumosi tehokkaasti ISL:n anti-inflammatorisen vaikutuksen makrofageissa, mikä viittaa siihen, että FPR2 saattaa olla ISL:n mahdollinen kohde tulehduksen estämiseksi ja parantamiseksi.munuaisvaurio/Akuutti munuaisvaurio. Yhdessä nämä havainnot osoittivat, että ISL paransi sisplatiinin aiheuttamaa vaikutustamunuaisvaurioestämällä FPR2:ta osallistui makrofagiseen tulehdukseen, mikä voi tarjota mahdollisen terapeuttisen vaihtoehdon AKI:lle.

1. Esittely

Akuuttimunuainenvamma (AKI) on yleinen vakava tyyppimunuainensairaus, jonka kuolleisuus on korkea.1 Sille on ominaista nopea munuaisten toiminnan heikkeneminen, joka tapahtuu 7 päivässä tai vähemmän. Viimeaikaiset julkaisut raportoivat, että AKI:n ilmaantuvuus on jopa 5 prosenttia sairaalapotilaista ja 30 prosenttia vaikeista potilaista.AKIaiheuttaa vuosittain 2 miljoonaa kuolemaa maailmanlaajuisesti, mistä on tullut maailmanlaajuinen terveysongelma. Vaikka määritelmä on tavallinen ja yhtenäinen, AKI voi johtua useista syistä, mukaan lukien munuaistoksisten lääkkeiden saanti, iskemia-reperfuusiovaurio (Iskemia-reperfuusiovaurio, IRI), sepsis, sydän- ja verisuonikirurgia, verenpainetauti ja diabetes.2,3 Vanha ikä, diabetes ja sydämen vajaatoiminta lisäävät AKI:n riskiä, ​​joka johtaa yleensä irreversiibeliin krooniseen munuaissairauteen (CKD) ja loppuvaiheen munuaissairauteen (ESRD) joillakin potilailla.4 Tutkimukset ovat erityisesti osoittaneet, että lähes kaikki immuunisolut ovat mukana. munuaisten immuunitulehduksessa AKI:ssa.5 Niiden joukossa makrofageilla on osoitettu olevan tärkeä rooli munuaistulehduksen edistämisessä.6 Makrofagien poistaminen parantaa AKI:n munuaisvaurioita ja tulehdusta.7 Siksi makrofagien tulehduksen tehokas estäminen voi olla hyödyllistä nykyisten terapeuttisten lähestymistapojen parantaminen AKI:n hallinnassa.

Isoliquiritigenin (ISL) on kalkonirakenteinen flavonoidi, jonka juuret ovat kuuluisassa perinteisessä kiinalaisessa kasviperäisessä lääketieteessä.8 Viime vuosina se on herättänyt laajaa tutkijoiden huomiota antioksidanttinsa, tulehdusta, verihiutaleiden aggregaatiota ja antibakteerisuutensa ansiosta. , antiviraaliset, kasvaimia estävät, maksan suojaavat, hermostoa suojaavat, sydäntä suojaavat ja myrkyttömät ominaisuudet.9 ISL:n on osoitettu estävän solujen lisääntymistä, vähentävän ROS:ää ja indusoivan apoptoosia, nekroottista ja syöpäsolujen kuolemaa eriasteisesti.10 Viimeaikaiset raportit osoittivat, että isoliquiritigenin voi estää LPS:n lipidi A-osan indusoiman IL-6- ja TNF-a:n tuotantoa RAW264.7-makrofageissa ja heikentää LPS-TLR4/MD-2-kompleksin muodostumista. Lisäksi ISL voi indusoida HepG2-solujen apoptoosia ROS-välitteisten MAPK-, STAT3- ja NF-kB-signalointireittien kautta.11 Kokeelliset todisteet osoittivat myös, että ISL indusoi ROS-välitteistä sisäistä aktivaatiota ja aktivoi mitokondrio-sytokromi-c-kysteiiniproteaasimekanismin. PC-12-solujen apoptoosista. On syytä huomata, että ISL:ää käytetään usein naisten ravintolisänä.12 Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että ISL:llä on merkittävä anti-inflammatorinen vaikutus AKI:hen, mutta sen erityinen vaikutusmekanismi on edelleen epäselvä.

Tiimimme aikaisemmassa tutkimuksessa havaittiin, että Mincle, makrofagien aiheuttama C-tyypin lektiini, on transmembraaninen kuviontunnistusreseptori, joka osallistuu munuaistulehdukseen,13 jonka kautta seuloimme formyylipeptidireseptoreita 2 (FPR2), joilla on tietty suhde Mincleen. GEO-tietokanta. Sen roolia akuutissa munuaissairaudessa ei kuitenkaan ole varmistettu. FPR2 on proteiinia koodaava geeni, joka kuuluu G-proteiiniin kytkettyjen reseptorien perheeseen ja sisältää 351 aminohappotähdettä.14,15 Ne ovat 7- transmembraanisia G-proteiiniin kytkettyjä reseptoreita, jotka voivat välittää immuunisäätelyä, tulehdustekijöiden erittymistä, solujen kemotaksis ja soluadheesio, jotka liittyvät läheisesti eri sairauksien esiintymiseen ja kehittymiseen.16 Sen homologia FPR1:n ja FPR3:n kanssa on jopa 69 prosenttia ja 83 prosenttia. FPR2-alasolut sijaitsevat solukalvossa ja ovat monipäästökalvoproteiineja. Ne ilmentyvät pääasiassa neutrofiileissä, eosinofiileissä, monosyyteissä, epiteelisoluissa, fibroblasteissa, gliasoluissa, mesangiaalisoluissa jne., jakaantuneena eri elimiin, kuten keuhkoihin, pernaan ja maksaan. Erityisesti FPR2 ekspressoituu runsaasti munuaisten interstitiumissa17, jossa tulehdussolut sijaitsevat. FPR2:n päätehtävä on yhdistää tiettyjä erikoistuneita hajoamista edistäviä väliaineita (SPM) välittämään näiden metaboliittien aktiivisuutta tulehduksen tukahduttamisessa ja eliminoinnissa. FPR2:n rooli AKI-tulehduksessa ja sitä, voidaanko sitä käyttää kohteena lääkeinterventiossa, ei kuitenkaan vielä tiedetä.

Tässä tutkimuksessa käytimme nefrotoksisen lääkkeen -sisplatiinin aiheuttamaa hiiren AKI-mallia ja LPS-indusoitua tulehdussolumallia tutkiaksemme ISL:n parantavaa vaikutusta munuaisten vammaan ja tulehdukseen AKI:ssa sekä FPR2:n avainroolia munuaistulehduksessa. ja AKI:n ISL-hoito. Tämä tutkimus tarjoaa uusia ohjeita tulehdusvaurion mekanismin ja AKI:n hoitostrategioiden ymmärtämiseen.

2. Materiaalit ja metodit

2.1. Huumeet

Isoliquiritigenin (purity>98 prosenttia) on lakritsinjuuresta uutettu isoflavoniyhdiste. Sen molekyylikaava on C15H12O4. Tässä tutkimuksessa isoliquiritigeniini ostettiin yhtiöltä Chengdu Bio purify Phytochemicals Ltd. (BP0787), liuotettuna 10-prosenttiseen DMSO:hon (ST038, Beyotime, Kiina), ja sisplatiinilla indusoiduille hiirille annettiin mahalaukunsisäisesti annokset 7,5 mg/kg ja 30 mg /kg.

2.2. BMDM:n eristäminen

Urospuoliset C57BL/6-hiiret, joiden ikä oli 6-8 viikkoa, valittiin BMDM-solujen eristämiseksi. Irrota takaluu varovasti reisiluusta ja poista siihen kiinnittyneet lihakset. Jauha luut PBS:ssä huhmareella, kunnes luiden väri muuttuu punaisesta valkoiseksi. Kerää sen jälkeen supernatantti ja suodata 70 um:n siivilän läpi, minkä jälkeen sentrifugoi nopeudella 1500 rpm 5 minuutin ajan. Punasolut rikottiin suodatetussa nesteessä 10 - PBS:llä, joka sitten suodatettiin 40 mm:n solusiivilä. Inkuboi saatuja soluja 10 cm:n viljelymaljassa ja indusoi 30-prosenttisella L929-supernatantilla 7 päivää. BMDM-soluja stimuloitiin 100 ng/ml LPS:llä tulehduksellisen solumallin rakentamiseksi.

2.3. FPR2:n kaatuminen ja yli-ilmentyminen BMDM:ssä

FPR2 säädeltiin alas transfektoimalla Zeta LifeAdvanced Transfection Reagentilla (AD600050, Zeta life, USA) ja FPR2 siRNA:lla BMDM:ksi (FPR2 siRNA:n sekvenssit: Sense, 5'-GGAGAUGUGUAUUGUACAUTT-3'; Antisense, CAUCUCCTT-3'. Sangon Biotech, Kiina). Samoin pcDNA3.{12}}FPR2-plasmidi (valmistaja Fenghui Biotech, Kiina) transfektoitiin BMDM:ään ZETA:lla FPR2:n yli-ilmentämiseksi soluissa.

2.4. Eläinkokeet

Kaikki eläinkokeet suoritettiin Southwest Medical Universityn eettisen komitean ohjeiden mukaisesti. 32 urospuolista C57BL/6-hiirtä ostettiin yhtiöltä ChengduDaShuo Animal Co., Ltd, jotka jaettiin satunnaisesti 4 ryhmään: valeryhmä, malliryhmä (sisplatiinilla indusoitu AKI-ryhmä), ISL-pieniannoksen ryhmä (7,5 mg/kg, ryhmä L), ja suuren annoksen ryhmä (30 mg/kg, ryhmä H). Malliryhmälle annettiin 20 mg/kg sisplatiinia (P4394, Sigma-Aldrich, USA) ensimmäisenä päivänä, kun taas pieniannoksiselle ryhmälle annettiin 7,5 mg/kg ISL:ää ja korkealle ryhmälle 30 mg/kg ISL:ää 3 päivän ajan. . 3 päivän kuluttua seerumi ja munuaiset kerättiin tapetuista hiiristä.

2.5. Munuaisten toimintatesti

Kun olet kerännyt seerumin kustakin hiiriryhmästä, noudata tarkasti sarjan ohjeita seerumin kreatiniinin (C011-2-1, Jiancheng Biotech, Kiina) ja ureatypen (C013-2-1, Jiancheng Biotech, Kiina).

2.6. Patologinen värjäys

H&E-värjäys: leikkaus rutiininomaisesti vahanpoisto ja rehydratointi, hematoksyliinivärjäys 5 min, RO-vesihuuhtelu, 1-prosenttinen suolahappoalkoholierotus 2 s, vesijohtovesihuuhtelu, 75-prosenttinen etanoli-upotus 2 s, 1-prosenttinen alkoholiliukoinen eosiini 30 , vesijohtovesihuuhtelu, 100-prosenttinen etanoli Dehydrate 1 min, kuiva, ksyleeni läpinäkyvä 10 min, kuiva, sinetöi neutraalilla balsamikiinnitysaineella (36313ES60, Yepsen, Kiina).

PAS-värjäys: Viipaleet laitettiin perjodihappoliuokseen huoneenlämpötilaan 5e8 minuutiksi, minkä jälkeen huuhdeltiin kahdesti RO-vedellä. Laita sitten nämä viipaleet Schiff-reagenssiin 10–20 minuutiksi, huuhtele vesijohtovedellä 10 minuutin ajan, värjätä hematoksyliinillä 1–2 minuutin ajan, kuivaa ja läpinäkyvä 100-prosenttisessa alkoholissa, kuivaa, sulje neutraalilla balsamikiinnitysaineella.

2.7. Immunofluoresenssi

Aseta pakastetut kudosleikkeet PBS:ään, pese kahdesti, kiinnitä 10-prosenttisella formaldehydillä 10 minuutin ajan. Leikkeillä oleva kudos blokattiin 5-prosenttisella vuohen seerumilla 30 minuutin ajan, minkä jälkeen inkuboitiin ensisijaisen hiiren anti-hiiri-FPR2:n (1:200, sc-57141, Santa Cruz, USA) ja rotan anti-hiiri-F4/80:n kanssa. vasta-aineet (1:200, sc-52664, Santa Cruz, USA)4 - C:ssa yön yli. Pese leikkeet kahdesti seuraavana päivänä PBS:llä, inkuboi sekundaarisen vasta-aineen kanssa (1:200) huoneenlämmössä 1 tunnin ajan ja värjää ydin DAPI:lla. Kuvat on otettu EVOS-järjestelmällä.

2.8. Elisa

IL-1b, IL-6, TNF-a:n pitoisuus seerumissa ja solusupernatantissa analysoitiin ELISA-sarjoilla (EMC001B, EMC004, EMC102A, Neobioscience, Kiina) pakkauksen ohjeiden mukaisesti.

2.9. RealTime-PCR

Kokonais-RNA uutettiin käyttämällä RNA-uuttopakkausta (Tangen, Kiina) noudattaen valmistajan ohjeita. Uutetun RNA:n käänteisen transkription cDNA:ksi lisäämisen jälkeen 10 ml:n reaktiojärjestelmään reaaliaikaisen PCR:n suorittamiseksi Roche LightCycler 480 -järjestelmällä ja reaktiojärjestelmä on seuraava: Eastep® qPCR MasterMix 2 -, 5 ml; cDNA-templaatti, 1 ml; ylävirran aluke (10 mM), 0,5 ml; alavirran aluke (10 mM), 0,5 ml; Nukleaasiton vesi, 3 ml. Tässä kokeessa käytetyt alukkeet syntetisoi Sangon (Shanghai, Kiina), ja kaikkien alukkeiden sekvenssit on lueteltu taulukossa 1.

2.10. Western blot

RIPA-lyysipuskuria käytettiin proteiinin uuttamiseen munuaiskudoksista ja BMDM-soluista. Sen jälkeen kun proteiini on erotettu 10-prosenttisessa SDS-PAGEgeelissä ja siirretty PVDF-kalvolle, kalvo blokattu 5-prosenttisessa BSA:ssa 1 tunnin ajan ja pesty TBST:llä 3 kertaa, minkä jälkeen kalvoa on inkuboitu primääristen vasta-aineiden kanssa 4 - C:ssa yön yli (valmistettu) 5 prosentin BSA:lla, 1:1000). Sitten kalvoja inkuboitiin sekundaarisen vasta-aineen kanssa (peroksidaasilla konjugoitu vuohen anti-hiiri-IgG (ZB-2305, 1:3000), vuohen anti-kanin IgG (ZB-2301, 1:3000)). huoneenlämmössä 1 h. Kuvat on otettu geelikuvausjärjestelmällä (BIORAD, USA). Nauhojen harmaan intensiteetti laskettiin Image J -ohjelmistolla.

2.11. Tilastollinen analyysi

Tulokset esitettiin keskiarvona ± standardipoikkeama. Tietojen analysointi suoritettiin yksisuuntaisella ANOVA-testillä, jota seurasi moninkertainen vertailu LSD-testiin käyttämällä SPSS-ohjelmistoa 21.0. P < 0,05="" katsottiin="" tilastollisesti="" merkitseväksi.="" jokainen="" koeryhmä="" toistuu="" 3="">

3. Tulokset

3.1. Isolikiviritigeniini paransi sisplatiinin aiheuttamaa munuaisvauriota ja esti munuaistulehdusta

Tutkiaksemme isoliquiritigeniinin renoprotektiivisia ja anti-inflammatorisia vaikutuksia AKI:ssa havaitsimme kunkin ryhmän seerumin Cre- ja BUN-tasot sekä inflammatorisen sytokiinin ilmentymisen ja erittymisen reaaliaikaisella PCR:llä ja ELISA:lla. Lisäksi munuaisten patologia mitattiin H&E- ja PAS-värjäyksellä. Tulokset osoittivat, että verrattuna normaaliryhmään seerumin Cre- ja BUN-tasot nousivat AKI-mallissa, kun taas hoito 7,5 mg/kg tai 30 mg/kg ISL:llä alensi merkittävästi seerumin Cre- ja BUN-tasoja mm. 30 mg/kg annoksella on paras terapeuttinen vaikutus (kuvat 1A ja B). Erityisesti 30 mg/kg ISL:ää voi parantaa munuaisten tubulusvauriota arvioidun tubulusnekroosiprosentin mukaan (kuvio 1C). ELISA- ja PCR-tulokset osoittivat, että IL-1b:n, IL-6:n ja TNF-a:n eritys on vähentynyt ISL-toimenpiteen (7,5 mg/kg ja 30 mg/kg) jälkeen ja mRNA:n ilmentyminen. IL-1b, IL-6 ja TNF-a vähenivät myös huomattavasti, kun annettiin 30 mg/kg ISL:ää (kuvio 1DeI). Toisaalta H&E- ja PAS-värjäystulokset osoittivat, että AKI-ryhmän munuaisissa esiintyi vakavia munuaistiehyiden vaurioita, munuaisten epiteelin irtoamista, mesangiaalisolujen ja mesangiaalisen interstitiaalisen hyperplasiaa sekä tulehdussolujen infiltraatiota, yllättäen 30 mg/kg ISL:ää. voi tehokkaasti kumota munuaisvaurion AKI:ssa (kuva 1J). Kaikki tulokset paljastivat, että 7,5 mg/kg ja 30 mg/kg ISL:n antaminen voi sekä parantaa sisplatiinin aiheuttamaa munuaisvauriota että estää munuaistulehdusta, jossa 30 mg/kg ISL:llä on paras vaikutus.

3.2. Isoliquiritigenin vähensi FPR2:n ilmentymistä AKI-hiirten makrofageissa

Monet aiemmat raportit osoittivat, että FPR2:lla on tärkeä rooli immuunivasteessa ja tulehduksiin liittyvissä sairauksissa. FPR2:n mahdollinen vaikutus AKI:n munuaisiin on kuitenkin määrittelemätön. Tässä tutkimuksessa suoritimme immunofluoresenssia FPR2:n ja makrofagien (F4/80, makrofagien valmistaja) paikallistamiseksi. Tulokset osoittivat, että makrofagit (vihreät täplät) tunkeutuivat laajasti AKI-hiirten munuaisiin, kun taas FPR2 (punaiset täplät) sijaitsi yhdessä F4/80:n kanssa, mikä osoittaa, että FPR2 ilmeni pääasiassa makrofageissa ja FPR2:n taso oli merkitsevästi. lisääntynyt AKI-hiirten munuaisissa (kuvio 2A). Lisäksi havaitsimme FPR2-mRNA:n ja tulehdukseen liittyvien proteiinien ilmentymisen reaaliaikaisella PCR:llä ja Western blot -analyysillä munuaisissa, ja tulokset osoittivat, että 30 mg/kg ISL:ää voi tehokkaasti alentaa FPR2:n mRNA- ja proteiinitasoja munuaisissa. AKI-hiirten munuainen verrattuna ISL-ryhmän 7,5 mg/kg:aan (kuvio 2B, G, H). Tärkeää on, että Western blot -tulokset osoittivat, että 30 mg/kg ISL:ää esti myös p-65:n aktivaatiota ja alensi TNF-a:n, IL-6- ja IL{{28}-proteiinitasoja. }b AKI-hiirten munuaisissa (kuvio 2CeF). Kaikki yllä olevat tiedot viittasivat siihen, että AKI-hiirten ISL:llä lievitetty munuaistulehdus voi liittyä FPR2:n ilmentymisen vähentämiseen makrofageissa.

3.3. Isolikiviritigeniini tukahdutti FPR2:n ja tulehduksellisten sytokiinien ilmentymisen ja erittymisen LPS-indusoiduissa BMDM-soluissa

ISL:n vaikutusten LPS-indusoituihin BMDM-soluihin havaitsemiseksi edelleen tutkimme FPR2:n mRNA-tason, ilmentymisen ja tulehduksellisten sytokiinien erittymisen LPS-indusoiduissa BMDM-soluissa ISL:n antamisen jälkeen reaaliaikaisella PCR:llä ja ELISA:lla. Tulokset osoittivat, että ISL alensi FPR2:n, IL-1b:n, IL-6:n ja TNF-a:n mRNA-tasoa (kuva 3AeD) sekä IL-1b:n eritystä. IL-6 ja TNF-a solun supernatantissa LPS-indusoiduissa BMDM-soluissa (kuvio 3EeG). Yllä olevat tulokset viittasivat siihen, että ISL:n hoito pitoisuudella 40 mM inhiboi voimakkaasti tulehdusta LPS-indusoiduissa BMDM-soluissa.

3.4. Isolikiviritigeniini alensi FPR2:n ja tulehduksellisten sytokiinien proteiinitasoja LPS-indusoiduissa BMDM-soluissa

Havaitsimme myös FPR2:n ja tulehduksellisten sytokiinien proteiinitasot LPS-indusoiduissa BMDM-soluissa ISL:n antamisen jälkeen Western blot -menetelmällä. Tiedot osoittivat, että verrokkiryhmään verrattuna FPR2:n, p-p65:n, IL-6:n ja TNF-a:n proteiinitasot kasvoivat merkittävästi LPS-indusoiduissa BMDM-soluissa ja laskivat voimakkaasti 40 mM ISL:n antamisella ( Kuva 4AeE). Nämä tulokset havainnollistavat edelleen, että ISL voi suppressoida NF-kB:n aktivaatiota ja alentaa tulehduksellisten sytokiinien proteiinitasoja LPS-indusoiduissa BMDM-soluissa.

3.5. FPR2:n esto tukahdutti LPS:n aiheuttaman tulehduksen BMDM-soluissa

FPR2:n roolin tutkimiseksi makrofagitulehduksessa käytimme siRNA:ta FPR2:n kaappaamiseen BMDM-soluissa. Tulokset osoittivat, että siRNA-transfektio voi merkittävästi estää FPR2:n ilmentymistä LPS-indusoiduissa makrofageissa (kuvio 5A) ja vähentää tehokkaasti IL-1b:n ja TNF-a:n ilmentymistä (kuvio 5B ja C). Lisäksi Western blot -tulokset osoittivat, että siRNA-transfektion jälkeen FPR2:n proteiinitaso estyi merkittävästi riippumatta siitä, stimuloiko sitä LPS (kuvio 5D ja E). Erityisesti FPR2:n kaataminen alensi merkittävästi tulehduksellisten sytokiinien proteiinitasoja ja esti NF-kB-signaloinnin aktiivisuutta (kuvio 5FeK), mikä osoittaa, että FPR2:lla on tärkeä rooli tulehdusvasteen edistämisessä makrofageissa. Se voi myös olla ISL:n tärkein kohde makrofagitulehduksen estämisessä.

3.6. FPR2:n yli-ilmentyminen vastusti isoliquiritigeniinin tulehdusta estävää vaikutusta LPS-indusoiduissa BMDM-soluissa

Sen määrittämiseksi, että ISL suppressoi tulehdusta AKI:ssa estämällä FPR2:ta makrofageissa, käytimme FPR2:n yliekspressioplasmidia säätelemään FPR2:n ilmentymistä ISL-käsitellyissä tulehduksellisissa BMDM-soluissa. Kuten kuvasta 6 näkyy, FPR2:n proteiini- ja mRNA-taso nousi merkittävästi pcDNA3:ssa.1- FPR2-transfektoitu ryhmä (kuvat 6A, B, G), ja FPR2:n yli-ilmentyminen poisti tehokkaasti 40:n estävän vaikutuksen. mM ISL p65:n aktivaatioon ja IL-1b:n, IL-6:n ja TNF-a:n proteiinitasoihin LPS-indusoiduissa BMDM-soluissa (kuvio 6CeF). Samoin FPR2:n lisääntynyt säätely poisti 40 mM ISL:n estävän vaikutuksen tulehduksellisten sytokiinien ilmentymiseen ja erittymiseen LPS-indusoiduissa BMDM-soluissa, kuten IL-1b, IL-6 ja TNF-a. (kuvio 6HeM), mikä viittaa siihen, että ISL vähensi tulehdusta LPS-indusoiduissa BMDM-soluissa inhiboimalla FPR2:ta.

4. Keskustelu

Akuutti munuaisvaurio on yksi yleisimmistä kliinisistä sairauksista. Se johtaa yleensä potilaiden immuunijärjestelmän heikkenemiseen lyhyessä ajassa. Trauma-verenhukan, elinvaurion, shokin tapauksissa munuainen on herkin elin ja se on taipuvainen kehittymään akuutiksi vaurioksi.18e20 Lukuisat tutkimukset ovat vahvistaneet, että tulehduksella on keskeinen rooli AKI:n kehittymisessä, mitä on harkittu mahdollisena interventiokohteena AKI-hoidolle. Viime vuosina kiinalaiset lääkkeet ovat edistyneet valtavasti tulehduksen hoidossa, mukaan lukien kurkumiini, kversetiini, naringeniini ja muut monomeerit. Isolikviritigeniini on flavonoidiyhdiste, jolla on monia biologisia vaikutuksia, kuten anti-inflammatorisia, vapaita radikaaleja, kasvaimia estäviä ja muita vaikutuksia.21 Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että ISL esti apoptoosia, tulehdusta ja solunulkoisen matriisin tuotantoa angiotensiinissä. II-indusoidut HK-2-solut.22 Wu Yangpingin tutkimukset osoittivat, että ISL voi heikentää IL-6- ja IL-8-arvoja estämällä NF-kB:n aktiivisuutta psoriaasimallissa, mikä viittaa ISL voi olla ehdokas psoriaasin ja muiden autoimmuunitulehduksellisten sairauksien hoitoon.23 Toisaalta äskettäinen tutkimus osoitti, että ISL voi lievittää septistä AKI:ta estämällä NF-kB p65:n translokaatiota ja estämällä tulehdusvasteita.24 Tässä tutkimuksessa me havaitsivat, että ISL voi tehokkaasti parantaa munuaisten toimintaa sisplatiinin aiheuttamissa AKI-hiirissä, vähentää munuaisvaurioita ja estää munuaistulehdusta. ISL:n tulehdusta estävän tarkka mekanismi on kuitenkin epäselvä.

FPR2 kuuluu kemotaktisten reseptorien perheeseen ja on G-proteiiniin kytketty reseptori, joka on 7 kertaa transmembraaninen. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että FPR2 on osallisena monissa fysiologisissa ja patologisissa prosesseissa, mukaan lukien puolustusvasteet, tulehdukset, hermostoa rappeuttavat sairaudet, kasvaimet, glukoosi- ja lipidiaineenvaihduntaan liittyvät häiriöt.25,26 FPR2:ta voivat lisätä lipopolysakkaridit, erilaiset tulehdustekijät, ja prostaglandiini E2 tulehdusprosessissa, jolla voi olla anti-inflammatorinen ja tulehdusta estävä rooli.27,28 FPR2:n erilaiset vaikutukset tulehdukseen riippuvat ympäristöstä ja ligandeista, jotka aktivoivat erilaisia ​​signaalireittejä.29 Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että FPR2 ilmentyy pääasiassa makrofageissa munuaisten interstitiumissa, ja se ekspressoituu voimakkaasti sisplatiinin aiheuttamien AKI-hiirten munuaisissa, mikä viittaa siihen, että makrofageissa oleva FPR2 voi olla osallisena AKI-munuaisen makrofagien tulehdusvasteessa. Yhä useammat todisteet ovat vahvistaneet, että suuri määrä makrofageja on tunkeutunut munuaiseen muutaman tunnin kuluessa AKI:n esiintymisestä ja pahentanut munuaisvaurioita reagoimalla tulehdukseen.30e33 Siksi AKI-munuaisen infiltroituneiden makrofagien tulehduksen säätely voi vähentyä. olla tärkeä suunta parantaa AKI:tä, ja onko FPR2 mukana tässä prosessissa, ei tiedetä.

Kokeelliset tulokset osoittivat, että hoito pienillä ja suurilla annoksilla ISL:llä sisplatiinilla indusoiduilla AKI-hiirillä ei ainoastaan ​​voi parantaa munuaisten rakennetta ja toimintaa, vaan myös vähentää tulehduksellisten sytokiinien tasoa. Lisäksi ISL voi tehokkaasti alentaa FPR2:n proteiinitasoa ja p65:n aktiivisuutta. Koska FPR2 ilmentyy pääasiassa makrofageissa, se osoittaa, että ISL voi parantaa munuaistulehdusta estämällä FPR2:ta makrofageissa. Koska infiltroituneella makrofagilla on tärkeä rooli munuaistulehduksessa, loimme sitten primaarisia luuytimestä peräisin olevia makrofageja ISL:n makrofagitulehdukseen parantavan vaikutuksen ja mahdollisen mekanismin in vitro havaitsemiseksi. Tuloksemme osoittivat, että ISL voi merkittävästi estää LPS:n aiheuttamaa makrofagitulehdusta ja vähentää tulehduksellisten tekijöiden IL-1b, IL-6 ja TNF-a:n ilmentymistä ja eritystä. Samanaikaisesti ISL voi myös vähentää tulehdusmolekyylien proteiinitasoa makrofageissa ja estää LPS:n stimuloimaa FPR2:n mRNA-ilmentymistä ja proteiinitasoja. Vahvistaaksemme FPR2:n avainroolin tulehduksen estämisessä ISL:llä käytimme pcDNA3.{18}}FPR2-plasmidia FPR2:n yli-ilmentämiseen ja havaitsimme, että ISL:llä käsitellyssä tulehduksellisessa makrofaagissa FPR2:n yli-ilmentyminen neutraloi ISL:n tulehdusta estävän vaikutuksen. mikä osoittaa, että ISL:n hillitsemä makrofagitulehdus johtuu pääasiassa FPR2:n estämisestä. Erityisesti käytimme sisplatiinin aiheuttamaa AKI-mallia in vivo ja valitsimme LPS-indusoidun tulehdussolumallin in vitro. Vaikka näiden kahden mallin induktioreagenssit eivät ole yhdenmukaisia, näiden kahden menetelmän tunnustetaan tällä hetkellä rakentavan tulehdusmalleja in vivo ja in vitro, vastaavasti. Koska tämä tutkimus keskittyy tulehdusvasteisiin, on mahdollista käyttää näitä kahta menetelmää yhdessä tutkimuksessa.

Nämä tiedot osoittivat, että ISL voi tehokkaasti vähentää tulehdustekijöiden ilmentymistä in vivo ja in vitro, ja se voidaan saavuttaa estämällä FPR2:n ilmentymistä. ISL voi siten toimia mahdollisena terapeuttisena lääkkeenä AKI:lle.

Kiitokset

Tätä työtä tuki Luzhou - Southwest Medical University Joint Project (2017LZXNYD-P01 ja 2018LZXNYD-PT03), Southwest Medical University - Affiliated Traditional Medicine Hospital Joint Project (2018XYLH-034), Sichuanin laboratorion rakennusprojekti. Lääketiede (2018#53), Luzhoun tiede- ja teknologiaprojekti (2020-JYJ-56) ja Luzhou Municipal - Southwest Medical Universityn yhteinen erityisapuraha korkean tason kykyjen esittelyyn (Lan Hui-Yao Team ).

Viitteet

1. Soares DB, Mambrini JVM, Botelho GR, Girundi FF, Botoni FA, Martins MAP. Lääkehoito ja muut tekijät, jotka liittyvät akuutin munuaisvaurion kehittymiseen kriittisesti sairailla potilailla: poikkileikkaustutkimus.PeerJ. 2018;6:e5405. e-pub ennen tulostamista 22.8.2018.

2. Sato Y, Yanagita M. Immuunisolut ja tulehdus AKI:ssa CKD:n etenemiseen.Am J Physiol Ren Physiol. 2018;315(6):F1501eF1512. e-pub ennen tulosta 2018/08/30.

3. Ram P, Mezue K, Pressman G, Rangaswami J. Akuutti munuaisvaurio transkatetrin aorttaläpän korvaamisen jälkeen.Clin Cardiol. 2017;40(12):1357e1362. e-pub ennen tulosta 2017/12/19.

4. YH H, IJ C, YF L, YJ C, YH L, HW C. Laktoferriini edistää renoprotektiivista vaikutusta akuutissa munuaisvauriossa ja varhaisessa munuaisfibroosissa.Pharmaceutics. 2020;12(5):434.

5. Bonavia A, Singbartl K. Katsaus immuunisolujen rooliin akuutissa munuaisvauriossa.Pediatr Nephrol. 2018;33(10):1629e1639. e-pub ennen tulostamista 2017/08/13.

6. Li J, Tang Y, Tang PMK, et ai. Makrofagien migraatiota estävän tekijän estäminen suojaa sisplatiinin aiheuttamalta akuutilta munuaisvauriolta hiirillä.Mol Siellä. 2018;26(10):2523e2532. e-pub ennen tulostamista 2018/08/06.

7. Ferenbach DA, Sheldrake TA, Dhaliwal K, et ai. Klodronaatin, mutta ei difteriatoksiinin, aiheuttama makrofagien/monosyyttien ehtyminen parantaa munuaisiskemiaa/reperfuusiovauriota hiirillä.Kidney Int. 2012;82(8):928e933. e-pub ennen tulosta 2012/06/08.

8. JQ, JC, BM, et ai. Isolikiviritigeniini estää ateroskleroosia estämällä TRPC5-kanavan ilmentymisen.Sydän- ja verisuoniterapiat. 2020;2020:1926249.

9. YG, XL, HY, LP, X C. Isolikiviritigeniinillä on antioksidanttisia ja anti-inflammatorisia vaikutuksia aktivoimalla KEAP-1/Nrf2-reittiä ja estämällä NF-kB- ja NLRP3-reittejä karrageenin aiheuttamassa keuhkopussin tulehduksessa.Ruokaa& toiminto. 2020;11(3):2522e2534.

10. LS, XY, XY, YW, Q Z. Isoliquiritigenin indusoi ihmisen virtsarakon syövän T24-solujen apoptoosia sykliinistä riippuvaisen kinaasiriippumattoman mekanismin kautta.Onkologiset kirjeet. 2017;14(1):241e249.

11. Wang JR, Luo YH, Piao XJ, et ai. Isoliquiritigeniinin aiheuttaman apoptoosin ja solusyklin pysähtymisen taustalla olevat mekanismit ROS-välitteisten MAPK/STAT3/NF-kappaB-reittien kautta ihmisen hepatosellulaarisissa karsinoomasoluissa.Drug DevRes. 2019;80(4):461e470. e-pub ennen tulostamista 31.1.2019.

12. AH, CS, YY, et ai. Lakritsilajien estrogeenisen aktiivisuuden arviointi verrattuna humalaan, jota käytetään vaihdevuosioireiden hoitoon kasviperäisissä aineissa.PLoSYksi. 2013;8(7):e67947.

13. LL L, PM T, CJ L, et ai. Kuviontunnistusreseptori Mincle on välttämätön M1-makrofagifenotyypin ylläpitämiseksi akuutissa munuaistulehduksessa.Kidney Int. 2017;91(3):587e602.

14. Schroder N, Schaffrath A, Welter JA, et ai. Formyylipeptidireseptorien estäminen parantaa tuloksia Alzheimerin taudin hiirimallissa.JHermoston tulehdus. 2020;17(1):131. e-pub ennen tulostamista 26.4.2020.

15. Neymeyer H, Labels R, Reverte V, et ai. Anneksiini A1 -signaloinnin aktivaatio munuaisten fibroblasteissa saa aikaan antifibroottisia vaikutuksia.Acta Physiol. 2015;215(3):144e158. e-pub ennen tulostamista 2015/09/04.

16. FC, MP, RA. Eri formyylipeptidireseptori 2:n (FPR2) agonistien herättämät erottuvat signalointikaskadit.Int J Mol Sei. 2013;14(4):7193e7230.

17. HW, XP, YG, et ai. Ganoderma-A:sta johdettu yhdiste vaikuttaa estävästi formyylipeptidireseptorin 2 kautta.Front Pharmacol. 2020;11:337.

18. Wang Y, Cai J, Tang C, Dong Z. Mitofagia akuutissa munuaisvauriossa ja munuaisten korjauksessa.Solut. 2020;9(2). e-pub ennen tulosta 2020/02/07.

19. Sato Y, Takahashi M, Yanagita M. Pathophysiology of AKI to CKD progression.Semin Nephrol. 2020;40(2):206e215. e-pub ennen tulostamista 19.4.2020.

20. Ronco C, Bellomo R, Kellum JA. Akuutti munuaisvaurio.Lansetti. 2019;394(10212):1949e1964. e-pub ennen tulosta 2019/11/30.

21. PZ, HM J, JW Z, et ai. Isoliquiritigeniinin suojaava vaikutus aivovaurioita vastaan ​​septisillä hiirillä NF-kB:n heikkenemisen kautta.Sisäänflammofarmakologia. 2019;27(4): 809e816.

22. DX, WH, ST Y, YS T. Isoliquiritigenin lievitti Ang II:n aiheuttamaa hypertensiivistä munuaisvauriota estämällä tulehdussytokiineja ja oksidatiivisen stressin aiheuttamaa apoptoosia Nrf2- ja NF-kB-reittien kautta.Biochem BiophysRes Commun. 2018;506(1):161e168.

23. YW, XC, XG, et ai. Isolikiviritigeniini estää psoriaasin kaltaisten oireiden etenemisen estämällä NF-kB:tä ja tulehdusta aiheuttavia sytokiinejä.J MolMed(Berl). 2016;94(2):195e206.