Kuuden tehokkaan komponentin nopea samanaikainen määritys Cistanche Tubulosasta lähi-infrapunaspektroskopialla

1. Johdanto

Cistanche (Hoffmg. Et Link) on Orobanchaceae-kasvien perheen monivuotinen fanerogaminen suku. Useimpia Cistanche-sukuun kuuluvia lajeja on käytetty lääkekasvina vuosituhansien ajan Kiinassa; heillä on maine erinomaisena tonicina; ja tunnetaan nimellä "Aavikoiden ginseng". Cistanche tubulosa on monivuotisen Tamarix chinensis -kasvin juurien pakollinen loinen. Se on dokumentoitu Kiinan farmakopeaan alkuperäiseksi lähteeksiCistanches Herba(kiinalainen nimi: Roucongrong) vuoden 2005 painoksesta. Nykyaikainen farmakologinen tutkimus Cistanche-lajeista aloitettiin 1980-luvulla. Farmakologiset tutkimukset osoittivat, että Cistanche-kasvien uutteilla on laaja kirjo toimintoja, kuten munuaisten vajaatoiminnan ja seniilin ummetuksen parantaminen, oppimis- ja muistamiskyvyn edistäminen, Alzheimerin taudin torjunta, vastustuskyvyn parantaminen, ikääntymisen esto, väsymys jne. Viimeisten kolmen vuosikymmenen aikana kattavat ja systemaattiset farmakologiset tutkimukset on yhdistetty fytokemiallisiin tutkimuksiin Cistanche-kasvien juurten hyödyllisten vaikutusten aineellisen perustan valaisemiseksi. Nämä tutkimukset osoittavat, että fenyylietanoidiglykosidit (PhG) olivat tärkeimmät tehokkaat komponentit Cistanche-kasveissa, joilla oli avainrooleja munuaisten vajaatoiminnan, impotenssin, ikääntymisen ja Alzheimerin taudin hoidossa. Kahden PhG:n (ekinakosidin ja verbaskosidin) sisältö vaadittiin Kiinan farmakopeassa. Sillä välin hiilihydraatit, kuten mannitoli, sakkaroosi, glukoosi ja fruktoosi Cistanchen kasveissa, omistavat laksatiivisen toiminnon ja hiilihydraattiklusterit.Cistanchen kasviton käytetty ummetuksen hoitoon.

LUONNOLLINEN CISTANCHE TUBULOSA TESTOSTERONIN PARANTAMISEEN PHGS75% ECH 30% ACT 12%

C. tubulosan luonnonvarat jakautuvat pääasiassa Taklamakanin autiomaa ympäröivälle alueelle Etelä-Xinjiangin autonomisella alueella Kiinassa. Kuten monet muutkin perinteisinä kiinalaisina lääkkeinä (TCM) käytetyt lajit, C. tubulosa on taloudellisesti erittäin arvokas, ja se on lähes kuollut sukupuuttoon luonnonvaraiselta elinympäristöstään liikakeräyksen vuoksi. C. tubulosan viljely aloitettiin 1990-luvulla Kiinassa Cistanches Herban raaka-aineen saannin varmistamiseksi sekä luonnonvaraisten kasvivarojen suojelemiseksi. Vuodesta 2017 lähtien lähes 13 tuhatta hehtaaria viljeltyä C. tubulosaa on Hotanin prefektuurissa Xinjiangissa. Istutustekniikan edistystä vaaditaan viljelyn laajentamiseen sekä C. tubulosan laadun parantamiseen.

C. tubulosan viljelyn ensisijainen tarkoitus on tuottaa Cistanches Herbaa, joka on runsaasti näitä tehokkaita komponentteja. Kuitenkin vaikuttavien komponenttien sisältöCistanches Herba, kuten PhG:t ja oligosakkaridit, voivat vaikuttaa merkittävästi monilla tekijöillä tuotannon aikana. Reaaliaikaista C. tubulosan laadun havaitsemisjärjestelmää olisi tutkittava. Siksi on tarpeen kehittää korkean suorituskyvyn menetelmä, joka täyttää vaatimuksen suuren näytemäärän analysoinnista lyhyessä ajassa. Perinteisesti näiden ensisijaisten tehokkaiden komponenttien, kuten PhG:iden ja hiilihydraattien, määritys C. tubulosassa saavutettiin yleensä käyttämällä korkean suorituskyvyn nestekromatografiaa (HPLC). Vaikka se on tarkka ja luotettava, se on aikaa vievää ja työlästä tietojen keräämiseen ja käsittelyyn. Lisäksi paljon aikaa ja vaivaa tarvitaan myös näytteen valmisteluun, johon yleensä kuuluu HPLC-määritysten jauhaminen, uuttaminen ja suodatus. Siksi suhteellisen suuren tietomäärän saamiseksi tarvitaan selkeä periaate ja helppokäyttöinen työkalu. Onneksi lähi-infrapunaspektroskopiaa (NIRS) on käytetty laajalti maataloustuotteiden, elintarvikkeiden, lääkenäytteiden ja lääkkeiden arvioinnissa, koska se on nopea ja tuhoamaton. Siksi NIRS voisi täsmälleen vastata TCM:ien tehokkaiden mittausten vaatimuksia, ja ei ole yllättävää, että NIRS:ää on käytetty TCM:ien yhdisteiden kvalitatiiviseen tunnistamiseen ja kvantifiointiin.

Tässä tutkimuksessa sisältö kuusi tehokasta komponenttia, mukaan lukienekinakosidi, verbaskosidi, mannitoli, sakkaroosi, glukoosi ja fruktoosi116 erässä C. tubulosa -näytteitä, jotka kerättiin Hotanin prefektuurista Xinjiangista vuosina 2013–2015, määritettiin ensin HPLC:llä. Myöhemmin näiden kuuden komponentin kalibrointimallit muodostettiin osittaisen pienimmän neliösumman regressiomenetelmällä (PLSR). Nämä mallit validoitiin sitten kalibrointisarjojen korrelaatiokertoimilla ja ennustevirheillä. Tulokset osoittivat, että kehitettyä menetelmää voidaan käyttää luotettavana menetelmänä C. tubulosan kvantitatiiviseen analyysiin.

2. Tulokset

2.1. HPLC-analyysi

Sisältöekinakosidi ja verbaskosidimääritettiin kirjallisuudessa hyvin määritellyllä HPLC-UV-menetelmällä ja neljä hiilihydraattia (mannitoli, sakkaroosi, glukoosi ja fruktoosi) määritettiin kirjallisuudessa hyvin määritellyllä HPLC-ELSD-menetelmällä kaikille 116 näytteelle. Näytteiden valmistus- ja määritysmenetelmät on kuvattu kohdissa 3.1 ja 3.3. Kuvassa 1 esitetään sekoitettujen standardien tunnusomaiset kromatogrammit. Voidaan nähdä, että kaikki kuusi tehokasta komponenttia olivat lähtötilanteen mukaan erotettuja ja siksi ne voitiin kvantifioida. HPLC-menetelmä validoitiin ennen näytetestausta. HPLC-menetelmän tärkeimmät tulokset on lueteltu taulukossa 1. Tuloksissa näkyy suotuisa lineaarinen suhde (r=0.9998) ja saanto (98,5 %) ekinakosidimääritysmenetelmästä, sama tulos kuin kaikilla viidellä. komponentit. Siksi kuuden tehokkaan komponentin pitoisuudet voidaan määrittää tarkasti. Kaikki määritetyt pitoisuusalueet on koottu taulukkoon 1.

2.2. NIRS-analyysi

Kuvassa 2 on esitetty C. tubulosa -näytteiden NIR-spektrit (4000-10,000 cm-1 ). Merkittäviä absorptiopiikkejä ilmaantui 4000 cm-1 - 7500 cm-1 kaikissa näytteissä, kun taas lieviä vaihteluja 7500 cm-1 - 10 000 cm-1. NIR-spektrien perusviivan ajautuminen tapahtui, koska näytteeseen vaikuttivat helposti sellaiset tekijät kuin hiukkaskoko ja väri (kuva 2A). Spektrien matemaattisia esikäsittelyjä käytettiin vähentämään tarpeettoman tiedon vaikutusta jossain määrin. Matemaattiset esikäsittelyt sisälsivät ensimmäisen derivoinnin (1. derivaatio), toisen johtamisen (2. derivaatio), standardin normaalimuunnos (SNV) ja multiplikatiivisen sirontakorjauksen (MSC). Kuvassa 2B on esitetty C. tubulosan NIR-spektrien toinen johtaminen, ja kolmelta alueelta, 4000-4500 cm-1, 5000-5500 cm-1 ja 7000-7500 cm-1, havaitut merkittävät vaihtelut.

2.3. Kvantitatiivisten kalibrointimallien luominen

Osittainen pienimmän neliösumman regressio (PLSR) on klassinen mallinnusmenetelmä ja sitä on käytetty laajasti kvantitatiivisissa malleissa tulosten korkean laadun vuoksi. PLSR:n etuja ovat hyvä ennustekyky ja suhteellinen yksinkertaisuus. PLSR:ää on myös käytetty laajasti TCM:ien kvantitatiivisten kalibrointimallien luomisessa [25]. Esikäsiteltyjen NIR-spektrien perusteella luotiin NIR-kvantitatiivinen analyysimalli kuudelle tehokkaalle komponentille C. tubulosassa käyttäen PLSR-menetelmää HPLC-analyysitietojen todellisina arvoina. 116 näytettä jaettiin satunnaisesti kalibrointi- ja validointisarjoihin suhteessa 3:1. Kalibrointiin sopivimmat olosuhteet valittiin alhaisella RMSEC:llä ja korkealla korrelaatiokertoimella.

LUONNOLLINEN CISTANCHE TUBULOSA SEKSUAALISTEN TOIMINTOJEN PARANTAMISEEN PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.3.1. Aaltokaistan valinta kalibrointimalleille

Sopivan aaltokaistan valinta oli tärkeä askel kalibrointimallin rakentamisessa. Tässä tutkimuksessa verrattiin NIR-välispektrejä 4000–7500 cm−1 (suosittelee TQ-analyytikkoohjelmisto) ja 4000–10 000 cm−1. Havaittiin, että tämä alue ei sovellu kalibrointiin välillä 4000 cm−1 ja 7500 cm−1 taulukosta 2. Tästä syystä tässä tutkimuksessa kuuden kemiallisen ainesosan spektrivälit valittiin kaikki väliltä 4000 - 10 000 cm−1 vertaamalla RMSEC:n ja korrelaatiokertoimen suorituskykyä.

2.3.2. Optimaalisen tekijöiden lukumäärän valinta kalibrointimalleille

PLSR selittää datan vaihtelun maksimimäärän vähentämällä spektritietojen dimensiaalisuutta tekijöiden laskennalla. "Alivarustelu" -ongelma ilmeni riittämättömästä tiedosta, joka johtui rajallisesta määrästä tekijöitä; kuitenkin, jos valitaan mallissa esitetyt optimiarvot suuremmat tekijät, syntyy "yliasovitus"-ongelma. Joko "alisovitus" tai "yliasovitus" vähentää vakiintuneiden mallien ennustevoimaa [22]. Kuvio 3 esittää suhteen RMSECV:n ja tekijöiden välillä kaikille kuudelle yhdisteelle. Siksi valitsimme ne tekijät, jotka vastaavat RMSECV:n pienimpiä arvoja. Optimaalinen tekijöiden valinta kalibrointimalleille on lueteltu taulukossa 3.

2.3.3. Spektriesikäsittelyn valinta kalibrointimalleille

Toinen kriittinen vaikuttava tekijä kalibrointimalleissa on spektrinen esikäsittely, jolla pyritään vähentämään sironnan ja perusviivan siirtymän vaikutusta, parantamaan signaali-kohinasuhteita ja poistamaan epäsäännöllisiä vaihteluita. Säteilysirontavaikutuksen eliminoimiseen käytettiin moninkertaista sirontakorjausta (MSC) ja standardinmukaista normaalivaihtelua (SNV). Perusviivan poikkeaman vaikutusten ratkaisemiseksi verrattiin 1. ja 2. derivaatan spektrejä ja valittiin 2. derivaatio. Halutun vaikutuksen saavuttamiseksi tasoitimme spektrit Savitzky-Golay (SG) -suodatinalgoritmilla ennen johtamista kohinan suurentumisen estämiseksi. Taulukossa 3 on esitetty spektrin esikäsittelyn tiedot ja sen tulokset kalibrointimalleille.

2.4. Vakiintuneiden mallien arviointi

Hyvällä NIRS-kalibrointimallilla tulisi olla alhaiset RMSEC- ja RMSEP-arvot sekä korkea korrelaatiokerroin (r) ja pienet erot RMSEC:n ja RMSEP:n välillä. Kuuden valitun yhdisteen kalibrointimallit määritettiin edellä mainittujen menetelmien mukaisesti (taulukko 3). Ekinakosidin kalibrointisarjan RMSEC- ja r-arvot olivat 27,6 ja vastaavasti 0,9808. Muiden kemiallisten yhdistemallien suorituskykyparametrit on lueteltu taulukossa 3, josta voimme päätellä, että vakiintuneet mallit antavat tyydyttäviä ennustetuloksia ja niitä voidaan käyttää C. tubulosan nopeaan kvantitatiiviseen analyysiin. Kuvassa 4 on esitetty kuuden kemiallisen yhdisteen hajontakäyrät, jotta kalibrointimallit olisivat kuvaavampia ja visuaalisesti havaittavissa. Kuten kuvasta 4 näkyy, ennustusarvojen ja mitattujen arvojen välillä oli pieniä eroja, koska useimmat pisteet jakautuivat regressiivisen käyrän ympärille yhtälöllä y=x. Siksi kuvassa 4 havaittiin erinomaisia ​​ennustussuorituksia.

3. Materiaalit ja menetelmät

3.1. Näytteen valmistus

Satakuusitoista C. tubulosa -näytettä kerättiin Hotanin prefektuurista Xinjiangin autonomisella alueella vuosina 2013–2015. Kaikki näytteet viljeltiin, mutta ne kerättiin eri kasvuvaiheissa. Näytteiden tuorepaino vaihteli välillä 20 g - 1000 g. Aurinkokuivauksen jälkeen kuivatut näytteet murskattiin ja seulottiin 60-verkkoseulan läpi.

3.2. NIR-spektroskooppinen tiedonkeruu

Näytteiden NIR-spektrit kerättiin 8 cm-1:n välein spektrialueella 4000-10 000 cm-1 Antaris MXFT-NIR -järjestelmällä (Thermo Scientific, Madison, WI, USA), joka oli varustettu kädessä pidettävä optisen kuidun heijastussovitin. Jokainen spektri saatiin laskemalla 64 skannauksen keskiarvo. Kaikkien näytteiden annettiin tasaantua huoneenlämpötilaan (25 ◦C) ennen NIR-spektriskannausta, jotta näytteet analysoitiin samassa lämpötilassa. Laboratorion kosteus pidettiin ympäristön tasolla.

LUONNOLLINEN CISTANCHE TUBULOSA MUUNUTAISTOIMINNAN PARANTAMISEEN PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3.3. HPLC-tiedonkeruu

3.3.1. Uuton valmistelu

Yksi gramma C. tubulosa -jauhetta uutettiin 50 ml:lla 50-prosenttista metanolia erlenmeyerpullossa ultraäänikäsittelyllä (500 W, 40 KHz) 30 minuutin ajan. Uute säilytettiin 4 °C:ssa. Uutteen supernatantti suodatettiin näytteen saamiseksi HPLC-analyysiä varten.

3.3.2. Ekinakosidin ja verbaskosidin samanaikainen määritys HPLC-UV:lla

Nestekromatografinen analyysi suoritettiin Shimadzu UHPLC -järjestelmällä (Shimadzu, Kioto, Japani), joka koostui kahdesta LC-20ADXR-liuottimen annosteluyksiköstä, LC-20AD-pumpusta, SIL-20ACXR autosta näytteenotin, CTO-20AC-kolonniuuni, SPD-M20A DAD-detektori, DGU-20A3R-kaasunpoistaja ja CBM-20A-ohjain.

Grace Prevail Carbohydrate ES -kolonni (150 × 2,1 mm, 2,7 mm), jota käytettiin kromatografisiin erotuksiin, pidettiin 35 ◦C:ssa. Liikkuva faasi koostui asetonitriilistä (A) ja 0,1 % vesipitoisesta muurahaishaposta (B), ja se toimitettiin gradienttiohjelman mukaisesti seuraavasti: 0–7 min, lineaarinen gradientti 10–20 % A; 7–15 min, 20 % A; ja 15-20 min, lineaarinen gradientti 20-10 % A. Liikkuvan faasin virtausnopeus oli 0,4 ml/min. UV-valvonta suoritettiin aallonpituudella 330 nm.

3.3.3. Mannitolin, sakkaroosin, glukoosin ja fruktoosin samanaikainen määritys HPLC-ELSD:llä

HPLC suoritettiin Agilent 1100 -sarjan LC-järjestelmällä (Palo Alto, CA, USA), joka koostui G1322A-kaasunpoistajasta, G1311A-kvaternaaripumpusta, G1311A-automaattinäytteenottimesta, G1316A-kolonnin lämpötilansäätimestä ja G1315B DAD-detektorista.

Sigma Prevail Carbohydrate ES -kolonnia (4,6 × 25{7}} mm, 5 µm) käytettiin kromatografisiin erotuksiin ja pidettiin kolonnin lämpötilassa 25 °C. Liikkuva faasi koostui asetonitriilistä ja vedestä (77:23, tilavuus/tilavuus) ja isokraattisesta liitosta, jota syötettiin virtausnopeudella 0,7 ml/min. Poistovirtaa tarkkailtiin käyttämällä haihtuvaa valonsirontadetektoria (ELSD) oletusparametreilla.

3.4. Tietojenkäsittely

TQ Analystia (versio 8.0, Thermo Scientific, Madison, WI, USA) käytettiin kalibrointi- ja validointijoukkojen jakamiseen, spektrien matemaattiseen esikäsittelyyn, kalibrointimallien luomiseen ja muihin laskelmiin. . Figuurien tekemiseen käytettiin alkuperää (versio 9.1).

4. Johtopäätökset

Tässä tutkimuksessa ehdotimme nopeaa ja tuhoamatonta menetelmää samanaikaiseen analyysiinekinakosidi, verbaskosidi, mannitoli, sakkaroosi, glukoosi ja fruktoosisisäänC. tubulosakirjoittanut NIRS. RMSEC-, korrelaatiokertoimen, RMSEP- ja Rp-arvojen analyysit osoittivat, että vakiintuneita kvantitatiivisia NIR-malleja voitiin käyttää kuuden valitun tehokkaan komponentin sisällön ennustamiseen tarkasti.C. tubulosa. Verrattuna HPLC:hen tässä tutkimuksessa raportoitu NIRS-menetelmä voi säästää merkittävästi työvoimaa ja aikaa, samalla kun se säilyttää tyydyttävän kvantitatiivisen analyysikyvyn. Siksi tässä raportoitua menetelmää voidaan käyttää laadunvalvonnassaC. tubulosaja siten ohjata viljely- ja prosessiteknologian kehitystäC. tubulosa.

LUONNOLLINEN CISTANCHE TUBULOSA SEKSUAALISTEN TOIMINTOJEN PARANTAMISEEN PHGS75% ECH 30% ACT 12%