Neuriittien degeneraation kvantifiointi parannetulla tarkkuudella ja tehokkuudella Parkinsonin taudin in vitro -mallissa, osa 2

Tulokset

PD:hen liittyvän neuriittidegeneraation soluviljelymallin perustaminen

Kehittääksemme menetelmän neuriittien degeneraation tutkimiseksi PD:n soluviljelymallissa käytimme viljeltyjä LUHMES-soluja, ehdollisesti immortalisoitujen ihmisen mesenkefaalisten solujen populaatiota. Erilaistuessaan LUHMES-soluista tulee postmitoottisia, ne omaksuvat kypsille dopaminergisille hermosoluille ominaisen geeniekspressioprofiilin ja kehittävät hermosolujen morfologian neuriiteilla, jotka ulottuvat jopa 500 mm:n pituisiksi (kuva 1A; Lotharius et al., 2005; Scholz et al. , 2011; Kraemer et ai., 2021).

Neurodegeneraatio, tila, jossa hermosolut mutatoituvat tai kuolevat, liittyy läheisesti muistiin. Soluviljelymalleissa voimme kontrolloida viljelyolosuhteita hermoston rappeutumisen ilmentymisen helpottamiseksi ja siten muistin suorituskyvyn parantamiseksi.

Tutkimukset ovat osoittaneet, että hermosolujen homeostaasilla on tärkeä rooli solujen selviytymisessä ja järjestelmän toiminnassa. Voimme parantaa solujen stabiilisuutta säätelemällä tekijöitä, kuten ravinteita ja kasvutekijöitä viljelyalustassa. Kiinnitä samalla huomiota viljelyympäristön puhtauden ja lämpötilan hallintaan, jotta solut eivät häiriinny ja vaurioidu ympäristöstä.

Lisäksi soluviljelymallissa voimme myös ruiskuttaa soluihin tiettyjä yhdisteitä tai lääkkeitä vähentämään neuromodulaation ilmentymistä ja siten parantamaan solujen eloonjäämisnopeutta ja muistin suorituskykyä. Tätä tekniikkaa käytetään laajalti myös hermoston rappeutumissairauksien tutkimuksessa.

Lyhyesti sanottuna neurodegeneraatiolla on tärkeä vaikutus solun stabiilisuuteen ja järjestelmän toimintaan, ja soluviljelyteknologia on hyvä mallitutkimusmenetelmä, jolla voidaan tehdä syvällistä selvitystä ja tutkimusta hermoston rappeutumisen ja muistin välisestä suhteesta. Voimme lieventää neuromodulaatiokykyä viljelemällä ympäristön hallintaa, injektoimalla lääkkeitä soluihin jne. parantaaksemme solujen selviytymistä ja muistin suorituskykyä sekä tarjoamalla kattavamman perustan hermostoa rappeutuvien sairauksien tutkimukselle. Voidaan nähdä, että meidän on parannettava muistiamme. Cistanche voi parantaa merkittävästi muistiamme, koska Cistanche voi myös säädellä välittäjäaineiden tasapainoa, kuten lisäämällä asetyylikoliinin ja kasvutekijöiden tasoa, jotka ovat erittäin tärkeitä muistille ja oppimiselle. Lisäksi liha voi myös parantaa verenkiertoa ja edistää hapen toimitusta, mikä voi varmistaa, että aivot saavat riittävästi ravintoa ja energiaa, mikä parantaa aivojen elinvoimaa ja kestävyyttä.

Napsauta tietää lisäravinteita parantaaksesi muistia

Lasin ylivoimaisten optisten ominaisuuksien vuoksi muoviin verrattuna viljelmät perustettiin lasilevyille, jotka sisälsivät kahdeksan väliainekammiota. Aiempien raporttien perusteella (Lotharius et al., 2005; Scholz et al., 2011; Kurowska et al., 2014) yritimme alun perin perustaa viljelmiä kammiolevyille, jotka oli päällystetty PLO:lla ja fibronektiinillä; sellaisilla viljelmillä oli kuitenkin adheesiopuutteita ja alhainen elinkelpoisuus. Tuloksena testasimme, parantaisiko päällystäminen lisäsubstraateilla lasipinnoille muodostettujen LUHMES-soluviljelmien elinkelpoisuutta.

LUHMES-soluviljelmät perustettiin objektilaseille, jotka olivat joko päällystämättömiä tai päällystettyjä PLO:lla ja fibronektiinillä, PDL:llä ja laminiinilla tai kaikkien neljän substraatin yhdistelmällä. Elävien ytimien analyysi fluoresenssimikroskopialla paljasti, että objektilasien pinnoitus vaikutti merkittävästi viljelmien elinkelpoisuuteen [Friedman x2 (3)=18, p, 0.0001], ja post hoc -monien vertailuanalyysit paljastivat, että objektilasit päällystetty kaikkien neljän edellä mainitun substraatin yhdistelmällä tuottaa merkittävästi suuremman määrän eläviä soluja verrattuna objektilasiin, jotka on päällystetty vain PLO:lla ja fibronektiinillä (p= 0.0437; kuvio 1B, C).

Kun olimme tunnistaneet optimaaliset pinnoitusubstraatit LUHMES-solujen viljelyyn lasilevyillä, arvioimme solutiheyden vaikutuksia viljelmien soveltuvuuteen neuriittien rappeumamittauksiin. LUHMES-soluja viljeltiin erilaistumisväliaineessa, jonka maljaustiheydet olivat 57 500 solua per kuoppa, 115 000 solua per kuoppa tai 230,000 solua per kuoppa, ja niiden viidentenä erilaistumispäivänä solut kiinnitettiin 4 % PFA:lla ja kuvattiin faasikontrastimikroskopialla.

Tiheys 57 500 solua kuoppaa kohden johti viljelmiin, joissa oli huonosti verkottuneita neuriitteja ja epäsäännöllinen neuriittimorfologia, kun taas viljelmät, joiden pinnoitustiheys oli 230 000 solua, sisälsivät neuriittitiheydet, vaikka ne olivatkin eläviä, neuriittitiheydet liian korkeat tarkkaan neuriittimittaukseen. Keskimääräinen solutiheys 115,000 solua kuoppaa kohti tarjosi korkean elinkelpoisuuden ja hyvin erotetut aksonikanavat, jotka edistävät tarkkoja neuriittien rappeumamittauksia (kuvio 1D).

PD:hen liittyvän neuriittidegeneraation mallintamiseksi in vitro altistimme erilaistuneet LUHMES-solut 6-OHDA:lle, joka on laajalti käytetty neurotoksiini, joka edistää oksidatiivista stressiä ja katekoliminergisten hermosolujen rappeutumista (Bové ja Perier, 2012). Erilaistuneiden LUHMES-solujen altistuminen 6-OHDA:lle lisäsi annoksesta riippuvaa neuriittien rappeutumista, kun 5,0 mM 6-OHDA ja 7,5 mM 6-OHDA aiheutti keskivaikeaa ja vakavaa neuriittidegeneraatiota (kuva 1). . 2F). Neuriittien degeneraation kvantifiointiin 6-OHDA:lle altistettujen LUHMES-solujen viljelmissä käytimme laajalti siteerattua menetelmää, jossa viljelmien vaihekontrastikuvat binaarisoidaan, kuvien solukappaleet poistetaan digitaalisesti ja hiukkasanalysaattorin algoritmi ImageJ:tä käytetään mittaamaan neuriittifragmenttien pinta-ala. Sirpaloituneet neuriittialueet lasketaan sitten yhteen ja jaetaan neuriittien kokonaispinta-alalla DI:n määrittämiseksi (kuvat 2A–E; Sasaki et al., 2009; Kraemer et al., 2014; Di Stefano et al., 2015; Hill et al. ., 2018; Geisler et ai., 2019).

Kuten odotettiin, erilaistuneiden LUHMES-solujen altistuminen 6- OHDA:lle aiheutti annoksesta riippuvan lisäyksen DI:ssä (F(3,24)= 119.8, p=0.0001, R{ {8}}.9374; kuva 2G). 6-OHDA:lle altistuneiden solujen analyysien aikana havaitsimme kuitenkin useita ongelmia, jotka vaikuttivat negatiivisesti DI-mittausten tarkkuuteen ja tehokkuuteen. Siten pyrimme optimoimaan tämän yleisen menetelmän DI-mittausten suorittamiseen, jota tästä lähtien kutsumme perinteiseksi DI-menetelmäksi, luodaksemme protokollan, joka helpottaa neuriittien fragmentoitumisen tehokkaampaa mittausta.

Mikrokuvan binarisointiin liittyvän keinotekoisen pirstoutumisen vähentäminen

Perinteistä DI-menetelmää käytettäessä havaitsimme usein ongelman, jossa ehjät neuriitit vaihekontrastikuvissa näyttivät pirstoutuneilta vastaavassa binaarisessa kuvassa (kuva 3A). Tämä keinotekoinen pirstoutuminen vaikutti ensisijaisesti heikosti näkyviin neuriitteihin. Siksi tutkimme, voitaisiinko ongelmaa vähentää kuvan kontrastia parantavilla toimenpiteillä. Kuvan kontrastin parantamiseksi otimme ensin kuvia neuriiteista käyttämällä erilaisia ​​​​valovoimakkuuksia määrittääksemme kuvan kirkkaustason, joka tuottaa optimaalisen kontrastin.

Optimaalisella valovoimakkuudella otettuihin kuviin kontrastia lisättiin sitten käyttämällä ImageJ:tä LUT:n käyttämiseen minimi- ja enimmäisintensiteetillä 90 ja 205. Näiden kontrastiparannusten sisällyttäminen antoi kohtalaisen tarkemman esityksen neuriiteista vaihekontrastikuvista luoduissa binarisoiduissa kuvissa (kuva 3B). Siitä huolimatta terveiden neuriittien binaarisoitujen kuvien kvantitatiivinen analyysi osoitti, että kontrastin lisäykset eivät merkittävästi vähentäneet keinotekoista fragmentoitumista (p=0.9999; kuva 3D). Siten tutkimme seuraavaksi, tuottaisiko immunofluoresenssikuvauksen käyttö kuvia, joissa on ylivoimainen kontrasti, ja helpottaisi siten tarkempien binaarisoitujen neuriittikuvien tuotantoa, joissa keinotekoinen fragmentaatio on vähentynyt.

Kuvassa 2 kuvatut objektilasit, jotka sisälsivät kiinteitä LUHMES-soluja, jotka oli altistettu erilaisille 6- OHDA:n pitoisuuksille, immunovärjättiin sytoskeletaalisen proteiinin b III-tubuliinin suhteen, kuvattiin fluoresenssimikroskoopilla ja analysoitiin soketulla tutkijalla keinotekoisen fragmentoinnin varalta (kuva 1). 3C). Fluoresenssimikrovalokuvista ja vastaavista faasikontrastimikrovalokuvista saatujen binarisoitujen kuvien kvantitatiivinen analyysi paljasti, että mikroskoopin tyyppi vaikutti keinotekoiseen fragmentoitumiseen [Friedman x2 (3)=15.44, p, 0.0001] . Tarkemmin sanottuna fluoresenssimikrokuvat tuottivat binaarisoituja kuvia, joissa keinotekoinen pirstoutuminen oli merkittävästi vähentynyt verrattuna vaihekontrastimikrovalokuviin (p=0.0016; kuva 3D).

Tämän seurauksena terveiden viljelmien kuvat tuottivat merkittävästi alhaisemmat DI-pisteet, kun käytettiin fluoresenssimikrovalokuvia faasikontrastimikrokuvien sijaan (F(1,8)= 131.4, p=0.{12} }001, R2=0.1442; kuva 3E). Lisäksi huomattava yleistrendi on, että kertamuutos keskimääräisten DI-arvojen välillä, jotka liittyvät terveisiin (vehikkelillä käsiteltyihin) viljelmiin ja viljelmiin, joissa esiintyi neuriittidegeneraatiota (5,0 tai 7,5 mM 6-OHDA-käsitelty), oli suurempi, kun mitattiin fluoresenssimikrovalokuvilla. kuin faasikontrastimikrovalokuvista saatuna (kuva 3E). Tämä tapahtui huolimatta siitä huolimatta, että fluoresenssimikrokuvat viljelmistä, joissa oli kohtalaista neuriittidegeneraatiota (5 mM 6-OHDA:lle altistuminen indusoi) ja joilla oli merkittävästi alhaisemmat DI-pisteet kuin vastaavien vaiheiden kuvissa, koska keinotekoinen fragmentaatio oli vähentynyt (p=0.0001). , d=0.6312).

Parametrien optimointi fragmentoituneiden neuriittien ja kokonaisneuriitin havaitsemiseen
Perinteisessä menetelmässä DI-mittausten suorittamiseen käytetään Analyze Particles -laajennusta ImageJ:lle, jonka kokoparametrit ovat 20 10,000 pikseliä neuriittifragmenttien havaitsemiseen. Huomasimme kuitenkin, että hiukkasanalysaattori ei havaitsenut suurta osaa neuriittifragmenteista, kun käytettiin näitä laajalti mainittuja parametreja (Shin et al., 2012; Di Stefano et al., 2015; Sasaki et al., 2016; Loreto et al. , 2020; Shin ja Cho, 2020) neuriittien rappeutumisen mittaamiseksi vaihekontrastimikrokuvissa LUHMES-soluista, jotka on altistettu 6-OHDA:lle, luotu kuten kuvataan kuvassa 2.

Siten analysoimme kuvia kyseisestä tietojoukosta uudelleen käyttämällä erilaisia ​​​​minimikokorajoja hiukkasten havaitsemiseen määrittääksemme optimaaliset parametrit neuriittifragmenttien tunnistamiseen. Vaihekontrastimikrovalokuvista luotujen binaarisoitujen kuvien kvalitatiivisen arvioinnin perusteella 5–10,000 pikselin kokoparametrit paransivat neuriittifragmenttien havaitsemista, mutta ne liittyivät myös taustamelun, kuvien tai muiden pienten artefaktien virheelliseen tunnistamiseen. ei-neuriittimateriaalia neuriittifragmentteina. Verrattuna laajalti käytettyihin 20–10,000 pikselin parametreihin, 10–10,000 pikselin parametrit paransivat neuriittifragmenttien havaitsemista ilman, että vääriä positiivisia arvoja oli huomattavasti enemmän (kuva 4A). , vasen).

Samanlaiset analyysit suoritettiin myös binaarisilla kuvilla, jotka saatiin fluoresenssimikrovalokuvista LUHMES-soluista, jotka oli immunoleimattu b III-tubuliinille. Hiukkasanalysaattorin kokoparametrit 5–10, 000 pikseliä helpotti herkimmän neuriittifragmenttien havaitsemisen, ja koska fluoresenssimikrokuvat sisälsivät vähemmän pieniä roskia, tällaiset parametrit eivät merkittävästi lisänneet ei-neuriittimateriaalin virheellistä tunnistamista neuriittifragmenteiksi. (Kuva 4A, oikea).

Perinteinen menetelmä DI-mittausten suorittamiseksi käyttämällä hiukkasanalysaattorin kokoparametreja 20–10,000 pikseliä sulkee alle 20 pikseliä pienemmät kohteet pois neuriittifragmenttien mittauksista.

Tällaiset pienet esineet sisällytetään kuitenkin tyypillisesti virheellisesti neuriittien kokonaispinta-alan mittauksiin, koska perinteisessä DI-mittausmenetelmässä neuriittien kokonaispinta-ala lasketaan summaamalla kaikki binaarisoitujen kuvien mustat pikselit. Tämän ongelman ratkaisemiseksi käytimme ImageJ-kehittäjä Wayne Rasbandin kirjoittamaa ImageJ:n hiukkasten poistolaajennusta pienten, ei-neuriittisten objektien poistamiseen binaarisista kuvista. Tämän laajennuksen käyttö suoritettaessa DI-mittauksia käyttämällä faasikontrastimikrovalokuvia LUHMES-soluista, jotka altistettiin 6-OHDA:lle, luotu, kuten kuvataan kuvassa 2, johti merkittävään kasvuun DI-mittauksissa kaikissa neurotoksiinialtistuksen pitoisuuksissa (F(1). ,8)=83.43, p=0.0001, R2=0.0416).
Lisäksi merkittävä vuorovaikutus osoitti, että hiukkastenpoistoaineen käytön aiheuttama DI:n kasvu voimistui korkeammilla pitoisuuksilla (F(1.881,15.05)=59.97, p=0.0001, R{ {8}}.0094; kuva 4B, C). Kuvasimme myös samat solulevyt fluoresenssimikroskopialla ja arvioimme pienten hiukkasten poiston vaikutuksia fluoresenssimikrovalokuvista saatuihin DI-mittauksiin. Vaikka pienten hiukkasten poisto antaa DI-arvoja, jotka ovat teoreettisesti tarkempia, tällaiset arvot eivät keskimäärin eronneet merkittävästi niistä, jotka saatiin ilman hiukkastenpoistolaajennusta, kun ne mitattiin fluoresenssimikrokuvilla (F(1,8)=2). 613, s.=0.1446, R2=0.0013; kuva 4D).

DI-mittausten automatisointi fluoresenssimikrovalokuvista

DI-mittausten suorittaminen perinteisellä menetelmällä vaatii työlästä ja aikaa vievää kuvankäsittelyä, vapaan käden työkalun käyttöä yksittäisten solujen kappaleiden poistamiseen digitaalisesti sekä fragmentoituneiden neuriitti- ja kokonaisneuriittialueiden mittaamista jokaisesta kuvasta. Siksi pyrimme parantamaan menetelmän tehokkuutta kirjoittamalla makron, joka automatisoi DI-analyysit täysin. Sooman poiston automatisoimiseksi makro, nimeltään ANDI, suorittaa solujen ytimien kuvien binarisoinnin, jotka on merkitty tumavärjäyksellä DAPI, mitä seuraa binaaristetun kuvan modifiointi siten, että kynnysalueet laajenevat kattamaan koko soman alueen. Tällaiset kuvat, joissa on binaarisoituja ja suurennettuja ytimiä, vähennetään sitten vastaavista fluoresenssimikrokuvista neuroneista, jotka on immunoleimattu b III-tubuliinilla, jolloin saadaan kuva, jossa on yksinomaan neuriitit (kuvio 5A, B).

Tuman kutistumisen tai neurodegeneraatioon liittyvän fragmentoitumisen aiheuttamien vaihtelevien tuman kokojen mukauttamiseksi tumien binaarisoituja kuvia suurennetaan dilataatioiden ja eroosien yhdistelmällä, jotka yhdistävät tumafragmentteja ja laajentavat binaarisoituja alueita miehittääkseen alueen, joka on suurempi kuin erilaistuneiden LUHMES-solujen somat. . Kuvat, jotka sisältävät yksinomaan neuriitteja, binaarisoidaan ja alistetaan DI-analyysille useiden automatisoitujen toimintojen avulla (kuvio 5C, D). Kuvista soman poistoon liittyvien makrotoimintojen tarkkuuden arvioimiseksi vertasimme DI-pisteitä, jotka saatiin solukappaleiden manuaalisen poistamisen jälkeen fluoresenssimikrokuvista ImageJ:n vapaalla kädellä (kuten aiemmin kuvattiin kuvassa 4D), DI-pisteisiin. luotu identtisten kuvien analyyseistä automaattisen solurungon poiston jälkeen käyttämällä ANDI-makrossa esiteltyjä somanpoistotoimintoja. Analyysimme paljasti, että DI-pisteet, jotka laskettiin käyttämällä automaattista solurungon poistoa, korreloivat lähes identtisesti DI-mittausten kanssa, jotka saatiin kuvista, joille sooma poistettiin (r(34)=0.980, p, 0,0001; kuva 1). 5E).

Analyysien tarkkuuden lisäämiseksi sisällytimme ANDI:hen useita aiemmin kuvattuja DI-mittauksia parantavia säätöjä. Makro sisältää kontrastin parantamistoiminnot, Particle Remover -laajennuksen käytön neuriittisen aineen poistamiseen neuriittikuvista ja ei-ydinmateriaalin poistamiseen ytimien kuvista sekä neuriittifragmenttien havaitsemisen käyttämällä kokoparametreja 5–10,000 Analyze Particles -laajennukselle.

Oletimme, että yhdessä fluoresenssimikroskopian käyttö, kontrastinparannusoperaatiot, pienten esineiden poistaminen hiukkastenpoistoaineella ja optimoidut parametrit hiukkasten havaitsemiseksi edistäisivät tarkempia neuriittien rappeuman mittauksia. Tämän hypoteesin testaamiseksi LUHMES-solujen faasikontrastikuvat, jotka oli altistettu erilaisille 6-OHDA-pitoisuuksille, jotka on luotu kuvassa 2 kuvatulla tavalla, analysoitiin sokealla ja subjektiivisella pisteytyksellä käyttämällä arvoaluetta välillä 0. 0 ja 1.0, joiden arvot edustavat pirstoutuneen neuriittialueen näennäistä osuutta. Tämän jälkeen arvioimme perinteisellä menetelmällä saatujen subjektiivisten pisteiden ja DI-mittausten välistä korrelaatiota sekä ANDI-makrolla saatujen subjektiivisten pisteiden ja DI-mittausten välistä korrelaatiota.

Vaikka perinteisellä menetelmällä saadut DI-mittaukset korreloivat subjektiivisten pisteiden kanssa (r {0}}.7850, p,0.0001; kuva 5F), ANDI-makro antoi tuloksen mittaukset, jotka korreloivat paljon voimakkaammin subjektiivisten arvioiden kanssa (r 2=0,978, p, 0,0001; kuva 5G). Suorat tilastolliset vertailut paljastivat, että ANDI-makrolla saadut pisteet korreloivat merkittävästi voimakkaammin subjektiivisten arvioiden kanssa kuin perinteisellä menetelmällä saadut pisteet (z=6.626, p, 0,0001; kuva 5F, G). Lisäanalyysit paljastivat, että makro helpottaa DI-mittausten suorittamista ja parantaa merkittävästi aikatehokkuutta. ANDI-makrolla tehdyt DI-analyysit vaativat keskimäärin 12,75 sekuntia analysoitua kuvaa kohti verrattuna perinteisellä menetelmällä analysoituun kuvaa kohti keskimäärin 5,27 minuuttia [Friedman x2 (1)=9, p {{22} }.0027]. Kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittavat, että ANDI tuottaa nopeasti DI-mittauksia, jotka perinteisellä menetelmällä saatuihin pisteisiin verrattuna lähentävät degeneraatiota, jonka tutkijat havaitsevat neuriittikuvien kvalitatiivisesta analyysistä.

Määritettyämme ANDI-makron tarkkuuden ja tehokkuuden mittaamaan neuriittien rappeutumista erilaistetuissa LUHMES-soluissa, jotka altistettiin 6-OHDA:lle, arvioimme makron soveltuvuuden kokeisiin, joissa oli mukana muita soluviljelymalleja. Pilottitutkimus suoritettiin ensin ANDI:n tarkkuuden arvioimiseksi suoritettaessa DI-mittauksia käyttäen mikrokuvia primaarisista sympaattisista viljelmistä, jotka on immunoleimattu b III-tubuliinilla ja DAPI:lla. Mielenkiintoista on kuitenkin se, että sympaattisten hermosolujen solurungot ovat suurempia kuin erilaistuneiden LUHMES-solujen solut, joten automaattiseen somanpoistoon liittyvät ANDI-operaatiot eivät poistaneet koko somaa (tietoja ei näytetä).

Tämän ongelman ratkaisemiseksi muutimme ANDI:n sisältämään valintaikkunan, jonka avulla käyttäjät voivat valita somanpoiston koon ohjaamalla sitä, kuinka monta kertaa binaariset mikrokuvat ytimistä laajenevat. Tätä ANDI-versiota, versiota 1.1, käytettiin sitten DI-mittausten suorittamiseen mikrokuvista, jotka kuvaavat terveitä, vehikkelillä hoidettuja sympaattisia hermosoluja tai rappeutuvia sympaattisia hermosoluja, jotka altistettiin vetyperoksidille. Kuvat hermosoluista, jotka altistettiin vetyperoksidille, tuottivat merkittävästi korkeammat DI-pisteet verrattuna kuviin vehikkelillä käsitellyistä neuroneista (F(1,3)=71.2, p=0.0035, R2=0 .9301; kuva 6A, C). Lisäksi vertasimme näitä DI-pisteitä, jotka saatiin käyttämällä ANDI:ta, DI-mittauksiin, jotka saatiin samasta kuvasarjasta solujen kappaleiden manuaalisen poistamisen jälkeen fluoresenssimikrokuvista ImageJ:n vapaalla työkalulla. Manuaalisen soman poiston jälkeen lasketuissa DI-pisteissä ei ollut merkittävää eroa ANDI:lla saatuihin pisteisiin verrattuna (F(1,3)=0.1082, p=0.7639, R2=0. 0000; Kuvat 6A–C). Post hoc -testit vahvistivat myös, että ANDI:lla saadut DI-pisteet eivät eronneet merkittävästi sekä hoitamattomien hermosolujen tapauksessa (p=0.0972) että vetyperoksidille altistuneiden neuronien tapauksessa (p=0). 9986).

Lisäksi ANDI:sta saadut DI-pisteet korreloivat lähes identtisesti DI-pisteiden kanssa, jotka saatiin solukappaleiden manuaalisen poistamisen jälkeen vastaavista mikrokuvista (r(34)=0.991, p, 0.0001). Nämä tiedot osoittavat, että ANDI soveltuu neuriittien degeneraation mittaamiseen primaaristen hermosolujen viljelmissä somanpoistooperaatioilla, joita käyttäjä voi mukauttaa vastaamaan eri hermosolutyyppejä. Lisäksi neuriittifragmenttien havaitseminen vetyperoksidille altistetuissa viljelmissä osoittaa makron soveltuvuuden käytettäväksi kokeissa, joihin liittyy muiden lähteiden kuin 6-OHDA:n aiheuttamaa neuriittien rappeutumista. Vahvistaaksemme edelleen ANDI:n käyttöä eri syihin liittyvän neuriittien rappeutumisen havaitsemisessa, käytimme makroa myös neuriittien rappeutumisen mittaamiseen mikrokuvissa terveistä sympaattisista viljelmistä tai viljelmistä, jotka on alttiina NGF-poistolle. Kuten odotettiin, kuvat viljelmistä, joille oli tehty NGF-poisto, tuottivat merkittävästi korkeammat DI-arvot verrattuna kuviin terveistä viljelmistä (F(1,2)= 287, p= 0.0035, R2=0. 958; kuvio 6D, E). Yhdessä nämä havainnot osoittavat, että ANDI:ta voidaan käyttää moniin biologisiin yhteyksiin liittyvän neuriittidegeneraation havaitsemiseen.

Koska TH-värjäystä käytetään yleisesti katekoliminergisten hermosolujen visualisointiin, arvioimme myös TH-värjäystä kuvaavien mikrokuvien soveltuvuutta neuriittien rappeutumisen mittaamiseen ANDI:n avulla. Vehikkeliliuoksella käsiteltyjen terveiden sympaattisten hermosolujen viljelmät tai vetyperoksidille altistetut degeneroituvat sympaattiset neuronit kiinnitettiin ja niille tehtiin immunofluoresenssileimaus TH:n ja b III-tubuliinin suhteen sekä vastavärjäys DAPI:lle. Neuriittikuvat, jotka kuvaavat värjäytymistä TH- tai b III-tubuliinille, ja vastaavat kuvat ytimistä, joissa oli DAPI-leimaus, otettiin sitten samanlaisilla näkökentillä. ANDI suoritettiin, ja neuriittikuviksi valittiin kuvat, joissa oli TH-värjäystä tai b III-tubuliinivärjäystä. Analyysimme osoittivat, että DI-pisteet, jotka saatiin käyttämällä kuvia TH-värjäytymisestä, korreloivat erittäin voimakkaasti b III-tubuliinivärjäyskuvista saatujen pisteiden kanssa (r(28)= 0.962, p, 0.0001; kuva 3). 6F, G). Nämä tiedot osoittavat, että ANDI voi saada tarkat DI-mittaukset käyttämällä vaihtoehtoisia värjäysmenetelmiä, jotka leimaavat kaikki neuriitit, kuten immunoleimauksen TH:lle.

Havainnollistaaksemme parannetun menetelmän käyttökelpoisuuden DI-mittausten suorittamiseen tieteellisessä kokeessa käytimme uutta menetelmää JNK:n roolin arvioimiseen oksidatiivisen stressin aiheuttamassa neuriittidegeneraatiossa ihmisen mesenkefaalisissa soluissa. Erilaistuneita LUHMES-soluja esikäsiteltiin 1 tunnin ajan JNK-inhibiittorilla SP600125 tai vehikkeliliuoksella. Sitten soluja käsiteltiin 24 tuntia 6- OHDA:lla oksidatiivisen stressin indusoimiseksi tai vehikkeliliuoksella. Kiinteät solut altistettiin immunoleimaukselle b III-tubuliini- ja DAPI-värjäystä varten, ja ANDI:ta käytettiin DI-mittausten saamiseksi fluoresenssimikrovalokuvista. Viljelmissä, joista puuttui esikäsittely JNK-estäjällä, ilmeni neuriittien rappeutumista 6-OHDA:lle altistuksen jälkeen, mutta JNK:n esto johti huomattavaan ja merkittävään 6- OHDA-indusoidun neuriittien rappeutumisen vähenemiseen (p= 0.0001). , d= 2.0209; kuva 7). Nämä havainnot tukevat JNK-signaloinnin keskeistä roolia oksidatiivisen stressin aiheuttamassa neuriittidegeneraatiossa ihmisen mesenkefaalisissa soluissa, ja mikä tärkeintä, osoittavat uuden menetelmämme hyödyn tieteellisten löytöjen luomiseksi helpottamalla neuriittien rappeutumisen nopeaa ja tarkkaa mittausta.

Keskustelu

Neuriittien rappeutuminen liittyy useisiin neuropatologisiin tiloihin, mutta neuriittien hajoamisen taustalla olevat molekyylimekanismit ovat edelleen epätäydellisiä. Menetelmät, jotka helpottavat tarkkaa ja tehokasta neuriittien rappeutumisen analysointia, ovat välttämättömiä tätä tärkeää solutapahtumaa säätelevien uusien tekijöiden onnistuneelle tunnistamiselle. Tässä tutkimuksessa paljastamme useita virhelähteitä, jotka liittyvät yleisesti käytettyyn menetelmään neuriittien degeneraation kvantifiointiin. Raportoimme kokeellisia tietoja, jotka tukevat menettelytapoja, jotka voidaan toteuttaa DI-analyysivirheiden vähentämiseksi, ja tällaiset muutokset sisällytetään uuteen ImageJ-makroon, joka tarjoaa työkalun nopeisiin, tarkkoihin ja objektiivisiin DI-analyyseihin avoimen lähdekoodin ja ilmaisilla ohjelmistoilla. Lisäksi osoitamme, kuinka parannettua menetelmää voidaan soveltaa mittaamaan neuriittien rappeutumista PD:n soluviljelymallissa, häiriössä, jossa dopaminergisten hermosolujen aksonaalinen fragmentaatio on varhaisen vaiheen tapahtuma, joka edeltää mahdollista hermosolujen häviämistä (Tagliaferro ja Burke, 2016). .

Tässä tutkimuksessa osoitamme ANDI-makron hyödyllisyyden mitattaessa neuriittien rappeutumista PD:n soluviljelymallissa, joka koostuu 6-OHDA:lle altistetuista erilaistuneista LUHMES-soluista.

Raportoimme kokeelliset löydökset, jotka tukevat optimaalisia substraatteja, joille viljelmät tulisi perustaa, sekä osoitamme pinnoitustiheyden, joka on sopivin neuriittien rappeuma-analyyseihin. Tämän mallijärjestelmän käytöllä neuriittien degeneraation tutkimiseen on useita etuja. Solut kehittävät neuriitteja, jotka ovat hyvin verkottuneita ja tyypillisesti 0,500 mm pitkiä, ja viljelmät ovat alttiita PD:n klassisten neurotoksiinimallien, kuten 6-OHDA, 1-metyyli{{4, aiheuttamalle neurodegeneraatiolle. }}fenyylipyridinium-ioni (MPP1) ja rotenoni (Lotharius et ai., 2005; Zhang ym., 2014; Smirnova et ai., 2016; Kraemer et al., 2021). Lisäksi LUHMES-solujen ihmisperäisyys lisää malliin liittyvien löydösten käännettävyyttä ja ehdollinen immortalisointi helpottaa viljelmien nopeaa muodostumista ja lisääntymistä (Scholz et al., 2011). Siten yhdistettynä ANDI:lla suoritettuihin automatisoituihin analyyseihin LUHMES-soluja voidaan käyttää tekemään uusia löytöjä, jotka liittyvät PD:hen liittyvään neuriittien rappeutumiseen, samalla kun ne helpottavat huomattavasti suurempaa suorituskykyä verrattuna primäärisillä hermosoluviljelmillä suoritettuihin automatisoimattomiin analyyseihin.

Lukuisat tutkimusryhmät ovat tehneet DI-analyysejä vaihekontrastikuvien avulla saadakseen käsityksen tekijöistä, jotka säätelevät neuriittien rappeutumista (Press ja Milbrandt, 20{{10}}9; Kraemer et al., 2014 Di Stefano et ai., 2015; Hill et ai., 2018; Geisler et ai., 2019). Raportoimme tässä tärkeästä haitasta, joka liittyy tähän laajalti käytettyyn menetelmään neuriittien rappeutumisen mittaamiseksi: vaihekontrastikuvien binarisointi aiheuttaa huomattavan osan ehjistä neuriiteista näyttäytyvän pirstoutuneilta. Vaikka mikrokuvia otettaessa saavutettava kontrastitaso vaihtelee tutkijoiden käytettävissä olevan mikroskooppijärjestelmän mukaan, tämä ongelma on yleinen eri tutkimusryhmissä, koska DI 0,2 hyväksytään yleisesti kynnysarvoksi, jonka yläpuolella viljelmillä katsotaan olevan rappeutumista. aksonit, ja useimmat tieteelliset raportit, jotka sisältävät DI-mittauksia vaihekontrastimikrovalokuvista, ovat raportoineet terveiden hermosolujen DI-pisteiksi välillä 0,1–0,3 (Sasaki et al., 2009, 2016; Di Stefano et al., 2015; Hill et al., 2018; Loreto ym., 2020). Fluoresenssimikrovalokuvista saadut DI-analyysimme sekä sokeutuneiden tutkijoiden subjektiiviset pisteet osoittavat, että 10–20-prosenttinen neuriittifragmentaatio ei ole yleistä terveissä hermosoluviljelmissä. Pikemminkin tällaisissa viljelmissä on keskimäärin vain 2,5 %:n neuriittifragmentoituminen. Näin ollen havainnot korostavat tarvetta menetelmille, jotka parantavat neuriittien rappeuma-analyysien tarkkuutta vähentämällä tätä yleistä ja merkittävää mittausvirheen lähdettä.

Suurin osa DI-mittauksia sisältävistä tutkimuksista on käyttänyt vaihekontrastikuvia neuriittien rappeumaanalyysien suorittamiseen, mutta useat tutkimusryhmät ovat äskettäin tehneet DI-mittauksia käyttämällä kuvia neuroneista, jotka on immunoleimattu sytoskeletaalisia filamentteja, kuten neurofilamenttiväliainepolypeptidiä tai b-b-tubuliinia (Wakatsuki) varten. et ai., 2011; Li ym., 2017; Pease-Raissi ym., 2017; Hernandez ym., 2018; Sundaramoorthy ym., 2020). Se, mikä mikroskoopin muoto soveltuu parhaiten neuriittien rappeumamittauksiin, on kuitenkin jäänyt epäselväksi, koska tutkimuksia on tarvittu ymmärtääkseen, malliavatko muutokset näiden solun tukirankaproteiinien lokalisaatiossa neuriittien rappeutumisen aikana asianmukaisesti kokonaismuutoksia neuriittien morfologiassa, sekä arvioida missä määrin fluoresenssimikrovalokuvilla saadut DI-mittaukset korreloivat samanlaisten faasikontrastimikrovalokuvien mittausten kanssa. Täällä osoitamme, että fluoresenssimikrokuvat, jotka kuvaavat b III-tubuliinivärjäytymistä, eivät ainoastaan ​​edusta tarkasti neuriittien fragmentoitumista, vaan myös helpottavat tarkempia DI-mittauksia niiden ylivoimaisen kontrastin ja vähentyneen herkkyyden keinotekoiselle fragmentoitumiselle binarisoinnin vuoksi. Siten tuloksemme korostavat b III-tubuliinivärjäyksen käyttökelpoisuutta neuriittien degeneraation mittaamiseen.

Julkaistuista tutkimuksista, joissa on käytetty DI-analyysejä neuriittien degeneraation mittaamiseksi, raportoidut neuriittifragmenttien havaitsemiseen käytetyt koko- ja ympyräparametrit ovat vaihdelleet huomattavasti. Esimerkiksi tuoreessa tutkimuksessa, jossa arvioitiin neuriittien rappeutumista viljellyissä aivotursohermosoluissa, käytettiin kokoparametreja 4–900 pikseliä (Li et al., 2017), kun taas viljellyillä DRG-hermosoluilla tehdyssä tutkimuksessa käytettiin havaitsemisparametreja: 0–10,000 pikseliä (Wakatsuki et al., 2011). Yksi mahdollinen syy tällaiseen vaihteluun on se, että hiukkasanalyysin kokoparametrien tehokkuus neuriittifragmenttien havaitsemisessa vaihtelee kuvan resoluution mukaan, koska partikkelien havaitsemisen kokoparametrit liittyvät pikseliyksiköihin. Valitettavasti useimmat julkaistut DI-analyysejä sisältävät tutkimukset eivät sisällä kuvausta analyyseihin käytetystä kuvan resoluutiosta. Näin ollen on tarvittu standardianalyysiparametrien määrittämistä protokollan avulla, joka paljastaa täydellisesti tärkeät yksityiskohdat, kuten suositeltavan kuvan resoluution. Tässä raportoimme, että yleisimmin mainitut parametrit neuriittifragmenttien havaitsemiseen, 20–10, 000 pikseliä (Shin et al., 2012; Di Stefano et al., 2015; Sasaki et al., 2016; Loreto et al. al., 2020; Shin ja Cho, 2020), johtavat siihen, että suuri osa hermosolujen fragmenteista jää havaitsematta. Neuriittifragmenttien havaitsemisen vähimmäiskokokriteerin pienentäminen parantaa fragmenttien havaitsemisen herkkyyttä ja lisää samalla virheellisesti neuriittifragmenteiksi havaittujen kuvien artefaktien ja ei-neuriittijätteiden määrää. Etsiessämme parametreja, jotka tasapainottaisivat parhaiten havaitsemisherkkyyden ja väärän positiivisuuden taajuudet, tunnistimme analyysiparametrit 10–10,000 jotka tarjoavat tarkimman neuriittifragmenttien havaitsemisen vaihekontrastimikrovalokuvista saaduissa binaarisissa kuvissa. parametrit 5–10,000 mahdollistavat tarkimman neuriittifragmenttien havaitsemisen fluoresenssimikrovalokuvista saaduissa binaarikuvissa. Vaikka nämä määritykset tehtiin käyttämällä kuvan resoluutiota 1280 1024, tällaisten parametrien pitäisi mahdollistaa myös tarkka neuriittifragmenttien havaitseminen kuvissa, jotka on otettu muilla resoluutioilla, joiden pystykoko on 1024 pikseliä, kuten yleisellä koko näytön resoluutiolla {{ 27}}, koska sellaisissa kuvissa kuvatut neuronit olisivat samankokoisia pikselikokoisia.

Lukuisat tutkimusryhmät ovat käyttäneet vähimmäiskokokriteeriä määrittäessään partikkelianalyysiparametreja, jotta pienet, ei-neuriittiset jätteet eivät sisälly neuriittifragmenttimittauksiin (Shin et al., 2012; Cosker et al., 2013; Di Stefano et al., 2015; Sasaki ym., 2016; Li ym., 2017; Loreto ym., 2020; Shin ja Cho, 2020; Sundaramoorthy ym., 2020). Tällaiset tutkimukset ovat kuitenkin virheellisesti sisällyttäneet pientä, ei-fragmenttia olevaa ainetta neuriittien kokonaispinta-alan mittauksiin, koska tällaiset mittaukset saadaan summaamalla kuvan kaikkien mustien pikselien pinta-ala. Tässä esittelemme Particle Remover -laajennuksen hyödyllisyyttä pienten, ei-fragmentoituneiden roskien poistamiseksi kuvasta ennen DI-analyysiä. Lisäosan käyttö lisäsi merkittävästi vaihekontrastikuvista saatujen neuriittidegeneraatiomittausten herkkyyttä. Siten tuloksemme korostavat Particle Remover -laajennuksen arvoa tutkijoille, jotka suorittavat DI-analyyseja vaihekontrastimikrovalokuvien avulla. Mielenkiintoista on, että fluoresenssimikrokuvat sisälsivät vähemmän pieniä, ei-neuriittijälkiä, ja siten pienempää viiden pikselin kokokriteeriä voitiin käyttää fragmenttien havaitsemiseen. Vaikka alle viiden pikselin kokoisten ei-neuriittijätteiden hiukkasten poistaminen ei vaikuttanut merkittävästi fluoresenssimikrovalokuvista saatuihin DI-mittauksiin, tällaiset toiminnot tarjoavat arvot, jotka ovat teoreettisesti tarkempia ja siksi sisällytettiin ANDI:hen.

Koska DI-analyysit on suoritettava käyttämällä kuvia, joissa on yksinomaan neuriitteja, analyysimenetelmän soveltaminen on ensisijaisesti rajoittunut käytettäväksi viljelyjärjestelmissä, jotka ovat sopeutuneet solukappaleiden poistamiseen, kuten soluviljelmiin, joissa solukappaleet voidaan leikata fyysisesti (Catenaccio et al. , 2017; Shin ja Cho, 2020) tai viljelmät mikrofluidilaitteissa, jotka helpottavat soma- ja aksoniosastojen segregaatiota (Cosker et al., 2013; Pease-Raissi et al., 2017; Tan et al., 2018). Vaihtoehtoisesti DI-analyysien suorittaminen dissosioituneilla viljelmillä voidaan saavuttaa ikävällä ja aikaa vievällä työllä, joka liittyy solukappaleiden digitaaliseen poistamiseen mikrokuvista (Kraemer et al., 2014). Tässä tutkimuksessa paljastamme, että ANDI mahdollistaa DI-mittausten suorittamisen mikrokuvista, joissa on LUHMES-soluja, jotka ovat dissosioituneita ja mosaiikkimaisesti jakautuneita 2D-viljelyjärjestelmään. Tuloksemme osoittavat myös, että ANDI helpottaa analyysien suorittamiseen tarvittavan ajan 24-kertaista lyhenemistä, ja ANDI:ssa tehdyt soman poistoon liittyvät toiminnot tuottavat DI-analyysituloksia, jotka korreloivat 98 % samankaltaisten analyysien kanssa, jotka on suoritettu manuaalisen somanpoiston jälkeen. ImageJ:n vapaakätinen työkalu. Näin ollen makro lisää oleellisesti analyysien tehokkuutta suorittamalla automaattista somanpoistoa prosessilla, joka ei uhraa tarkkuutta, ja tällaiset toiminnot laajentavat menetelmän soveltuvuutta dissosioituneiden viljelmien analysointiin mosaiikkimaisesti jakautuneilla solukappaleilla.

Sen lisäksi, että ANDI helpottaa automaattista solurungon poistamista kuvista, siinä on useita muutoksia perinteiseen DI-analyysimenetelmään, mukaan lukien fluoresenssimikrokuvat, tarkistetut hiukkasanalyysiparametrit ja hiukkastenpoistoaineen käyttö pienten, ei-neuriittisten roskien poistamiseen. kuvista. Tuloksemme osoittavat, että nämä optimoinnit yhdessä tuottavat DI-arvoja, jotka ovat lähempänä arvoja, jotka on saatu sokkoutetulla ja pisteytyksellä. Siten sen lisäksi, että ANDI vähentää merkittävästi analyysien suorittamiseen tarvittavaa aikaa, se helpottaa DI-mittauksia, jotka perinteiseen menetelmään verrattuna heijastavat tarkemmin neuriittien rappeutumista, jonka tutkijat raportoivat havaitsevan kvalitatiivisesta kuva-analyysistä.

Eräs perinteisen DI-analyysimenetelmän haittapuoli on se, että tällaiset analyysit vaativat ImageJ:n käytön koulutusta, jotta käyttäjä tuntee ikävän joukon ImageJ-toimintoja. Lisäksi analyysien tehokas suorittaminen edellyttää lisäkoulutusta, jotta käyttäjä voi suorittaa eräanalyysejä tai kirjoittaa komentosarjoja tiettyjen vaiheiden suorittamisen puoliautomatisoimiseksi. Täysin automatisoimalla analyysin ANDI helpottaa DI-mittauksia vain muutamassa makron lataamiseen ja suorittamiseen liittyvässä vaiheessa. Käyttäjäystävällisyyden lisäämiseksi makro sisältää koodin, joka tarjoaa käyttöliittymän analysoitavia kuvia sisältävien hakemistojen valitsemiseen, sekä helpottaa tuloskuvien ja tietotaulukoiden tulostamista käyttäjän valitsemaan hakemistoon. Lisäksi skripti sisältää lukuisia ominaisuuksia, jotka on suunniteltu estämään mittausvirheitä tai käyttäjän virheitä, mukaan lukien aiempien ImageJ-tulosten automaattinen tyhjennys; kuvan mittakaavatietojen poistaminen sen varmistamiseksi, että mittaukset suoritetaan tarkasti pikseliyksiköiden avulla; ImageJ-väriasetusten, mittausasetusten ja hiukkasanalysaattorin parametrien asianmukainen konfigurointi; virhesanoman esitys, jos käyttäjät valitsevat virheellisesti hakemistoja, jotka sisältävät erisuuruisen määrän kuvia, jotka kuvaavat b III-tubuliinivärjäystä ja DAPI-värjäystä; lokikuvaukset, jotka osoittavat analyysin edistymisen; ja koodaus Windows 10:n automaattiseen .ini-tiedostojen luomiseen liittyvien virheiden estämiseksi. Kaiken kaikkiaan nämä ominaisuudet tekevät DI-analyyseistä käyttäjäystävällisempiä, mikä saattaa lisätä kiinnostusta neuriittien rappeutumiseen liittyviin tutkimuksiin.

Osoittaaksemme sen hyödyllisyyttä kokeessa arvioimme ANDI:n avulla JNK:n osuutta neuriittien rappeutumiseen LUHMES-soluviljelmissä, jotka altistettiin 6-OHDA:lle. JNK on stressiaktivoitu kinaasi, jonka on raportoitu olevan avain neuriittien rappeutumiseen ei-kädellisistä peräisin olevissa perifeerisissä hermosoluissa (Shin et al., 2012), mutta lisätutkimuksia tarvitaan, jotta voidaan ymmärtää kinaasin rooli neuriittien degeneraatiossa mesenkefaalisissa ihmissoluissa. . Tässä osoitamme, että JNK:n estäminen suojaa merkittävästi ihmisen mesenkefaalisia soluja oksidatiiviseen stressiin liittyvältä neuriittien rappeutumisesta. Tällaiset havainnot paljastavat JNK:n tärkeän roolin ihmisen sairauden malliin liittyvässä neuriittidegeneraatiossa, vaan ne ovat myös esimerkki ANDI:n hyödyllisyydestä automaattisen ja objektiivisen kuva-analyysin suorittamisessa uusien tieteellisten löytöjen tekemiseksi.

Vaikka ANDI suunniteltiin alun perin helpottamaan neuriittien rappeuman nopeaa ja tarkkaa mittaamista 6-OHDA:lle altistuneiden erilaistuneiden LUHMES-solujen viljelmissä, löydökseemme osoittavat myös, että makroa voidaan käyttää muiden syiden, kuten esim. altistuminen vetyperoksidille tai neurotrofiinien vieroitumiselle. Lisäksi makron versio 1.1 sisältää valintaikkunan, jonka avulla tutkijat voivat mukauttaa somanpoistotoimenpiteitä tietynkokoisille hermosoluille. Tietomme tukevat myös sitä, että muita värjäysmenetelmiä kuin b III-tubuliinin immunoleimausta voidaan käyttää neuriittien degeneraation tarkkaan mittaukseen. Vaikka suosittelemme pilottitutkimusten käyttöä DI-mittausten tarkkuuden tarkistamiseksi käytettäessä ANDI:ta solutyyppien tai värjäysmenetelmien kanssa, joita ei ole aiemmin testattu, nämä havainnot tukevat sitä, että makro on yleisesti ottaen monipuolinen työkalu neuriittien rappeutumisen mittaamiseen viljellyissä hermosoluissa. Koska ANDI:ta ei ole optimoitu mittaamaan neuriittien rappeutumista kudoksessa, suosittelemme tällä hetkellä sen käyttöä vain viljeltyihin soluihin liittyvän neuriittidegeneraation analysointiin. ANDI-koodi on kuitenkin julkisesti saatavilla ja voi siten olla hyödyllinen myös tutkijoille, jotka ovat kiinnostuneita muokkaamaan komentosarjaa in vivo -tutkimuksiin tai muihin sovelluksiin sopivaksi.

Yhteenvetona voidaan todeta, että tässä artikkelissa esitetään tietoja, jotka paljastavat yleisiä virhelähteitä, jotka liittyvät laajalti käytettyyn menetelmään neuriittien rappeutumisen kvantifiointiin. Menetelmän parantamiseen käytettiin kokeellisia lähestymistapoja, ja tällaiset parannukset sisällytettiin ilmaiseen ja avoimen lähdekoodin ImageJ-makroon, jota voidaan käyttää nopeaan, tarkkaan ja objektiiviseen fluoresenssimikrokuvien analyysiin neuriittien rappeutumisen varalta. Löytömme paljastavat ANDI:n tehokkuuden neuriittidegeneraation kvantifiointiin mikrokuvissa, jotka kuvaavat PD:n soluviljelymallia, sekä tarjoavat todisteen periaatteesta, jonka mukaan makro pystyy havaitsemaan muihin biologisiin yhteyksiin liittyvän neuriittidegeneraation. Käyttäjäystävällinen makro vähentää aikaa, jonka tutkijat tarvitsevat oppimaan kvantifioimaan neuriittien pirstoutumista, samalla kun ne lisäävät neuriittien rappeutumisen taustalla olevia tekijöitä arvioivien tutkimusten suorituskykyä ja tarkkuutta. ANDI-makro on saatavilla seuraavasta URL-osoitteesta: https://github.com/kraemerb/kraemerlab.

Viitteet

1. Aarsland D, Creese B, Politis M, Chaudhuri KR, Ffytche DH, Weintraub D, Ballard C (2017) Kognitiivinen heikkeneminen Parkinsonin taudissa. Nat Rev Neurol 13:217–231.

2. Adalbert R, Coleman MP (2013) Review: aksonipatologia ikään liittyvissä hermoston rappeutumishäiriöissä. Neuropathol Appl Neurobiol 39:90-108.

3. Bové J, Perier C (2012) Parkinsonin taudin neurotoksiinipohjaiset mallit. Neuroscience 211:51–76.

4. Catenaccio A, Llavero Hurtado M, Diaz P, Lamont DJ, Wishart TM, Court FA (2017) Molecular analysis of axonal-intrinsic and glial-associated co-regulation of axon degeneration. Cell Death Dis 8: e3166.

5. Cosker KE, Pazyra-Murphy MF, Fenstermacher SJ, Segal RA (2013) Target-derived neurotrophins koordinoi transkriptiota.

6. Di Stefano M, Nascimento-Ferreira I, Orsomando G, Mori V, Gilley J, Brown R, Janeckova L, Vargas ME, Worrell LA, Loreto A, Tickle J, Patrick J, Webster JRM, Marangoni M, Carpi FM, Pucciarelli S, Rossi F, Meng W, Sagasti A, Ribchester RR, et ai. (2015) NAD-prekursorin nikotiiniamidimononukleotidin (NMN) nousu vamman jälkeen edistää aksonin rappeutumista. Cell Death Differ 22:731–742.

7. Fukui K (2016) Reaktiiviset happilajit indusoivat neuriittien rappeutumista ennen solukuoleman induktiota. J Clin Biochem Nutr 59:155-159.

8. Geden MJ, Deshmukh M (2016) Axon degeneration: konteksti määrittelee erilliset polut. Curr Opin Neurobiol 39:108-115.

9. Geisler S, Doan RA, Cheng GC, Cetinkaya-Fisgin A, Huang SX, Höke A, Milbrandt J, DiAntonio A (2019) Vincristiini ja bortetsomibi käyttävät erilaisia ​​ylävirran mekanismeja aktivoidakseen yhteisen SARM1-riippuvaisen aksonien rappeutumisen ohjelmoida. JCI Insight 4:e129920.

10. Hernandez DE, Salvadores NA, Moya-Alvarado G, Catalan RJ, Bronfman FC, Court FA (2018) Glutamaatin eksitotoksisuuden aiheuttamaa aksonien rappeutumista välittää nekroptoosi. J Cell Sci 131:jcs214684.

For more information:1950477648nn@gmail.com