Neuriittien rappeuman kvantifiointi parannetulla tarkkuudella ja tehokkuudella Parkinsonin taudin in vitro -mallissa, osa 1

Abstrakti

Neuriittien rappeutuminen liittyy hermostoa rappeuttavien sairauksien, kuten Alzheimerin taudin, Parkinsonin taudin (PD) ja amyotrofisen lateraaliskleroosin, varhaisiin vaiheisiin. Eräs menetelmä, jota yleisesti käytetään neuriittien rappeuman analysointiin, sisältää degeneraatioindeksin (DI) laskemisen sen jälkeen, kun ImageJ:n Analyze Particles -työkalua on käytetty neuriittifragmenttien havaitsemiseen viljeltyjen solujen mikrokuvista. DI-analyysit ovat kuitenkin alttiita useille mittausvirheille, niiden suorittaminen voi olla aikaavievää ja niiden käyttö on rajallista.

Neurodegeneraatiolla tarkoitetaan neuroneissa tai niiden ympärillä tapahtuvia muutoksia, jotka voivat vaikuttaa ihmisen kognitiiviseen toimintaan, älykkyyteen, tunteisiin, käyttäytymiseen jne. Monet ihmiset ajattelevat, että neurodegeneraatio liittyy läheisesti muistin heikkenemiseen, mutta näin ei välttämättä ole.

Ensinnäkin neurodegeneraatio ei välttämättä tarkoita, että muisti heikkenee iän myötä. Jotkut ihmiset voivat säilyttää hyvän muistin ja jopa ymmärtää vanhurskauden. Tämä johtuu siitä, että ihmisen muistiin vaikuttavat useat tekijät, kuten liikunta, ruokavalio ja elämäntapa.

Toiseksi ihmisaivot voivat luoda uudelleen uusia hermoyhteyksiä ja muodostaa uusia muistoja, joita kutsutaan plastisuudeksi. Iästä riippumatta aivot oppivat jatkuvasti ja muodostavat uusia muistoja. Siksi neurodegeneraatio on yksinkertaisesti luonnollinen muutos aivoissa, eikä se välttämättä tarkoita muistin heikkenemistä.

Lopuksi optimistisen asenteen säilyttäminen voi myös parantaa henkilön muistia. Huolella ja stressillä voi olla haitallisia vaikutuksia aivoihin, mikä johtaa muistin menettämiseen. Positiivinen asenne voi edistää aivojen terveyttä ja parantaa muistia ja kognitiivisia kykyjä.

Yhteenvetona voidaan todeta, että neurodegeneraatio ei välttämättä johda muistin menettämiseen, ja optimistinen asenne elämään voi auttaa ylläpitämään hyvää muistia ja kognitiivisia kykyjä. Siksi meidän tulee säilyttää optimistinen asenne ja vahvistaa liikuntaa, ruokavaliota ja elämäntapojen hallintaa aivojen terveyden ja muistin ylläpitämiseksi. Voidaan nähdä, että meidän on parannettava muistiamme. Cistanche voi parantaa merkittävästi muistia, koska Cistanche voi myös säädellä välittäjäaineiden tasapainoa, kuten nostaa asetyylikoliinin ja kasvutekijöiden tasoa. Nämä aineet ovat erittäin tärkeitä muistille ja oppimiselle. Lisäksi liha voi myös parantaa verenkiertoa ja edistää hapen toimitusta, mikä voi varmistaa, että aivot saavat riittävästi ravintoa ja energiaa, mikä parantaa aivojen elinvoimaa ja kestävyyttä.

Napsauta tietää tapoja parantaa aivojen toimintaa

Tässä kuvataan parannettu menetelmä DI-analyysien suorittamiseen. Mittausten tarkkuutta parannettiin muuttamalla neuriittifragmenttien havaitsemisen valintakriteerejä, poistamalla kuvista artefakteja ja ei-neuriittimateriaaleja sekä optimoimalla kuvan kontrastia. Tällaiset parannukset toteutettiin ImageJ-makrossa, joka mahdollistaa useiden kuvien nopean ja täysin automatisoidun DI-analyysin. Makro sisältää toiminnot solukappaleiden automaattiseen poistamiseen mikrokuvista, mikä laajentaa DI-analyysien käyttöä kokeissa, joissa on mukana dissosioituneita viljelmiä.

Esittelemme kokeellisia tuloksia, jotka tukevat sitä, että tavanomaiseen menetelmään verrattuna tehostettu analyysimenetelmä tuottaa tarkempia mittauksia ja vaatii huomattavasti vähemmän aikaa.

Lisäksi osoitamme menetelmän hyödyllisyyden tutkia neuriittien rappeutumista PD:n soluviljelymallissa suorittamalla kokeen, joka paljastaa c-Jun N-terminaalisen kinaasin (JNK) vaikutukset oksidatiivisen stressin indusoimaan neuriittien rappeutumiseen ihmisen mesenkefaalisissa soluissa. Tätä parannettua analyysimenetelmää voidaan käyttää uudenlaisen käsityksen saamiseksi neuriittien rappeutumisen taustalla olevista tekijöistä ja neurodegeneratiivisten häiriöiden etenemisestä.

Avainsanat:

aksonien rappeuma; degeneraatioindeksi; neuriittien degeneraatio; hermoston rappeuma; oksidatiivista stressiä; Parkinsonin tauti.

Merkityslausunto

Neuriittien rappeutuminen on solutapahtuma, joka liittyy useiden hermoston rappeumasairauksien alkuvaiheeseen. Neuriittien rappeutumista säätelevät molekyylitekijät ovat edelleen huonosti ymmärrettyjä, ja olemassa olevilla menetelmillä neuriittien rappeutumisen tutkimiseksi on rajoitettu käyttö ja tehokkuus. Tässä tunnistamme muutoksia laajalti käytettyyn menetelmään neuriittien rappeutumisen analysoimiseksi, mikä vähentää mittausvirhettä.

Tällaiset metodologiset parannukset sisällytettiin ImageJ-makroon, mikä helpotti nopeaa ja täysin automatisoitua neuriittien rappeuman analysointia käyttämällä suuria mikrokuvasarjoja. Käyttämällä Parkinsonin taudin (PD) soluviljelymallia osoitamme, että makro mahdollistaa tarkempia ja tehokkaampia neuriittien rappeumamittauksia ja laajentaa analyysimenetelmän soveltuvuutta kokeisiin, joissa on mukana dissosioituneita viljelmiä.

Johdanto

Neuriittien rappeutuminen on soluprosessi, jossa aksonit tai dendriitit käyvät läpi progressiivisen toimintahäiriön ja morfologisia muutoksia, mikä johtaa neuriitin eheyden menettämiseen. Neuriittien rappeutuminen on evoluutionaalisesti konservoitunut prosessi, joka on kriittinen hermoverkkojen asianmukaiselle muodostumiselle keskushermoston kehityksen aikana (Neukomm ja Freeman, 2014).

Prosessi käynnistyy kuitenkin myös vastauksena erilaisiin vammoihin, kuten mekaanisiin vaurioihin tai altistumiseen kemoterapiaan käytettäville lääkkeille (Salvadores et al., 2017). Lisäksi neuriittien rappeuma liittyy useiden ikään liittyvien hermostoa rappeuttavien sairauksien etenemiseen, mukaan lukien Alzheimerin tauti, Parkinsonin tauti (PD), Huntingtonin tauti ja amyotrofinen lateraaliskleroosi.

Mielenkiintoista on, että kertyvä näyttö viittaa kaikkien tällaisten hermostoa rappeutuvien sairauksien osalta, että neuriittien rappeutuminen on keskeinen, varhaisen vaiheen tapahtuma, joka edeltää hermosolujen kuolemaa tai kliinisten oireiden alkamista (Serrano-Pozo et al., 2011; Adalbert ja Coleman, 2013; Marangoni et al. ., 2014; Suzuki et ai., 2020). Siten tutkimukset, joissa tutkitaan tekijöitä, jotka säätelevät tätä soluprosessia, voivat paljastaa uusia kohteita useiden hermostoa rappeuttavien tilojen hoitamiseksi.

Neuriittien rappeuman tutkiminen on erityisen tärkeää PD:n, sairauden, jolle on tunnusomaista a-synukleiinia sisältävien proteiiniaggregaattien kerääntyminen, dopaminergisten hermosolujen progressiivinen häviäminen substantia nigra pars compactassa (SNpc) ja erilaisten motoristen ja kognitiivisten oireiden kehittymisestä, ymmärtämiseksi. (Aarsland ym., 2017).

Todisteet kuolemanjälkeisistä ja ihmisen kuvantamistutkimuksista osoittavat, että a-synukleiiniaggregaatteja on enemmän hermosäikeissä kuin solurungoissa, ja dopaminergisten aksonien hajoamista tapahtuu enemmän kuin dopaminergisten hermosolujen häviämistä SNpc:ssä kliinisen puhkeamisen aikana. (Tagliaferro ja Burke, 2016).

Vaikka dopaminergisten neuriittien progressiiviseen rappeutumiseen vaikuttavat molekyylivuorovaikutukset ovat edelleen epätäydellisiä, viimeaikaiset todisteet osoittavat, että neuriittien rappeutumista voivat välittää tapahtumat, jotka ovat riippumattomia hermosolujen kuoleman taustalla olevista signalointikaskadeista (Fukui, 2016; Geden ja Deshmukh, 2016). Siten tutkimukset, jotka arvioivat suoraan neuriittien rappeutumisen fysiologisia perusteita, ovat kriittisiä sellaisten hoitojen kehittämiselle, jotka estävät PD:n varhaista etenemistä.

Vastauksena todisteisiin neuriittien rappeutumisen keskeisestä roolista hermostoa rappeuttavien sairauksien etenemisessä on kehitetty erilaisia ​​menetelmiä neuriittien rappeutumisen mittaamiseksi käyttämällä viljeltyjen hermosolujen mikrokuvia. Esimerkiksi useita erilaisia ​​menetelmiä on kehitetty mittaamaan neuriittien rappeutumista käyttämällä ohjelmistoja, jotka havaitsevat vähentyneen neuriittien määrän tai pituuden (Ofengeim et al., 2012; Johnstone et al., 2018).

Koska tällaiset menetelmät eivät kuitenkaan arvioi suoraan neuriittien fragmentoitumista, tulosten tulkinta muuttujan vaikutuksen määrittämiseksi neuriittien rappeutumiseen voi hämmentyä muuttujan mahdollisten vaikutusten vuoksi neuriittien kasvuun. Tietyt tutkimusryhmät ovat myös mitanneet neuriittien rappeutumista pisteyttämällä subjektiivisesti kuvia neuriiteista morfologisten ominaisuuksien ja näennäisen pirstoutumisen asteen perusteella (Zhai et al., 2003; Nakamura et al., 2016; Krishtal et al., 2017). Tämä vaihtoehtoinen menetelmä on kuitenkin aikaa vievä ja voi aiheuttaa tutkijavirheitä.

Eräs menetelmä, joka helpottaa objektiivista ja suoraa neuriittifragmentaation mittaamista, sisältää ImageJ:n Analyze Particles -algoritmin käytön neuriittifragmenttien pinta-alan mittaamiseksi viljeltyjen solujen mikrokuvissa. Mittausten avulla lasketaan degeneraatioindeksi (DI), asteikko välillä {{0}}.0 ja 1,0, mikä kuvastaa neuriitin degeneraatioastetta (Sasaki et al., 2009).

Vaikka DI-analyysejä voidaan käyttää eriasteisten neuriittien fragmentoitumisen havaitsemiseen, mittausten tarkkuutta rajoittavat yleensä useat virhelähteet, ja menetelmän soveltaminen on rajoittunut ensisijaisesti eksplanttiviljelmiin tai soluihin, jotka on kasvatettu lokeroiduissa mikrofluidilaitteissa. Lisäksi DI-analyysit ovat aikaa vieviä, kun ne ekstrapoloidaan suuriin kuvasarjoihin. Näin ollen pyrimme voittamaan nämä rajoitukset muokkaamalla DI-analyysimenettelyä parantaaksemme tarkkuutta ja tehokkuutta ja laajentamalla samalla sovellettavuutta.

Tässä tutkimuksessa tunnistamme useita DI-analyyseihin yleisesti liittyviä virhelähteitä ja raportoimme metodologisista tarkistuksista, jotka vähentävät eri virhemuotoja. Sisällytämme prosessiparannuksia ImageJ-makroon, jota kutsutaan nimellä Automated Neurite Degeneration Index (ANDI), automatisoidaksemme täysin suurten kuvasarjojen DI-analyysit. ANDI Macron käyttö vaatii vain ohjelmistoja ja tiedostoja, jotka ovat avoimen lähdekoodin ja vapaasti saatavilla. ANDI:lla saadut mittaukset hyötyvät lisääntyneestä tarkkuudesta ja lyhentävät merkittävästi analyysien suorittamiseen kuluvaa aikaa.

Lisäksi osoitamme, kuinka uutta analyysimenetelmää voidaan soveltaa tarkan ja nopean neuriittien degeneraation mittaamiseen PD:n soluviljelymallissa, jossa on mukana dissosioituneita soluja, jotka on kasvatettu ilman lokerointia. Yhdessä nämä metodologiset parannukset voivat johtaa uuteen näkemykseen tekijöistä, jotka ovat neurodegeneraatioon liittyvän tärkeän soluprosessin taustalla.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

Lundin ihmisen mesenkefaalisten (LUHMES) solujen viljelmät perustettiin Lab Tek II kahdeksankuoppaisiin kammiolevyihin, jotka oli päällystetty poly-L-ornitiinilla (PLO) ja fibronektiinillä, poly-D-lysiinillä (PDL) ja laminiinilla, kaikilla neljällä substraatilla tai ei lainkaan. substraatit, kuten on osoitettu. PLO:lla ja fibronektiinillä päällystämiseksi objektilaseja inkuboitiin yön yli huoneenlämpötilassa liuoksen kanssa, joka sisälsi 200 mg/ml PLO:ta (Sigma-Aldrich, luettelonro P3655).

Pesun jälkeen steriilillä vedellä (Avantor) levyjä inkuboitiin 2 mg/ml fibronektiinin kanssa (Sigma-Aldrich, luettelo #F0895) 3 tuntia 37 °C:ssa. Objektilasit pestiin sitten steriilillä PBS:llä (Corning Life Sciences, luettelonumero 21-040-CV) ja annettiin kuivua ilmassa. Päällystämiseksi PDL:llä ja laminiinilla objektilaseja inkuboitiin huoneenlämpötilassa liuoksen kanssa, joka sisälsi 100 ng/ml PDL:ää (Sigma-Aldrich, luettelo nro P7280) ja 10 mg/ml laminiinia (Corning, luettelo nro 354232).

Yön yli inkuboinnin jälkeen objektilasit pestiin steriilillä PBS:llä ja annettiin kuivua ilmassa. Päällystämiseksi kaikilla neljällä substraatilla edellä mainitut toimenpiteet suoritettiin peräkkäin. LUHMES-solut (ATCC, RRID: CVCL_B056) maljattiin päällystetyille kammiolevyille ilmoitetuilla tiheyksillä erilaistumisväliaineeseen, joka koostui DMEM/F12:sta (Invitrogen, luettelonro 11330057), jota oli täydennetty 2 mM glutamiinilla (VWR), 1 % (tilavuus/tilavuus) N-2-lisä, 1 mg/ml tetrasykliiniä (Sigma-Aldrich, luettelonro 87128-25G), 1 mM N6,29-Odibutyryyliadenosiini cAMP (db-cAMP) ; Enzo Life Sciences, luettelo #BML-CN125-0100) ja 2 ng/ml gliasolulinjasta johdettu neurotrofinen tekijä (GDNF; R&D Systems, luettelo #212-GD-010).

Ellei toisin mainita, kaikki viljelmät maljattiin tiheydellä 115,000 solua per kuoppa. 50 % tilavuusväliaine vaihdettiin 48 tunnin välein hoitoon asti. Geneettisen ajautumisen estämiseksi kaikissa kokeissa käytettiin solukantoja, jotka oli siirrostettu kuusi tai vähemmän kertaa.

Kokeet, joissa käytettiin sympaattisten hermosolujen primääriviljelmiä, hyväksyivät Itä-Kentuckyn yliopiston tai Virginian yliopiston eläinten hoito- ja käyttökomitea. Kohdunkaulan ylähermot leikattiin pois syntymän jälkeisistä 0-6 C56Bl/6-hiiristä, inkuboitiin 37 asteessa entsymaattisessa dissosiaatiopuskurissa ja pestiin kasvualustalla proteolyyttisten entsyymien poistamiseksi ja trituroitiin.

Solususpensiot maljattiin tiheydellä 7000 solua kuoppaa kohden Lab Tek II -kahdeksankuoppaisille kammiolevyille. Elatusaineet vaihdettiin päivänä in vitro (DIV) 1, minkä jälkeen väliaine vaihdettiin joka toinen päivä. Elatusaineita täydennettiin sytosiiniarabinofuranosidilla (Ara-C, Millipore-Sigma) DIV1-DIV3:ssa ei-hermosolujen kasvun estämiseksi, minkä jälkeen Ara-C poistettiin alustasta vähintään 24 tunnin ajan ennen hoitoa ohjeiden mukaisesti. Itä-Kentuckyn yliopistossa suoritetuissa kokeissa, joihin sisältyi vetyperoksidikäsittely, kammiolevyt päällystettiin 200 mg/ml PLO:lla (Sigma-Aldrich, luettelonro P3655), 2 mg/ml fibronektiinillä, 100 ng/ml PDL:llä (Sigma-Aldrich, luettelo). #P7280) ja 10 mg/ml laminiinia (Corning, luettelo nro 354232) ennen käyttöä, ja dissosiaatio suoritettiin 30-minuutin inkubaatiolla puskurissa, joka koostui DMEM:stä (ThermoFisher, luettelonro 11960- 044), joka sisälsi 0,025 % trypsiini (Corning Life Sciences, luettelo #25-053-CI) ja 0,3 % kollagenaasia (Worthington Biochemical, luettelo #LS004176).

Tällaisten kokeiden kasvatusalustat koostuivat DMEM:stä, jota oli täydennetty 10 %:lla naudan sikiön seerumia (Invitrogen, luettelonumero 26140-079), 2 mM L-glutamiinia (Corning, luettelonumero 25-005-CI) ja 40 ng/ml hermokasvutekijä (Fisher Scientific, luettelonumero 13-257-019); 5 mM Ara-C:tä (Sigma-Aldrich) käytettiin ei-hermosolujen poistamiseen.

Virginian yliopistossa tehdyissä kokeissa, joihin sisältyi NGF:n poistaminen, solut maljattiin kammiolevyille, jotka oli päällystetty 100 ng/ml PDL:llä (Millipore Sigma) ja 10 mg/ml laminiinilla (Invitrogen), ja dissosiaatio suoritettiin 20-minuutin kuluessa. inkubointi puskurissa, joka koostuu DMEM/F12:sta, joka sisältää BSA:ta (10 mg/ml, Sigma-Aldrich), kollagenaasityyppiä 2 (4 mg/ml, Worthington Biochemical), deoksiribonukleaasi 1:tä (Millipore Sigma) ja hyaluronidaasia (Sigma-Aldrich). Tällaisten kokeiden kasvatusalusta koostui DMEM:stä, jota oli täydennetty 10 %:lla naudan sikiön seerumia (Invitrogen), 1 U/ml penisilliiniä/streptomysiiniä (Invitrogen) ja 45 ng/ml NGF:ää (puhdistettu sylkirauhasista); 10 mM Ara-C:tä käytettiin ei-hermosolujen poistamiseen.

Soluhoidot

Erilaistuneita LUHMES-soluja altistettiin ilmoitetuille {{0}}hydroksididopamiinipitoisuuksille (6-OHDA; Sigma-Aldrich, luettelo nro 162957) tai vehikkeliliuokselle viidentenä päivänä erilaistumisalustassa. 6- OHDA:n varastot valmistettiin jäähdytettyyn PBS:ään, joka sisälsi 0,02 % askorbaattia (Sigma-Aldrich, luettelo #A5960), ja alikvootteja säilytettiin valolta suojatuissa pulloissa inertissä kaasussa 80 asteessa. 24 tunnin käsittelyn jälkeen solut kiinnitettiin inkuboimalla PBS:ssä, joka sisälsi 4 % paraformaldehydiä (PFA), 25 minuutin ajan huoneenlämpötilassa.

C-Junin N-terminaalisen kinaasin (JNK) roolin määrittämiseksi oksidatiivisen stressin aiheuttamassa neuriittien rappeutumisessa viljelmiä esikäsiteltiin 1 tunnin ajan 10 mM SP600125:llä (Sigma-Aldrich, luettelonro S5567) tai vehikkeliliuoksella. ennen väliaineen täydellistä korvaamista väliaineilla, jotka sisältävät 7,5 mM 6-OHDA:ta, 7,5 mM 6-OHDA:ta ja 10 mM SP600125:tä tai vehikkeliliuoksia. SP600125:n varastot valmistettiin liuottamalla inhibiittori steriiliin dimetyylisulfoksidiin (DMSO), ja jäädytetyt erät säilytettiin valolta suojatuissa pulloissa, jotka oli täytetty inertillä kaasulla 20 °C:ssa. Käsittelyt suoritettiin siten, että solut altistettiin korkeintaan 0,1 % DMSO:lle.

Sympaattisten hermosolujen primääriviljelmiä käsiteltiin DIV5:llä. Kokeissa, joihin sisältyi vetyperoksidin aiheuttamaa neuriittien rappeutumista, viljelmät altistettiin 500 mM vetyperoksidille (Sigma-Aldrich, luettelo #H1009-100ML) tai vehikkeliliuokselle, joka koostui steriilistä vedestä (Cytiva, luettelo #SH30529.02). 24 tunnin ajan.

Kokeissa, joihin sisältyi NGF:n poistaminen, SCG-viljelmät joko korvattiin kasvatusalustalla tai ne altistettiin NGF-deprivaatiolle. SCG-viljelmät, joista oli poistettu NGF, huuhdeltiin kolme kertaa NGF-vapaalla kasvualustalla ja inkuboitiin sitten NGF-vapaassa kasvualustassa 80 tuntia ilman väliainemuutoksia. Käsittelyn jälkeen solut kiinnitettiin inkuboimalla 4 % PFA:ssa PBS:ssä 30 minuuttia, minkä jälkeen PFA poistettiin huuhtelemalla PBS:llä.

Värjäys- ja fluoresenssimikroskopia

LUHMES-soluilla tehdyissä kokeissa sekä kokeissa, joissa käytettiin sympaattisia hermosoluja, jotka oli käsitelty vetyperoksidilla, kiinteät solut sisältävät kahdeksankuoppaiset objektilasit läpäisivät 0,1 % Triton X-100:lla PBS:ssä ja estettiin. 1 tunti 10 % normaalilla vuohen seerumilla PBS:ssä, joka sisältää 0,1 % Triton X-100. Sitten objektilaseja inkuboitiin primaarisen b I-tubuliinille spesifisen vasta-aineen kanssa (Covance; 1:1000, RRID: AB_2313773) estoliuoksessa 4 asteessa yön yli. Myöhemmin objektilasit pestiin PBS:llä, inkuboitiin sekundaarisen vasta-aineen kanssa, joka oli kytketty Alexa Fluor 488:aan (Thermo Fisher Scientific; 1:500, RRID: AB_142495) 90 minuuttia huoneenlämmössä ja alistettiin lisäpesuille.

Kokeissa, joihin sisältyi tyrosiinihydroksylaasi (TH) värjäys, objektilaseille suoritettiin lisäinkubaatio PBS:ssä, joka sisälsi 10 % normaalia vuohen seerumia, 0,1 % Triton X-100, TH:lle spesifistä vasta-ainetta (Sigma- Aldrich, 1:400, AB152) 4 asteessa yön yli. Objektilasit pestiin sitten PBS:llä, inkuboitiin sekundaarisen vasta-aineen kanssa, joka oli kytketty Alexa Fluor 568:aan (Thermo Fisher Scientific; 1:500, RRID: AB_1500889), ja alistettiin lisää PBS-pesuille.

Kun immunoleimaus b III-tubuliinille tai TH:lle oli saatu päätökseen, levyjä inkuboitiin 5 mg/ml 49,69-diamidino-2-fenyyli-indolin (DAPI; luettelonro D9542) kanssa PBS:ssä 5 minuuttia. Sitten objektilasit pestiin PBS:llä ja peitinlasit kiinnitettiin käyttämällä Fluoromount G -kiinnitysväliainetta (Southern Biotech, luettelonumero 0100-01).

Kokeissa, joissa käytettiin sympaattisia hermosoluja, joille tehtiin NGF:n poisto, objektilasit blokattiin 1 tunnin ajan inkuboimalla huoneenlämmössä puskurissa, joka sisälsi 5 % normaalia vuohen seerumia (Life Technologies) ja 0.0005 % Triton X-100 PBS:ssä, minkä jälkeen inkubointi primaarisessa vasta-aineliuoksessa, joka sisältää hiiren anti-hiiri Tuj1 (1:1000, Covance) yön yli 4 asteessa. Sen jälkeen objektilasit huuhdeltiin PBS:llä, inkuboitiin 1 tunti vuohen anti-hiiri-IgG Alexa Fluor 488:ssa (1:800, Invitrogen) ja 0,1 mg/ml Hoechst 33342:ssa (Invitrogen) estopuskurissa, suoritettiin lisähuuhtelut PBS:llä ja sallittiin. kuivata. Diat kiinnitettiin Fluoromount-G:llä (Southern Biotech, luettelonumero 0100-01) ja säilytettiin huoneenlämmössä.

LUHMES-soluja sisältävät objektilasit visualisoitiin Nikon Eclipse II Ti-U käänteismikroskooppijärjestelmän 20 objektiivilla Lumencor Mira 4-Channel LED -valolähteellä. 1280 1024-pikselikuvat otettiin Nikon DSQi1Mc 5 MP CCD-kameralla ja NIS Elements 3.22.15 -versiolla (Build 738). Ellei toisin mainita, kaikki vaihekontrastikuvat otettiin käyttämällä valon voimakkuuden ja valotusajan asetuksia, jotka tuottivat keskimääräisen taustan intensiteetin 165 8-bittisissä kuvissa.

Taustan varjostuksen tai muiden epäjohdonmukaisuuksien vähentämiseksi ennen jokaista mikroskopiakertaa otettiin kuva tyhjästä kuopasta ja sitä käytettiin taustan korjaukseen LUHMES-solukuvauksen aikana. Diat, jotka sisälsivät Itä-Kentuckyn yliopistossa tai Virginian yliopistossa viljeltyjä sympaattisia neuroneja, kuvattiin käyttämällä Zeiss LSM 800 -mikroskooppijärjestelmää tai Zeiss LSM 980 -mikroskooppijärjestelmää. Kuvat otettiin 20 suurennuksella ja 1024 1024-resoluutiolla Zen-ohjelmistolla (Carl Zeiss Microscopy).

Solujen elinkelpoisuusanalyysi

Erilaistuneita LUHMES-soluviljelmiä muodostettiin Lab Tek II kahdeksankuoppaisille kammiolevyille, jotka päällystettiin ohjeiden mukaisesti erilaisilla substraateilla. 50 % väliaineen vaihto suoritettiin 48 tunnin välein, ja solut kiinnitettiin 4 % PFA:lla PBS:ssä kuudentena erilaistumispäivänä. Kiinteät solut sisältävät objektilasit värjättiin DAPI:lla, ja kuvat tumavärjäyksestä otettiin Nikon Eclipse II Ti-U Inverted Microscope System -järjestelmällä ja Nikon DS-Fi1 5 MP CCD-kameralla.

Sokkoutunut tutkija arvioi solut terveiksi tai epäterveiksi ytimien ulkonäön perusteella. Solut, joilla oli vähentynyt ydinalue tai ytimen fragmentoituminen, pisteytettiin epäterveellisiksi. Terveiden solujen lukumäärä kuvaa kohden pisteytettiin vähintään viidellä näkökentällä tilaa kohti kussakin kokeessa.

DI mittaukset

Perinteiset DI-mittaukset suoritettiin käyttämällä Fiji Is Just ImageJ (FIJI) -pakettia, joka sisälsi ImageJ 1.52p:n menetelmällä, joka sisälsi laajalti siteerattuja parametreja DI-analyysiin (Shin et al., 2012; Di Stefano et al., 2015; Sasaki et al., 2016; Loreto et ai., 2020; Shin ja Cho, 2020). Kahdeksanbittiset kuvat erilaistetuista LUHMES-soluista, joissa oli hyvin erotetut aksonialueet, binaarisoitiin käyttämällä oletusbinaarisointialgoritmia, ja binäärivaihtoehdot konfiguroitiin tuottamaan kuva, jossa on mustat solut etualalla ja valkoinen tausta.

Vapaakätisen piirtotyökalun avulla jäljitettiin manuaalisesti kaikki kuva-alueet, joissa oli solurunkoja, ja kaikki mustat pikselit muutettiin valkoisiksi jäljitetyillä alueilla. ImageJ:n Measure-työkalua käytettiin mittaamaan yksinomaan neuriitteja sisältävien binaaristen kuvien mustaa kokonaisaluetta. Analyze Particle -työkalua käytettiin sitten käyttämällä kokoasetusta 20–10,000 pikseliä ja ympyrämuotoiluasetusta 0,2–1,0 neuriittifragmenttien havaitsemiseksi. Kaikkien neuriittifragmenttien yhteenlaskettu pinta-ala jaettiin sitten mustalla kokonaisalueella kuvan DI:n laskemiseksi.

Kokeissa, jotka liittyvät kokoparametrien optimointiin neuriittifragmenttien tunnistamiseksi, kaikkiin hiukkasmittauksiin käytettiin ympyräkriteeriä {{0}}.2–1.00. Particle Remover -laajennus (versio 20{{10}}4/02/09), jonka on kehittänyt Wayne Rasband, saatiin osoitteesta https://imaj.nih.gov/. Osoittavissa tapauksissa suoritettiin Partikkelien poisto-laajennuksen sovellus käyttämällä kokoparametreja 0–9 pikseliä ja ympyräparametreja 0,0–1,0 pienten, ei-neuriittisten esineiden poistamiseksi vaihekontrastimikrovalokuvista saaduista binaarisista kuvista.

Samalla tavalla kokoparametreja {{0}}–4 pikseliä ja ympyräparametreja 0–1,0 käytettiin pienten esineiden poistamiseen binaarisista kuvista, jotka oli saatu fluoresenssimikrokuvista, jotka edustavat b III-tubuliinin immunovärjäystä. Ellei toisin mainita, ennen DI-analyysiä kaikki vaihekontrastikuvat paranneltiin kontrastia käyttämällä ImageJ:tä hakutaulukon (LUT) käyttämiseksi vähintään 90 ja maksimi 205.

Keinotekoisen pirstoutumisen mittaus

Viljelmät, jotka sisälsivät terveitä LUHMES-soluja, kiinnitettiin 4-prosenttisella PFA:lla niiden kuudentena erilaistumispäivänä ja immunoleimattiin b III-tubuliinille. Käyttämällä 20 objektiivia 1280 1024-pikselin vaihekontrastimikrokuvat ja fluoresenssimikrokuvat, joista kukin kuvaa identtisiä näkökenttiä, otettiin satunnaisesti otetuilta alueilta. Yhdeksästä eri kulttuurista otettiin yhteensä kymmenen kuvasarjaa.

ImageJ:tä käytettiin luomaan binaaristettuja kopioita alkuperäisistä vaihekontrasti- ja fluoresenssimikrovalokuvista sekä kopioita vaihekontrastimikrokuvista, jotka binaarisoitiin kontrastin parantamisen jälkeen käyttämällä LUT-arvoa vähintään 90 ja enintään 205. Jokaiselle sarjalle kuvista sokeutunut tutkija tunnisti alkuperäisen vaihekontrastimikrokuvan pienen, 150 150-pikselin alueen, jossa oli yksinomaan terveitä ja ehjiä neuriittejä.

Alueen koko ja koordinaatit tallennettiin sitten ImageJ:n kiinnostavan alueen (ROI) hallintaan, ja niitä käytettiin DI-mittausten suorittamiseen saman kuvajoukon binaarisoitujen kuvien analogisilla alueilla. DI-mittaukset suoritettiin perinteisellä menetelmällä, jossa fragmentin kokoparametrit olivat 20 -10,000 pikseliä. Koska kaikki mitatut alueet sisälsivät yksinomaan ehjiä hermosoluja, kaikkia havaittuja fragmentteja pidettiin keinotekoisina fragmentteina.

ANDI makro

ANDI-makro kirjoitettiin ImageJ-makrokielellä. Makro sisältää joukon toimintoja, joiden avulla käyttäjä voi valita polkuja kolmelle hakemistolle: yksi hakemisto sisältää kuvia neuronien, jotka on immunoleimattu hermosolumarkkerilla, kuten b III-tubuliinilla, toinen hakemisto, joka sisältää vastaavat tumavärjäytymistä kuvaavat kuvat, ja kolmas hakemisto. tarkoitettu tulostiedostojen tallentamiseen. Valittujen hakemistojen kuvien fragmenttialueet ja kokonaisneuriittialueet lasketaan sitten sarjan ImageJ-operaatioiden avulla. Lyhyesti sanottuna ydinmerkintöjä kuvaava kuva avataan, siihen kohdistetaan kontrastia ja binaarisoidaan. Hiukkastenpoistolaajennusta käytetään pienten, ei-ydinmäisten esineiden poistamiseen binaarisesta kuvasta, ja binaarisoitu kuva altistetaan sarjalle laajentumia ja eroosioita.

Vastaava kuva soluista, jotka on immunoleimattu b III-tubuliinilla (tai muulla hermosolumarkkerilla), avataan ja altistetaan kontrastin tehostamiselle. Binaarisoitu kuva, joka esittää laajentuneita soluytimiä, vähennetään sitten kuvasta, jossa on b III-tubuliinille immunoleimattuja soluja, jolloin saadaan kuva, jossa on yksinomaan neuriitteja. Sen jälkeen neuriittikuva binaarisoidaan ja siihen poistetaan partikkelit välillä 0 ja 4 pikseliä. Neuriittifragmentin pinta-ala lasketaan käyttämällä Analyze Particle -algoritmia mittaamaan hiukkasia, joiden ympyrä on välillä 0.2 ja 1.0 ja joiden koko on 5 - 10,0000 pikseliä. Neuriittien kokonaispinta-ala lasketaan käyttämällä Mittaustyökalua laskemaan musta kokonaispinta-ala. Kuva, joka esittää binaarisoitua neuriittialuetta korostetuilla fragmenteilla, tallennetaan käyttäjän osoittamaan hakemistoon sekä .csv-tiedostot, jotka raportoivat pirstoutuneen neuriittialueen ja kokonaisneuriittialueen mittaukset.

Edellä mainittujen toimintojen lisäksi makrossa on useita lisätoimintoja, jotka tukevat helppokäyttöisyyttä ja rajoittavat käyttäjän virheitä. Näitä ovat toiminnot, jotka poistavat skaalaustiedot kuvista ja varmistavat, että mittaukset saadaan pikseliyksiköissä; määritä ImageJ-väriasetukset ja binaariasetukset sopivaa kuvan vähentämistä ja binaarisointia varten; varmista, että valitut hakemistot b III-tubuliinivärjäyksen ja DAPI-värjäyksen kuville sisältävät saman määrän kuvia; sulje aiemmin käytetyt kuvat käsittelyajan pidentämiseksi; selkeät tulokset aiemmista analyyseistä ennen uusien analyysien tekemistä; ja estää virheet, jotka liittyvät .ini-tiedoston luomiseen Windows 10:ssä.

Sympaattisten hermosolujen analyyseihin sisältyvien kokeiden osalta ANDI-makroa tarkistettiin siten, että se sisältää toiminnon, joka sisältää dialogiruudun, jonka avulla käyttäjä voi hallita, kuinka monta kertaa ytimien binaarisoituja kuvia laajenevat. Tämän version sisältävän ANDI-version nimi oli ANDI v1.1. Valintaikkunan arvon muuttaminen suuremmaksi lisää soman poiston kokoa, kun taas arvon muuttaminen pienemmäksi pienentää soman poiston kokoa. Oletusarvo on 12, joka on kaikissa LUHMES-soluja koskevissa kokeissa käytettyjen laajennusten lukumäärä. Arvoa 16 käytettiin poistamaan suurempia solurungon alueita sympaattisten hermosolujen analyysien aikana.

ANDI-makro on avoimen lähdekoodin ja vapaasti käytettävissä tai muokattavissa seuraavan URL-osoitteen kautta: https://github. com/kraemerb/kraemerlab. ANDI:n tarkka toiminta on varmistettu useilla henkilökohtaisilla tietokoneilla, joissa on Windows 10 -käyttöjärjestelmä. Edellä mainitusta verkko-osoitteesta on saatavilla myös kuvasarja, jossa on LUHMES-soluviljelmiä, joissa esiintyy eriasteista neuriittien rappeumaa ja jolla voidaan tutkia makron tarkkaa suoritusta muun tyyppisillä tietokoneilla. Verkko-osoite tarjoaa myös pääsyn makron käyttöä kuvaavaan protokollaan.

Aika-arviot

DI-mittausten manuaaliseen suorittamiseen tarvittavan ajan arvioimiseksi vaihekontrastimikrokuvat, jotka kuvaavat LUHMES-soluja, jotka on käsitelty vehikkeliliuoksella, 2,5 mM 6-OHDA, 5.0 mM 6-OHDA, tai 7,5 mM 6-OHDA:lle suoritettiin DI-pisteytys käyttämällä aiemmin vakiintuneita menetelmiä (Kraemer et ai., 2014). Jokaiselle kuvalle tehtiin kontrastin parannus ja binarisointi. ImageJ:n freehand-työkalua käytettiin sitten poistamaan digitaalisesti kaikki kuvatut solukappaleet binaarisista kuvista. Analyze Particle -työkalulla mitattiin fragmentteja, joiden ympyrä on välillä 0.2 - 1,0 ja koko 20 - 10,000 pikseliä, ja Measure-työkalulla määritettiin neuriittien kokonaispinta-ala.

Sirpaloitunutta neuriittialuetta ja kokonaisneuriittialuetta koskevat arvot siirrettiin Microsoft Excelin laskentataulukkoon ja DI-pisteiden laskemiseen käytettiin Excelin matemaattista operaatiota. Kun kuva oli avattu ImageJ:llä, kunkin näiden toimenpiteiden suorittamiseen tarvittava aika mitattiin. Keskimääräiset analyysiajat laskettiin 36 kokonaiskuvasta. Kuvat saatiin yhdeksästä riippumattomasta soluviljelyvalmisteesta, ja analyysit suoritettiin käyttämällä yhtä kuvaa hoitoolosuhteita kohti kustakin soluviljelyvalmisteesta. ANDI-makrolla suoritettujen DI-mittausten nopeuden määrittämiseksi samoilla kuvasarjoilla määritettiin aika, joka tarvitaan makron avaamiseen ImageJ:ssä, makrotoimintojen suorittamiseen, tietojen siirtämiseen Excel-laskentataulukkoon ja DI:n laskemiseen.

Tilastot

Kvantitatiiviset vertailut esitetään laatikko- ja viiksikaavioina, joissa keskiviiva edustaa mediaania, laatikot ulottuvat 25. ja 75. prosenttipisteisiin ja viikset kuvaavat 5. ja 95. prosenttipistettä. Keskiarvoja verrattiin tilastollisesti GraphPad Prism 9.1.2:ssa toistuvilla mittauksilla ANOVA:lla post hoc -vertailuilla käyttäen Sidák-korjausta. Kvantitatiivisten tietojen normaaliolo testattiin Shapiro–Wilk-testillä IBM SPSS 26:ssa.

Kun normaaliolooletus rikottiin (kuviot 1C, 3D), ryhmävertailut suoritettiin ei-parametrisen Friedman-testin avulla Dunnin testin kanssa, joka suoritettiin post hoc -vertailuille. Korrelaatioanalyysit on kuvattu sirontakaavioina ja sisältävät parhaiten sopivat viivat. Tällaisia ​​suhteita analysoitiin käyttämällä Pearsonin tuote-momenttikorrelaatioita tai Spearmanin r:tä, kun normaaliolooletus rikottiin. Korrelaatioanalyysin jäännösten normaalius arvioitiin vastaavien QQ-käyrien visuaalisella tarkastuksella.

Pearsonin tuote-momenttikorrelaatiokertoimia verrattiin toisiinsa käyttämällä Steigerin asymptoottista z-testiä (Steiger, 1980; Lee ja Preacher, 2013). Yhtään poikkeavaa ei suljettu pois. Tilastollinen merkitsevyys hyväksyttiin arvolla p, 0,05. P-arvot pyöristetään neljään desimaaliin ja raportoidaan läpi koko päätekstin. Vaikutuskoot ja 95 %:n luottamusvälit raportoidaan myös parametrisissä analyyseissä, ja vaikutuskoot on kuvattu päätekstissä ja luottamusvälit on lueteltu taulukossa 1.

Tietojen saatavuus

Lisätietoa tästä artikkelista jaetaan kohtuullisesta pyynnöstä.

Koodin saavutettavuus

Paperissa kuvattu koodi/ohjelmisto on vapaasti saatavilla verkossa osoitteessa https://github.com/kraemerb/kraemerlab. Koodi on saatavilla Extended Data 1:nä.

For more information:1950477648nn@gmail.com