Uuden Wenshen Shengjing -keittimen suojaavat vaikutukset syklosporiinin aiheuttamaan testosteronin synteesin ja spermatogeenisen apoptoosin heikkenemiseen
Mar 03, 2022
Yhteystiedot: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Sähköposti:audrey.hu@wecistanche.com
XIAOYAN PAN, XIYAN WANG, XUENAN WANG, WANSHENG ZHANG4, ZHANXUAN SUN1, XUAN XUAN LIANG, XUE ZHANG, WENJUN LI ja ZHIXIN LI
Abstrakti
Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tutkia uuden Wenshen Shengjing Decoctionin (uusi WSSJD; mukaan lukien Cornu Cervi Nippon Parvum, Panax ginseng, Cynomorium solarium,Cistanche deserticola, Radix Astragali, Epimedium brevicornum ja Angelica Sinensis) syklosporiinin aiheuttamaan testosteronin synteesin ja spermatogeenisen apoptoosin heikkenemiseen hiirillä. Yhteensä 90 aikuista Kunming-uroshiirtä jaettiin seuraaviin kuuteen ryhmään: Kontrolli (ei interventiota), dimetyylisulfoksidi (DMSO; sai vain DMSO:ta), syklosporiini A (CSA), klomifeenisitraatti (CC; CsA plus CC, 15 mg/kg) /vrk), WSSJD (CsA plus WSSJD, raakalääke 12 g/kg/vrk) ja uusi WSSJD (CsA plus uusi WSSJD, raakalääke 12 g/kg/vrk). Kaikkia hiiriä käsiteltiin 30 päivän ajan oraalisella letkulla. Sen jälkeen kivekset kiinnitettiin ja värjättiin hematoksyliinilla ja eosiinilla siemenepiteelin kehittymisen arvioimiseksi. Immunohistokemiallisia tekniikoita käytettiin havaitsemaan luteinisoivan hormonin reseptorin (LHR) ilmentyminen ja P450-sivuketjun pilkkoutuminen (P450scc) kivesten Leydig-soluissa. Lisäksi spermatogeenisten solujen apoptoosi kiveksissä havaittiin terminaalisen deoksinukleotidyylitransferaasivälitteisen dUTP-nick-pään leimausmäärityksen avulla, ja virtaussytometriaa käytettiin siittiöiden eloonjäämisasteen ja varhaisen apoptoosin analysoimiseen lisäkiveksessä. Verrattuna CsA- ja CC-ryhmiin, uusi WSSJD:n antaminen lisäsi merkittävästi seerumin testosteronitasoja ja LHR:n ja P450scc:n ilmentymistä kivesten Leydig-soluissa (P<0.05), while="" the="" apoptosis="" of="" spermatogenic="" cells="" in="" the="" seminiferous="" tubules="" and="" early="" apoptosis="" of="" mature="" sperm="" were="" significantly="" decreased=""><0.05). these="" results="" suggest="" that="" new="" wssjd="" may="" ameliorate="" csa-induced="" spermatogenic="" damage="" in="" male="" mice="" by="" enhancing="" testosterone="" synthesis="" and="" the="" secretion="" of="" testicular="" leydig="" cells,="" and="" by="" reducing="" the="" apoptosis="" of="" spermatogenic="">
Johdanto
Syklosporiini A (CSA) on yleisesti käytetty immunosuppressiivinen aine, joka kohdistuu spesifisesti T-soluihin ja estää interleukiinin eritystä-2 ja lisää dramaattisesti maksan, munuaisen ja sarveiskalvon siirtojen onnistumisastetta sekä vastaanottajat (1-3). Pitkäaikaisen CsA-käytön aiheuttama immunosuppressio lisää kuitenkin merkittävästi sydän- ja verisuonisairauksien, infektioiden ja pahanlaatuisten kasvainten riskiä (4). Eid et al (5) raportoivat, että siittiöiden konsentraatio ja liikkuvuus korreloivat negatiivisesti seerumin CsA-pitoisuuden kanssa miespuolisten munuaissiirteen saajien kanssa, mikä viittaa siihen, että CsA voi aiheuttaa lisääntymisjärjestelmän toimintahäiriöitä miespuolisilla vastaanottajilla. Lisäksi on dokumentoitu, että CsA voi olla vastuussa heikentyneestä spermatogeneesistä ja miehen lisääntymisjärjestelmän vaurioista (6).
Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että CsA alensi seerumin testosteronitasoja vaikuttamalla testosteronin biosynteesiin ja erittymiseen kiveksissä. Hän et al (7) havaitsivat, että rotilla, joita hoidettiin 40 mg/kg/vrk CsA:lla, oli merkittävästi korkeammat luteinisoivan hormonin (LH) tasot ja merkittävästi alhaisemmat testosteronitasot seerumissa, mikä johti heikentyneeseen kivesten kehitykseen. Ali et al (8) raportoivat, että CsA-hoito vähensi LH-reseptorin (LHR) ilmentymistä Leydig-solujen kalvolla, mikä myöhemmin vähensi LH-välitteistä testosteronin synteesiä ja eritystä Leydig-soluista. Toisessa Seethalakshmin et al:n tutkimuksessa (9) raportoi, että CsA alensi testosteronitasoja estämällä 17-alfa-hydroksylaasin aktiivisuutta yhteistyökyvyttömästi ja 17 -hydroksisteroididehydrogenaasin aktiivisuutta kilpailevasti testosteronin biosynteesin aikana, ja CsA:n eston ensisijainen paikka oli keskeytynyt syklinen adenosiini. monofosfaattistimulaatio. Lisäksi tämä raportti osoitti, että CsA:n aiheuttama vähentynyt testosteronin eritys Leydig-soluissa vaikutti suoraan miehen lisääntymisjärjestelmän kehitykseen ja lisääntymiskyvyn ylläpitämiseen. Seethalakshmi et al (10) injektoivat eksogeenistä testosteronia CsA-käsiteltyihin rottiin lisätäkseen endogeenisen testosteronitasoja. Havaittiin, että kohonneet eksogeenisen testosteronin annokset palauttivat merkittävästi lisääntymiselinten painoa, follikkelia stimuloivan hormonin (FSH) pitoisuuksia seerumissa ja lisäsivät sukusolujen määrää, mikä osoittaa, että CsA:n aiheuttama spermatogeneesin heikkeneminen voidaan osittain estää eksogeenisellä. testosteronin antaminen (10). Eksogeenisen testosteronin havaittiin kuitenkin olevan riittämätön korjaamaan vaurioituneita kivesten kudoksia, koska CsA vaikutti edelleen testosteronin eritykseen ja spermatogeneesiin, ja siittiöissä ja siittiösoluissa havaittiin korkeita apoptoosia (10).
Wenshen Shengjing Decoction (WSSJD) koostuu 15 kasviperäisestä lääkkeestä, mukaan lukien pääasiassa Cornu Cervi Nippon Parvum, Panax ginseng, Cynomorium solarium,Cistanche deserticola, Radix Astragali, Epimedium brevicorneum ja Angelica Sinensis (11). WSSJD:n on osoitettu lievittävän syklofosfamidin aiheuttamaa spermatogeenistä apoptoosia (11). WSSJD:n terapeuttisen vaikutuksen parantamiseksi edelleen tässä tutkimuksessa kehitettiin uusi WSSJD, joka perustuu CsA:n aiheuttaman kivesten kudosvaurion mekanismiin säätämällä WSSJD-komponenttien annosta. Nykyaikaiset farmakologiset tutkimukset ovat osoittaneet, että sarvisametti WSSJD:ssä voi toimia sukupuolihormonina (12); Radix Astragali voi parantaa kivesten Sertoli-solujen proliferaatiota ja ravinteiden saantia (13), ja Panax ginseng voi vähentää kivesten hyperoksiditasoja ja estää spermatogeenistä apoptoosia (14). Yllä mainitut lääkkeet voivat myös lisätä munuaisten toimintaa ja edistää siittiöiden kehittymistä (12-14). Klomifeenisitraatilla (CC) on aiemmissa kliinisissä tutkimuksissa osoitettu olevan terapeuttinen vaikutus miesten hedelmättömyyteen (15,16). Lisäksi CC:n on yhdistetty parantuneisiin testosteroni- ja siemennesteen parametreihin, ja CC:n suojamekanismit voivat olla samanlaisia kuin WSSJD:n (15,16). Lisäksi Wang et al (17) tutkimuksessa CC:tä käytettiin hoidon kontrollina tutkittaessa kiinalaisen lääketieteen Shengjingin vaikutusta spermatogeneesihäiriöihin hiirillä. Tämän perusteella CC:tä käytettiin positiivisena kontrollina tässä tutkimuksessa.
Tässä tutkimuksessa tutkittiin uuden WSSJD:n suojaavan vaikutuksen taustalla olevaa mekanismia kivesten kudoksissa modifioidun lääkkeen terapeuttisen tehon määrittämiseksi. Suojamekanismin selvittäminen voi tarjota perustan uuden WSSJD:n käytölle CsA:n aiheuttaman spermatogeenisen vaurion lievittämisessä.
Cistanche deserticolan vaikutukset: Estäspermatogeeninen vaurio
Materiaalit ja menetelmät
Eläimet. Yhteensä 90 urospuolista Kunming-hiiriä (8-viikon ikäisiä; 35-40 g) toimitti Changchun Institute of Biological Products Co., Ltd. (Changchun, Kiina). Tämä tutkimus suoritettiin Jilinin lääketieteellisen yliopiston (Changchun, Kiina) eettisen komitean hyväksynnällä. Hiiriä pidettiin 21 ± 3 ˚C:ssa ja 55-65 prosentin suhteellisessa kosteudessa 12 tunnin pimeän valon syklissä. Hiirille annettiin vapaa pääsy tavanomaiseen laboratoriohiiren ruokavalioon ja steriiliin veteen.
WSSJD:n valmistelu. WSSJD:n 15 kiinalaisen lääketieteen komponenttia, mukaan lukien Cornu Cervi Nippon Parvum, Panax ginseng, Cynomorium solarium,Cistanche deserticola, Radix Astragali, Epimedium brevicornum ja Angelica Sinensis (11), ostettiin Tongrentangilta (Peking, Kiina). Nämä materiaalit keitettiin perinteisellä kiinalaisen lääkekeittiön menetelmällä (18). Lyhyesti sanottuna ainekset punnittiin reseptin mukaan ja lisättiin yhteensä 250 ml tislattua vettä yrttien upottamiseksi. Yrttejä liotettiin 30 minuuttia ja sen jälkeen kuumennettiin. Yrttejä keitettiin ensin 10 minuuttia ja sitten lämpö laskettiin kiehuvaksi 20 minuutiksi. 30 minuutin kuumentamisen jälkeen nestemäinen keite erotettiin yrteistä, joita keitettiin edelleen 200 ml:lla tislattua vettä 80 °C:ssa vielä 30 minuuttia. Tämä prosessi toistettiin ja lopullinen määrä keittosnestettä suodatettiin 4-5 sideharsokerroksen läpi. Neste puristettiin myös yrteistä suodatettuun keitteeseen. Keittämistä kuumennettiin sen jälkeen 80 ˚C:ssa vesihauteessa 6–7 tuntia, kunnes pitoisuus saavutti 2 g raakalääkettä/ml, ja keittämistä säilytettiin 4 ˚C:ssa ennen käyttöä. uusi WSSJD valmistettiin perustuen WSSJD:n formulaatioon pienillä muutoksilla Panax ginsengin, Cynomorium solariumin, Radix Astragalin ja Epimedium brevicornumin annoksiin. Decocting-menetelmä oli sama kuin WSSJD:ssä. uusi WSSJD, joka koostuu seuraavista: Panax ginseng, 6 g; Cynomorium solarium, 9 g; Radix Astragali, 12 g; Epimedium brevicornum, 6 g; Cornu Cervi Nippon Parvum, 1 g;Cistanche deserticola9 g; Angelica Sinensis, 6 g; Flatstem Milkvitch Seed, 9 g; Rhizoma Dioscoreae, 15 g; Suuri pää Atractylodes Rhizome, 6 g; Ligusticum wallichii, 3 g; Radix Paeoniae Alba, 6 g; Cinnamomum cassia, 1 g; Costustoot, 1,5 g, ja Fructus Foeniculi, 3 g.
Raakalääkkeiden uutteiden pitoisuudet määritettiin seuraavasti: Raakamateriaalin paino/lopullinen tilavuus. Tätä laskentamenetelmää käytetään laajalti perinteisen kiinalaisen lääketieteen (19-21) tutkimuksessa. Lääkkeiden anto. Hiiret jaettiin satunnaisesti 6 ryhmään (15 hiirtä ryhmää kohden) ja niille annettiin lääkettä mahalaukunsisäisesti. Ryhmät olivat seuraavat: Kontrolli (normaali suolaliuos); dimetyylisulfoksidi (DMSO); CsA; CC; WSSJD; ja uusi WSSJD. CsA-, CC-, WSSJD- ja uusien WSSJD-ryhmien hiirille injektoitiin intraperitoneaalisesti (ip) 15 mg/kg/päivä CsA:ta (Shanxi Powerdone Pharmaceutics Co., Ltd., Datong, Kiina) 30 päivän ajan, kuten aiemmin on kuvattu (8). ). Kontrolli- ja DMSO-ryhmän hiirille tehtiin päivittäinen ip-injektio yhtä suurella tilavuudella normaalia suolaliuosta tai DMSO-liuotinta koko 30-päivän koejakson ajan. Normaaliin suolaliuokseen laimennettu DMSO:n pitoisuus oli 3,25 % (v/v). CC-ryhmälle annettiin 21,6 mg/kg/vrk CC:tä (GKH Pharmaceutical, Ltd., Guangzhou, Kiina) aiemmin kuvatulla tavalla (13), joka myös laimennettiin 3,25-prosenttisella (v/v) DMSO:lla (pH{{14}). }.2). WSSJD- ja uusien WSSJD-ryhmien hiirille annettiin 12 g raakalääkettä/kg/päivä WSSJD:tä ja uutta WSSJD:tä, vastaavasti.Hematoksyliini- ja eosiinivärjäys (H&E). Hiirien kivekset otettiin talteen ja kiinnitettiin välittömästi 4-prosenttisessa paraformaldehydissä (pH=7,2) huoneenlämpötilassa 24 tunnin ajan, mitä seurasi etanolikuivaus, ksyleenikäsittely etanolin poistamiseksi, vaha upottaminen ja leikkaus. Histologiset leikkeet (5 um) saatiin käyttämällä pyörivää mikrotomia. Nämä kiinnitettiin lasilevyille H&E-värjäystä varten. Kivesleikkeitä tarkkailtiin käyttämällä histopatologista valomikroskopiaa siementiehyiden kehityksen arvioimiseksi ja histometristen tietojen saamiseksi. Siemenmäisten tubulusten kehitystä arvioitiin käyttämällä Johnsenin pisteytysjärjestelmää (22).
ELISA. Hoitopäivänä 3 0 hiiret nukutettiin 10-prosenttisella kloraalihydraatilla (Shanghai Guoyao Chemical Reagent Co., Ltd) 0,004 ml/g ruumiinpainoa ip ennen eutanasiaa CO2:lla. Rungon veri kerättiin ja seerumi erotettiin ja säilytettiin -20 °C:ssa. Lyhyesti sanottuna veri kerättiin 1,5 ml:n putkiin ja säilytettiin 4 °C:ssa yön yli. Sitten putkea sentrifugoitiin 1 300 x g 4 °C:ssa 6 minuuttia ja seerumi kerättiin. ELISA-sarjoja (Shanghai Elisa Biotech Co., Ltd., Shanghai, Kiina) käytettiin testosteronin (luettelonro EIA-2380) ja LH:n (luettelonro EIA-2385) seerumipitoisuuksien määrittämiseen. ) valmistajan protokollan mukaan. Optinen tiheys (OD) määritettiin käyttämällä Model 680 -mikrolevylukijaa (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA), ja testosteronin ja LH:n tasot määritettiin standardikäyrän perusteella.
Immunohistokemia. Kiveskudokset kiinnitettiin 4-prosenttisessa formaldehydissä huoneenlämpötilassa 24 tunnin ajan ja upotettiin parafiiniin. Parafiinileikkeet leikattiin 5 um:n leikkeiksi ja niistä poistettiin myöhemmin vaha. Antigeenin talteenotto saavutettiin inkuboimalla leikkeitä 0.01 M sitraattipuskurissa (pH=6.0) 95–98 ˚C:ssa 5 minuutin ajan. Tämän jälkeen leikkeet blokattiin 5-prosenttisella naudan seerumialbumiinilla (Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, Saksa; A3675) huoneenlämpötilassa 1 tunnin ajan. Salpauksen jälkeen leikkeitä inkuboitiin kanin polyklonaalisten vasta-aineiden kanssa LHR:ää (luettelonumero L6792; Sigma-Aldrich; Merck KGaA; 1:200) tai P450-sivuketjun katkaisua (P450scc; luettelonro ab75497; Abcam, Cambridge, UK) vastaan 1:200) 4 ˚C:ssa yön yli pimeässä. Streptavidiini-biotiinikompleksi (SABC) -menetelmää käytettiin LHR:n ja P450scc:n ilmentymisen havaitsemiseen käyttämällä SABC-sarjaa (SA2010; Boster Biological Technology, Pleasanton, CA, USA) valmistajan protokollan mukaisesti. Negatiivisista kontrollihiiristä eristettyjen kudosten kohdalla primaarinen vasta-aine korvattiin PBS:llä. Leydig-soluja, joiden kalvolla tai plasmalla oli keltaista tai ruskeaa värjäytymistä, pidettiin LHR-positiivisina soluina. Jokaisesta näytteestä otettiin viisi objektilasia ja viisi kenttää Leydigin kudosalueilta valittiin satunnaisesti ja arvioitiin fluoresenssimikroskoopilla (suurennus, x400). Positiivisten solujen keskimääräinen OD Leydig-kudosalueilla saatiin käyttämällä Image-Pro Plus 6.0 -ohjelmistoa (Media Cybernetics, Inc., Rockville, MD, USA). LHR:n ja P450scc:n ilmentymät olivat verrannollisia OD-arvoihin, ja korkeammat OD-arvot edustivat korkeampaa proteiiniekspressiota.
Terminaalisen deoksinukleotidyylitransferaasin (TdT) välittämä dUTP-nimimerkki (TUNEL) -määritys. Hiirien kivekset leikattiin, upotettiin vahaan ja leikattiin. Leikkeet (paksuus 5-µm) värjättiin sitten käyttämällä TUNEL-määrityssarjaa (MK1024; Boster Biological Technology) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti sanottuna kivesten kudokset kontrollista (normaali suolaliuos), DMSO-, CsA-, CC-, WSSJD- ja uusista WSSJD-ryhmistä värjättiin käyttämällä biotiinilla leimatun digoksiinivasta-aineen 1:100 laimennusta 30 minuutin ajan 37 °C:ssa. Positiivisena kontrollina käytettiin värjättyä rotan interstitiaalista epiteelikudosta (toimitettu pakkauksessa), ja näytteitä, joita oli inkuboitu PBS:llä biotiinilla leimatun digoksiinivasta-aineen sijasta, käytettiin negatiivisena kontrollina. Vihreää tumavärjäytymistä osoittavien TUNEL-positiivisten solujen esiintymistiheys arvioitiin käyttämällä laserpyyhkäisykonfokaalimikroskooppia. Yhteensä 10 satunnaista kenttää arvioitiin suurella suurennuksella (x400) ja positiiviset solut laskettiin. Positiivisten solujen keskimääräinen lukumäärä kenttää kohti laskettiin.
Propidiumjodidin (PI) tai anneksiini V-fluoreseiini-isotiosyanaatin (FITC) värjäys ja virtaussytometria-analyysi. Cauda-lisäkives otettiin talteen seuraavan lopettamisen jälkeen ja orvaskesi leikattiin terällä siittiöiden vapauttamiseksi lisäkivesestä 2 ml:aan PBS:ää 37 °C:ssa lisäkivessuspensioiden saamiseksi. Tämän jälkeen suspensioita inkuboitiin 37 °C:ssa 10 minuuttia, jotta siittiöt pääsivät uimaan. Siittiöiden aggregaatiot heitettiin pois ja jäljellä olevat siittiönäytteet eristettiin ja suspendoitiin uudelleen PBS:ään, jolloin saatiin 106 solua/ml konsentraatio. Siittiöiden apoptoosi analysoitiin käyttämällä Annexin V-FITC Apoptosis Detection -pakkausta (Nanjing KeyGen Biotech Co., Ltd., Nanjing, Kiina) valmistajan protokollan mukaisesti. Lyhyesti sanottuna 1 ml siittiösuspensiota värjättiin 10 ul:lla PI:tä tai 500 ul:lla sitoutumispuskuria ja 5 ul:lla Annexin V-FITC:tä pimeässä 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Solut analysoitiin välittömästi Epics XL -virtaussytometrialla (Beckman Coulter, Inc.) ja käyttämällä TetraONE™-järjestelmää (6915050; Beckman Coulter, Inc.). Apoptoosin alkuvaiheessa olevat solut tunnistettiin anneksiini V-positiivisella värjäyksellä ja nekroottiset solut tunnistettiin PI-positiivisella värjäyksellä.
Tilastollinen analyysi. Tietojen analyysi suoritettiin käyttämällä SPSS 13.{1}} -ohjelmistoa (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA) ja ilmaistiin keskiarvona plus tai ± keskihajonta, kuten osoitettiin. Ryhmien väliset erot arvioitiin merkitsevyyden suhteen käyttämällä yksisuuntaista varianssianalyysiä, jota seurasi Tukeyn post hoc -testi. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Cistanche deserticola
Tulokset
Uuden WSSJD:n vaikutukset kivesten siementiehyiden kehitykseen. Uuden WSSJD:n mahdollisen suojaavan vaikutuksen tutkimiseksi hiiren kivesten siementiehyiden kehittymiseen verrattiin H&E-värjäytyneiden hiiren kivesten morfologiaa valomikroskopialla. CsA- ja CC-ryhmien hiirten siemenmäiset tubulukset osoittivat tubuluksen reunan kutistumista, pienentyneet tubulusten halkaisijat ja vähentyneet kivesten siemenepiteelin kerrokset verrattuna kontrolliin. Lisäksi spermatogeeniset solut osoittivat epäjärjestystä, spermatogeenisten solujen lukumäärä väheni ja vähän kypsiä siittiöitä oli näkyvissä ontelossa (kuvio 1). Hiirissä DMSO-, WSSJD- ja uusista WSSJD-ryhmistä näkyi enemmän kivesten siemenepiteelin kerroksia ja siementiehyen reuna integroitui ilman kutistumista tai romahtamista (kuvio 1). Johnsen-pisteet eivät eronneet merkittävästi DMSO-ryhmän ja kontrolliryhmien välillä tai CC- ja DMSO-ryhmien välillä. Johnsenin pisteet kuitenkin laskivat merkittävästi CsA- ja WSSJD-ryhmässä verrokkiryhmään verrattuna, ja WSSJD- ja uusien WSSJD-ryhmien pisteet kasvoivat merkittävästi verrattuna CC- tai CsA-ryhmään (P<0.05; table="" i).="" these="" results="" indicated="" that="" new="" wssjd="" and="" wssjd="" promoted="" the="" development="" of="" seminiferous="" epithelium="" following="" csa="">
Uuden WSSJD:n vaikutukset seerumin testosteroniin ja LH:hen. Testosteroni- ja LH-tasot seerumissa mitattiin myöhemmin. Seerumin testosteroni- ja LH-tasot eivät muuttuneet DMSO:n antamisen jälkeen. Sitä vastoin seerumin testosteroni oli merkittävästi alentunut ja LH säädelty merkittävästi CsA:lla käsitellyissä hiirissä verrattuna kontrolleihin (P<0.05; fig.="" 2),="" and="" new="" wssjd="" administration="" significantly="" restored="" testosterone="" to="" near="" control="" levels=""><0.05; fig.="" 2).="" for="" serum="" lh,="" the="" protective="" effects="" of="" wssjd="" were="" similar="" to="" that="" of="" cc;="" however,="" new="" wssjd="" decreased="" serum="" testosterone="" to="" a="" significantly="" lower="" level="" than="" that="" observed="" with="" cc="" and="" wssjd=""><0.05; fig.="" 2),="" suggesting="" a="" superior="" protective="" effect="" of="" new="" wssjd="" over="" cc="" or="">
Uuden WSSJD:n vaikutukset LHR:n ja P450scc:n ilmaisuihin. P450scc:n ja LHR:n ilmentymät arvioitiin kivesten Leydig-soluissa immunohistokemialla (kuviot 3 ja 4). Kontrolliryhmässä LHR ilmentyi Leydig-solujen ulkokalvoilla siementiehyiden välissä (kuvio 3A), ja P450cc ilmentyi kivesten Leydig-solujen sytoplasmassa (kuvio 4A). DMSO-käsittelyllä ei ollut merkittävää vaikutusta LHR:n ja P450scc:n ilmentymiseen. Sitä vastoin CsA-hoito vähensi merkittävästi LHR:n ja P450scc:n ekspressiota verrattuna kontrollihiiriin (P<0.05; figs.="" 3b="" and="" 4b).="" in="" turn,="" the="" expressions="" of="" lhr="" and="" p450scc="" were="" significantly="" increased="" by="" treatment="" with="" cc,="" wssjd,="" or="" new="" wssjd="" compared="" with="" the="" csa="" group=""><0.05; figs.="" 3b="" and="" 4b).="" in="" addition,="" levels="" of="" lhr="" and="" p450scc="" in="" testicular="" leydig="" cells="" were="" significantly="" higher="" in="" wssjd="" and="" new="" wssjd="" mice="" compared="" with="" cc="" mice=""><0.05; figs.="" 3b="" and="" 4b),="" and="" new="" wssjd="" induced="" a="" significantly="" greater="" upregulation="" than="" wssjd=""><0.05; figs.="" 3b="" and="">
Uuden WSSJD:n vaikutus spermatogeenisten solujen apoptoosiin. Spermatogeenisten solujen apoptoosi hiiren kiveksissä analysoitiin TUNEL-määrityksellä. Apoptoottisten solujen tumat havaittiin pääasiallisesti spermatogoniassa ja primaarisissa spermatosyyteissä (kuvio 5A). Spermatogoniat ovat suurempia kuin spermatosyytit ja sijaitsevat lähempänä tyvikalvoa (23). DMSO-hoidolla ei ollut merkittävää vaikutusta apoptoottisten spermatogeenisten solujen määrään kiveksissä. Sitä vastoin CsA-hoito lisäsi merkittävästi apoptoottisten spermatogeenisten solujen määrää verrattuna kontrolli- ja DMSO-ryhmiin (P<0.05; fig.="" 5b).="" in="" turn,="" administration="" of="" cc,="" wssjd,="" or="" new="" wssjd="" significantly="" reduced="" csa-induced="" apoptosis=""><0.05; fig.="" 5b).="" furthermore,="" the="" number="" of="" apoptotic="" testicular="" spermatogenic="" cells="" in="" the="" wssjd="" and="" new="" wssjd="" groups="" was="" significantly="" reduced="" compared="" with="" the="" cc="" group=""><0.05), and="" new="" wssjd="" was="" significantly="" more="" effective="" than="" wssjd=""><0.05; fig.="">
Uuden WSSJD:n vaikutukset siittiöiden selviytymiseen ja varhaiseen apoptoosiin. Uuden WSSJD:n suojaavien vaikutusten varmistamiseksi CsA:n aiheuttamaa siittiöiden apoptoosia vastaan määritettiin siittiöiden eloonjääminen ja varhainen apoptoosi lisäkiveksessä. Lisäkiveksen siittiöt värjättiin PI:llä tai anneksiini V:llä ja analysoitiin virtaussytometrialla (kuviot 6 ja 7). Edellä mainittujen tulosten jälkeen CsA-hoito vähensi merkittävästi elävien siittiöiden prosenttiosuutta ja lisäsi merkittävästi varhaisten apoptoottisten siittiöiden prosenttiosuutta (P<0.05; figs.="" 6b="" and="" 7b),="" while="" dmso="" treatment="" had="" no="" effect.="" wssjd="" and="" new="" wssjd="" significantly="" increased="" the="" percentage="" of="" live="" sperm=""><0.05; fig.="" 6b)="" and="" reduced="" the="" percentage="" of="" early="" apoptosis="" sperm=""><0.05; fig.="" 7b)="" compared="" with="" csa="" treatment.="" the="" percentages="" of="" live="" and="" early="" apoptotic="" sperm="" in="" wssjd="" and="" cc="" mice="" did="" not="" differ="" significantly,="" while="" new="" wssjd="" induced="" a="" significantly="" greater="" increase="" in="" live="" sperm="" percentage="" compared="" with="" the="" cc="" group=""><0.05; fig.="" 6b)="" and="" significantly="" decreased="" the="" percentage="" of="" early="" apoptotic="" sperm="" compared="" with="" the="" cc="" and="" wssjd="" groups=""><0.05; fig.="">
Keskustelu
Aiemmin on dokumentoitu, että CsA:n pitkäaikainen käyttö immunosuppressiivisena aineena vaikuttaa lisääntymiskykyyn (6). Xu (24) raportoi, että siittiöiden morfologia ja elinvoimaisuus CsA:lla hoidetuilla potilailla oli merkittävästi alhaisempi kuin hoitamattomassa ryhmässä, kuten havaittiin 26 munuaisensiirron vastaanottajan siemennestenäytteissä, joita hoidettiin eri annoksilla CsA:ta ja 12 tervettä vapaaehtoista. Havaittiin myös, että siittiöiden pään epämuodostumien määrä oli huomattavasti korkeampi CsA:lla hoidetuilla vastaanottajilla (24). Nämä tulokset viittasivat siihen, että CsA:lla oli annoksesta riippuvainen vaikutus siemennesteen parametreihin. Siksi tutkimukset ovat perusteltuja sellaisten uusien farmakologisten aineiden tunnistamiseksi, jotka pystyvät lievittämään CsA:n aiheuttamia kivesvaurioita ja parantamaan miesten lisääntymiskykyä elinsiirron jälkeen.
Kiveksen spesifinen mikroympäristö edistää spermatogeneesiä ja siten kivesten rakenteen ja toiminnan heikkeneminen voi johtaa siittiöiden pysähtymiseen(25). Monteiro et al (26) käsittelivät Wistar-rottia CsA:lla annoksella 15 mg/kg päivässä 56 päivän ajan ja havaitsivat sidekudoksen lisääntyneen tilavuusosuuden ja pienentyneen Leydig-solujen volyymiosuuden CsA-käsitellyissä rotissa. Havaittiin myös, että CsA aiheutti siemenmäisen epiteelin rappeutumista, mikä johti Sertoli-solujen vakuolisoitumiseen, epänormaaleihin pyöreisiin ja pitkänomaisiin siittiöihin ja jäännössytoplasman kerääntymiseen epiteelin rajalle luumenin viereen (26). Tässä tutkimuksessa Kunming-hiiriä hoidettiin 15 mg/kg CsA:lla päivittäin 30 päivän ajan, mikä johti siemenmäisten tubulusten kutistumiseen ja halkaisijoiden pienenemiseen, siemenmäisten epiteelikerrosten vähenemiseen, siemenmäisten solujen epäjärjestyneeseen järjestykseen, kypsymisen vähenemiseen. siittiöitä luumenissa ja merkittävästi pienentynyttä Johnsen-pistemäärää.
Lisäksi CsA-hoito vaurioitti vakavasti kivesten rakennetta. Tässä tutkimuksessa arvioitiin myös uuden WSSJD:n suojaavia vaikutuksia uutena kiinalaisena lääkkeenä CsA-käsiteltyjen hiirten kiveksiin. Havaittiin, että kivesten siemenepiteelikerrokset ja siemenmäisten solujen järjestely palautuivat uudella WSSJD:llä käsittelyn jälkeen. Lisäksi uuden WSSJD-ryhmän hiirillä oli integroituneita siementiehyitä ilman kutistumista tai romahtamista, ja niillä oli merkittävästi korkeampi Johnsen-pistemäärä verrattuna CsA-käsitellyihin hiiriin. Nämä tulokset viittasivat siihen, että WSSJD korjasi merkittävästi CsA:n aiheuttamia kivesvaurioita, mikä osoittaa, että tämä kasviperäinen lääkeyhdiste voi olla tehokas hoito CsA:n aiheuttaman kivesvaurion ehkäisyssä. Se, onko tämä solun korjaus riippuvainen epiteelin sisällä olevasta markkinaraosta, on myös tärkeä kysymys, jota tulisi tutkia tulevissa tutkimuksissa.
Hypotalamus-aivolisäke-kives-akselilla on tärkeä rooli sukuelinten toiminnan säätelyssä (27). Miesten sukuelinten kehitystä ja toimintaa säätelevät hypotalamuksesta ja aivolisäkkeestä tulevat hormonit (28). Krueger ym. (29) käsittelivät Sprague Dawley -rottia 25 mg/kg/vrk CsA:lla tai 40 mg/kg/vrk CsA:lla 6 päivän ajan ja havaitsivat, että seerumin LH- ja FSH-tasot nousivat 2-4-kertaisesti, kun taas P450scc:n ilmentyminen laski 30 prosenttiin kontrolliryhmän vastaavasta. Lisäksi seerumin testosteronitasot laskivat merkittävästi CsA-käsitellyillä hiirillä, mikä johti heikentyneeseen spermatogeneesiin (29). Tässä tutkimuksessa osoitettiin, että CsA-käsittely vähensi merkittävästi LHR:n ilmentymistä Leydig-soluissa. Vaikka seerumin LH lisääntyi, LHR:n vähentynyt ilmentyminen on saattanut heikentää LH-välitteistä testosteronin biosynteesin palautumista ja vähentää P450scc:n ekspressiota testosteronin biosynteesin nopeutta rajoittavana entsyyminä (30), mikä vaikuttaa Leydig-solujen testosteronin biosynteesiin. Uuden WSSJD:n uudet ainesosat, kuten pilosarvi, osoittavat sukupuolihormonien kaltaisia vaikutuksia (12), jotka voivat parantaa seerumin testosteronitasoja ja alentaa seerumin LH-tasoja, mikä lisää LHR- ja p450scc-ilmentymistä Leydig-soluissa. Erityisesti nykyiset tulokset osoittivat, että uusi WSSJD stimuloi testosteronin biosynteesiä ja eritystä Leydig-soluissa spermatogeneesin edistämiseksi.
CSA:n aiheuttama oksidatiivinen stressi ja kivesvauriot aiheuttavat siittiöiden ja siittiösolujen dysplasiaa (31). On raportoitu, että pitkäaikainen CsA-hoito vahingoittaa antioksidanttijärjestelmää eläinten kivesten kudoksissa, mikä johtaa glutationin, glutationiperoksidaasin ja vetyperoksidin pitoisuuksien laskuun sekä malonidialdehydipitoisuuden nousuun kiveksissä (31). Siksi reaktiivisten happilajien liiallisia määriä kivesten kudoksissa ei voida eliminoida, mikä johtaa siittiökalvon lipidien peroksidaatioon, DNA-vaurioihin ja siittiöiden elinvoiman heikkenemiseen. Tässä tutkimuksessa havaittiin, että CsA-hoito lisäsi merkittävästi DNA:n rikkoutumista ja spermatogeenisten solujen apoptoottista määrää siementiehyissä. Myös siittiöiden eloonjäämisaste lisäkiveksessä laski, kun taas varhaisten apoptoottisten siittiöiden prosenttiosuus kasvoi, mikä osoittaa, että kivesten spermatogeeninen aktiivisuus oli merkittävästi vaurioitunut. Türk et al (32) dokumentoivat, että ellagiinihapon suojaava vaikutus CsA:n aiheuttamiin kivesvaurioihin liittyi oksidatiiviseen stressiin urosrotilla. Tässä tutkimuksessa käytetty uusi WSSJD sisältää erilaisia antioksidanttikomponentteja, mukaan lukien yrttilääkkeen Ginseng, jonka on aiemmin osoitettu vähentävän merkittävästi hyperoksiditasoja kiveksissä (14).
Tässä tutkimuksessa tutkittiin uuden WSSJD:n vaikutuksia CsA:n aiheuttamaan testosteronin synteesin ja spermatogeenisen apoptoosin heikkenemiseen, ja havaittiin, että uusi WSSJD vähensi merkittävästi spermatogeenisten solujen ja siittiöiden apoptoottisia nopeuksia ja näin korjasi kivesten siemenkalvon vaurioita. epiteeli. Kivesten siementiehyiden morfologiaa sekä spermatogeenisten solujen ja siittiöiden apoptoosia tutkittiin histokemian ja virtaussytometrian avulla. Vaikka solusyklin jakautumista ja päivittäistä siittiöiden tuotantoa ei ole tutkittu, ne ovat ryhmämme tulevien tutkimusten kohteena.
WSSJD nosti merkittävästi testosteronitasoja kiveksissä ja vähensi spermatogeenisten solujen ja siittiöiden apoptoosia, mikä korjasi tehokkaasti CsA:n aiheuttaman kivesvaurion. Nämä tulokset osoittavat, että uusi WSSJD voi olla hyödyllinen farmakologinen aine CsA:n aiheuttaman kivesvaurion hoidossa ja ehkäisyssä.
Cistanche deserticola koko juuret
Viitteet
1. Pedersen M ja Seetharam A: Infektiot ortotooppisen maksansiirron jälkeen. J Clin Exp Hepatol 4: 347-360, 2014.
2. Vora GK ja Ciolino JB: Sarveiskalvon allograftireaktio, joka liittyy ei-nokulaariseen tulehdukseen. Digit J Ophthalmol 20: 29-31, 2014.
3. De Pasquale C, Veroux M, Indelicato L, Sinagra N, Giaquinta A, Fornaro M, Veroux P ja Pistorio ML: Munuaisensiirron psykopatologiset näkökohdat: Monitieteisen tiimin tehokkuus. World J Transplant 4: 267-275, 2014.
4. El-Gowelli HM ja El-Mas MM: Syklosporiinin aiheuttaman verenpainetaudin keskusmodulaatio. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 388: 351-361, 2015.
5. EidMM, Abdel-Hamid IA, SobhMA ja el-SaiedMA: siittiöiden liikeominaisuuksien arviointi hedelmättömillä munuaisensiirron vastaanottajilla tietokoneistetun analyysin avulla. Int J Androl 19: 338-344, 1996.
6. Zahra A, Gholamreza N, Farokhi F ja Shalizar Jalali A: Syklosporiinin aiheuttaman siittiöiden heikkenemisen ja alkiotoksisuuden heikentäminen crataegus monogyna -hedelmän vesiuutteella. Solu J 15: 198-205, 2013.
7. He Z, Qiu J, LiJ, Zhao D, Chen G ja Chen L: Siklosporiinista rapamysiiniksi muuttumisen pitkäaikaiset vaikutukset kivesten toimintaan ja morfologiaan rotan siirtomallissa. Transplant Proc 45: 763-769, 2013.
8. AliRB, KlouzA, Boubaker S, LakhalM ja BelkahiaC: Syklosporiinin kivestoksisuuden eläinmalli: Arviointi ja suojaus. Fundam Clin Pharmacol 23: 241-246, 2009.
9. Seethalakshmi L, Flores C, Malhotra RK, Pallas JD, Tharakan D, Khauli RB ja Menon M: Syklosporiinin toiminnan mekanismi testosteronin biosynteesin estämisessä rotan Leydig-soluilla in vitro. Transplantation 53: 190-195, 1992.
10. SeethalakshmiL, FloresC, CarboniAA ja Menon M: Spermatogeneesin kvantitatiivinen ylläpito syklosporiinilla käsitellyissä rotissa antamalla eksogeenisesti testosteronipropionaattia. J Androl 11: 491-497, 1990.
11. Pan XY, Wang XY, Wang XN, Sun ZX, Wang D, Wang X, Yang YY ja Li ZX: Wenshen Shengjing Decoctionin vaikutukset syklofosfamidin aiheuttamaan spermatogeeniseen solujen apoptoosiin ja histoni H3K9 -dimetylaatioon. Shanghai Zhong Yi Yao Za Zhi 48: 82-86, 2014 (kiinaksi).
12. Xu ZH, Li SF, Wang JY, Zhou R ja Tian SJ: Sukupuolihormonin uuttaminen sarven sametista ylikriittisellä CO2:lla. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi 32: 2000-2003, 2007 (kiinaksi).
13. Zhao LP, Xu Z, Zhang M, Sun HC ja Tang F: Fructus Lyciin ja Radix astragalin vaikutukset Sertoli-solujen toimintaan rotan kiveksissä. Zhonghua Nan Ke Xue 13: 82-86, 2007 (kiinaksi).
14. Xu L, Liu XH ja Zhang L: Ginsenosidien kokonaismäärän vaikutukset NO-, NOS- ja kokonaisantihappikapasiteettiin hiiren kiveksessä. Acta Academiae Medicinae CPAPF 5: 507-508, 2006 (kiinaksi).
15. Patel DP, Brant WO, Myers JB, Presson AP, Johnstone EB, Dorais JA, Aston KI, Carrell DT ja Hotaling JM: Klomifeenisitraatin turvallisuus ja tehokkuus hyperandrogeenisilla ja hedelmällisillä miehillä. Int J Impot Res 27: 221-224, 2015.
16. ElSheikh MG, Hosny MB, Elshenoufy A, Elghamrawi H, Fayad A ja Abdelrahman S: E-vitamiinin ja klomifeenisitraatin yhdistelmä hoidettaessa potilaita, joilla on idiopaattinen oligo atsoospermiana: Prospektiivinen, satunnaistettu tutkimus. Andrologia 3: 864-867, 2015.
17. Wang R, Xu L, Zhang WX, Wu YF, Shi JH ja Zhang YX: Shengjing Granule: Tehokas kiinalainen lääke spermatogeeniseen häiriöön hiirillä. Zhonghua Nan Ke Xue 14: 1046-1049, 2008 (kiinaksi).
18. Fan BT: Chinese Medicine Pharmacy, Shanghai Science and Technology Press 12: 62-68, 1997 (kiinaksi).
19. Zhang J, Li H, Lu L, Yan L, Yang X, Shi Z ja LiD: Yiqi- ja Yangyin-kaava parantaa koko kehon säteilytyksen aiheuttamaa hematopoieettisen järjestelmän vauriota. J Radiat Res 58: 1-7, 2017.
20. Minami M, Konishi T, Jiang Z, Arai T ja Makino T: Shin'iseihaiton vaikutus nenän herkistymisen aiheuttamaan hiiren allergiseen reaktioon. J Tradit Complement Med 6: 252-256, 2015.
21. Rong R, Li RR, Hou YB, Li J, Ding JX, Zhang CB ja Yang Y: Mahuang-xixin-fuzi-keite vähentää influenssa a -viruksen tartuntaa munuais-yangin puutosoireyhtymän hiirillä. J Ethnopharmacol 192: 217-224, 2016.
22. Johnsen SG: Kivesbiopsian pistemäärä - menetelmä spermatogeneesin rekisteröimiseksi ihmisen kiveksissä: normaaliarvot ja tulokset 335 hypogonadaalista miehestä. Hormonit 1: 2-25, 1970.
23. Mays-Hoopes LL, Bolen J, Riggs AD ja Singer-Sam J: Spermatogonien, spermatosyyttien ja pyöreiden siittiösolujen valmistaminen geeniekspression analysointia varten fluoresenssiaktivoitua solulajittelua varten. Biol Reprod 53: 1003-1011, 1995.
24. Xu LG: Siklosporiini A:n vaikutus potilaiden siemennesteen parametreihin munuaisensiirron jälkeen. J Clin Urol 20: 603-605, 2005.
25. Pintus E, Ros-Santaella JL ja Garde JJ: Kiveksen koon ulkopuolella: Spermatogeneesin ja siittiöiden ominaisuuksien väliset yhteydet kausittaisessa lisääntymisnisäkkäässä. PLoS One 10: e0139240, 2015.
26. Monteiro JC, Predes FS, Matta SL ja Dolder H: Heteropterys aphrodisiaca -infuusio vähentää syklosporiini A:n sivuvaikutuksia kiveksessä. Anat Rec (Hoboken) 291: 809-817, 2008.
27. Oseko F, Note S, Morikawa K, Endo J, Taniguchi A ja Imura H: Sulpiridin aiheuttaman kroonisen hyperprolaktinemian vaikutus hypotalamus-aivolisäke-kivesten akseliin normaaleissa miehissä. Fertil Steril 44: 106-111, 1985.
28. Wisniewski P, Romano RM, Kizys MM, Oliveira KC, Kasamatsu T, Giannocco G, Chiamolera MI, Dias-da-Silva MR ja Romano MA: Aikuisten altistuminen bisfenoli A:lle (BPA) Wistar-rotissa heikentää siittiöiden laatua häiriintymällä hypotalamus-aivolisäke-kives-akselilla. Toxicology 329: 1-9, 2015.
29. Krueger BA, Trakshel GM, Sluss PM ja Maines MD: Syklosporiinivälitteinen luteinisoivan hormonin reseptorien lamaantuminen ja hemibiosynteesi rotan kiveksissä: Mahdollinen mekanismi seerumin testosteronin laskuun. Endocrinology 129: 2647-2654, 1991.
30. Nolan CJ ja Payne AH: Genotyyppi P450scc-lokuksessa määrittää erot P450scc-proteiinin määrässä ja maksimaalisessa testosteronituotannossa hiiren Leydig-soluissa. Mol Endocrinol 4: 1459-1464, 1990.
31. Türk G, Ateşşahin A, Sönmez M, Yüce A ja Ceribaşi AO: Lykopeeni suojaa syklosporiini A:n aiheuttamalta kivestoksuudelta rotilla. Theriogenology 67: 778-785, 2007. 32. Türk G, Sönmez M, Ceribaşi AO, Yüce A ja Ateşşahin A: Ellagiinihapon oksidatiiviseen stressiin liittyvien syklosporiini A:n aiheuttamien kives- ja siittiövaurioiden vaimeneminen. Int Immunopharmacol 10: 177-182, 2010.
