Aikaisempi pelon oppiminen mahdollistaa uusien pelkomuistojen nopean sulautumisen suoraan aivokuoren verkkoihin, osa 3

Kokeellinen suunnittelu

Tietojen toistettavuus arvioitiin eri kopioilla (S1-taulukko). Ensimmäiset CNQX-inaktivointikokeet Te2:ssa (kuvat 1A–1C) suoritettiin suuremmalla määrällä toistoja, koska ne olivat ensimmäiset kokeet, jotka suoritimme ja testasimme tutkimuksemme päähypoteesia. Eläimet jaettiin a priori eri käyttäytymisryhmiin paino-tasapainoisella tavalla. Saman sikiön urospuoliset eläimet jaettiin satunnaisesti kuhunkin koeryhmään. Käsittelimme ensin tutkimuksemme päähypoteesia, eli aivokuoren inaktivaatio voi vaikuttaa eri tavalla uuden pelkomuistin lujittumiseen kokeellisesti naiiveilla rotilla ja eläimillä, jotka olivat oppineet aiemman pelkotapahtuman.

Uroseläimillä on erittäin vahvat muistit, koska niillä on vahvempi selviytymisvaisto ja halu lisääntyä. Luonnossa elossa olevien eläinten on muistettava paljon maantieteellisiä tietoja, ravintotyyppejä, petoeläinten jälkiä ja ryhmän jäsenten sijainnit sopeutuakseen paremmin ympäristöön ja suojellakseen elämää.

Esimerkiksi urosleijonien on muistettava koko alueen tila, jäsensuhteet ja kilpailijoiden sijainnit suojellakseen aluetta ja asemaansa. Urosseeprojen on muistettava vesilähteiden ja ravinnon sijainti niityllä selviytyäkseen ja lisääntyäkseen. Eräs soodayhtiö julkaisi kerran mainoksen, joka osoitti, että urosjääkarhu muistaa sukeltajan ja hänen ainutlaatuisen tuoksunsa, jotta hän voisi tunnistaa hänet seuraavan kerran nähdessään hänet.

Siksi urospuolisilla eläimillä on oltava vahvat muistit alueensa suojelemisesta, riittävän ravinnon tarjoamisesta ja jälkeläisten lisääntymisestä. Tämä tekee niistä myös tärkeitä aiheita ihmistutkimuksessa, esimerkiksi tutkittaessa sairauksia, kuten muistin heikkenemistä ja Alzheimerin tautia.

Ihmismaailmassa voimme saada inspiraatiota myös uroseläinten muistista. Jatkuva uusille asioille altistuminen, jatkuva oppiminen ja ajattelu voivat parantaa muistiamme ja sopeutumiskykyämme sekä parantaa elintasoamme ja työtehoamme. Oppikaamme siis uroseläimiltä, ​​jatkakaamme tiedon ja kokemuksen keräämistä, meillä on vahvat selviytymisvaistot ja lisääntymishalut ja luokaamme parempi tulevaisuus. Voidaan nähdä, että meidän on parannettava muistiamme. Cistanche deserticola voi parantaa muistia merkittävästi, koska Cistanche deserticola on perinteinen kiinalainen lääkeaine, jolla on monia ainutlaatuisia vaikutuksia, joista yksi on muistin parantaminen. Jauhetun lihan teho perustuu sen sisältämiin erilaisiin vaikuttaviin ainesosiin, mukaan lukien happo, polysakkaridit, flavonoidit jne. Nämä ainesosat voivat edistää aivojen terveyttä monin eri tavoin.

Napsauta tietää tapoja parantaa aivojen toimintaa

Jos näiden ryhmien välillä oli tilastollisia eroja, suoritimme lopulta lisää kontrolliryhmiä ruiskuttamalla suolaliuosta. Samanlaista lähestymistapaa sovellettiin optogeneettisiin kokeisiin, joissa AAV-kontrolliryhmä suoritettiin vasta sen jälkeen, kun tilastolliset erot naiivien ja aiemmin koulutettujen rottien välillä havaittiin. Näiden koeaikataulujen ansiosta pystyimme välttämään tarpeettomia kontrolliryhmiä ja tarpeettomien eläinten käyttöä, mikä on keskeinen kysymys Euroopan ja Italian eläinkokeita koskevassa lainsäädännössä (3 R:n periaate).

Käyttäytymismenettelyt

Kaikki kokeet suoritettiin päivän valossa (klo 8–16). Eläimiä kuljetettiin yksittäin laitoksesta koehuoneisiin erilaisissa pienissä läpinäkyvissä kauhoissa kokeellisten vaatimusten mukaan.

Kuuloharjoitus: Ensimmäinen käyttäytymisjakso. Auditiivinen pelko ehdollistaa eläimet (CS1-CS2). Tässä ryhmässä rotat otettiin hellävaraisesti kotihäkistä ja kuljetettiin asuinhuoneesta äänieristettyyn huoneeseen. Siellä eläimet asetettiin ilmastointilaitteeseen, joka koostui suorakaiteen muotoisesta mustasta häkistä (35 × 40 cm), joka oli varustettu ruostumattomasta teräksestä valmistettujen tankojen ristikolla (halkaisija 1 cm, etäisyys toisistaan ​​1,5 cm), joka oli yhdistetty iskunsyöttölaitteeseen.

Rotat jätettiin häiritsemättä 1 minuutiksi. Tämän ajan jälkeen annettiin 7 ehdollista ärsykettä (CS), jotka koostuivat puhtaasta 15 kHz:n taajuudesta (15 s kesto kukin, 80 dB, 36 s koeväli). Jokaisen äänen viimeiset 1 sekuntia yhdistettiin kipeän US-painamisen kanssa (0,5 mA, 1 s). Hoitojakson lopussa rotat tuotiin takaisin kotihäkkiinsä.

Vain shokkieläimet (shock-CS2). Tässä ryhmässä rotat sijoitettiin samalla tavalla samaan ilmastointilaitteeseen. Välittömästi tämän jälkeen kullekin rotalle kohdistettiin 7-jalkaiskuja (1 s, 0,5 mA) välittömästi peräkkäin. Stimuloinnin päätyttyä eläimet tuotiin takaisin kotihäkkiinsä. Ajan pysyvyys hoitohäkissä oli alle 9 sekuntia. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että tämä menettely mahdollistaa assosiatiivisten prosessien välttämisen tuskallisten ärsykkeiden ja sensoristen ärsykkeiden välillä [29,30].

Hajupelkoiset eläimet (odor-CS2). Tässä ryhmässä rotat sijoitettiin samaan suorakaiteen muotoiseen mustaan ​​häkkiin, joita käytettiin yllä olevissa koeryhmissä, ja ne yhdistettiin sokkisyöttölaitteeseen. Rotat jätettiin rauhaan 2 minuutiksi. Tämän ajan jälkeen annettiin 7 vaniljan hajuista koostuvaa CS:tä (10 s kesto kukin, 24 s koeväli). Jokaisen hajun viimeiset 1 sekuntia yhdistettiin tuskalliseen us:iin (0,5 mA, 1 s). Hoitomoduuli sijoitettiin lähelle tuuletuslähdettä, jotta vältytään toimitettujen ärsykkeiden pysyvyydestä niiden siirtymisen jälkeen. Häkki varmistettiin ylemmällä ristikolla. Hajut esiteltiin virtaus-laimennusolfaktometrillä. Puhdasta ilmaa (1,5 l/min) ohjattiin solenoidiventtiiliin, joka ohjattiin toimiessaan 15 ml:n pulloon, jossa oli 10 ml vaniljan hajua.

Vain sävyeläimet (Tone-CS2). Tämän ryhmän rotat sijoitettiin samaan mustaan ​​häkkiin ja niille annettiin 15-kHz-ääni (7 ärsytystä, 15 s kesto, 36 s ITI), joka annettiin Yhdysvaltojen poissaollessa.

Ennalta altistetut eläimet (Tone-CS1-CS2). Rotat sijoitettiin hoitohäkkiin ja 1 minuutin kuluttua heille esitettiin 20 kertaa pelkkä 15-kHz-ääni, ja 24 tuntia myöhemmin sama sävy yhdistettiin USA:sta CS1:ksi.

Valkoisen melun pelko-ehdolliset eläimet (WN-CS2). Tässä ryhmässä rotat sijoitettiin suorakaiteen muotoiseen mustaan ​​häkkiin ja jätettiin häiritsemättä 1 minuutiksi. Tämän ajan jälkeen annettiin 7 CS:tä, jotka koostuivat WN:stä (15 s kesto kukin, 75 dB, 36 s koevälit). Jokaisen sävyn viimeiset 1 sekuntia yhdistettiin kipeän US-painauksen kanssa (0,5 mA, 1 s). Hoitojakson lopussa rotat tuotiin takaisin kotihäkkiinsä.

Kuulopelon oppiminen: Toinen käyttäytymiskoulutus. Kaksi viikkoa yllä olevassa kappaleessa kuvattujen toimenpiteiden jälkeen eläimiä koulutettiin toiseen erilaiseen kuulopelon hoitotehtävään. Rotat laitettiin tavalliseen nylkimislaatikkoon, kuten edellisessä työssämme [10], ja jätettiin häiritsemättä 2 minuutiksi. Tämän ajan jälkeen toimitettiin 7 CS:tä, jotka koostuivat puhtaista 3 kHz:n taajuuksista (8 s kesto kukin, 80 dB, 22 s koevälit). Jokaisen äänen viimeiset 1 sekuntia yhdistettiin kipeän US-painamisen kanssa (0,5 mA, 1 s). Hoitojakson lopussa rotat tuotiin takaisin kotihäkkiinsä.

Pelkää muistin säilyttämistä. Äskettäin CS2:lle hankitun kuulopelon muistin säilyminen (3 kHz) testattiin 4 päivää myöhemmin. Optogeneettisten kokeiden osalta viimeaikaisen muistin testi suoritettiin lasersyötöllä 24 tuntia CS2-US-oppimisen jälkeen analogisesti aikavälin kanssa, jolloin suoritimme aivokuoren inaktivoinnin antamalla CNQX (eli 24 tuntia sen jälkeen koulutus). Rotat totutettiin käyttämään erilaista laitteistoa kuin ehdollistamiseen käytetty laitteisto, ja ne sijoitettiin eri huoneeseen, jotta vältetään ehdollinen pelkokäyttäytyminen kontekstuaalisiin vihjeisiin [10,62].

Uusi laite koostui läpinäkyvästä muovihäkistä, jonka mustaksi maalattu puoli oli suljettu poistotuulettimella varustetun äänenvaimennuslaatikon sisällä, joka eliminoi kotelosta hajuisen ilman ja aiheutti 60 dB:n taustamelua. Eläinten annettiin tutkia häkkiä 5 minuuttia päivässä totutusistunnon aikana. Pelon muistin säilytystestin päivänä toimitimme 2 minuutin ilmaisen tutkimisen jälkeen 4 CS2:ta 3 kHz:llä (8 s–22 ITI), jota ei seurannut mikään USA.

Jos kokeellinen vaatimus sitä vaati, rotat testattiin sitten kaukopelon muistin säilymisen suhteen, joka oli hankittu 2 viikkoa ennen toista kuulopelon ehdollistamiskoetta. Tätä tarkoitusta varten eläimet laitettiin 7 päivää 3-kHz-äänen pelkomuistin säilytystestin jälkeen uuteen ympäristöön (mustavalkoraitaiseen häkkiin) ja esitettiin sitten 15-kHz-sävy. Neljä ääntä esitettiin 36 sekunnin välein.

Kontekstuaalinen koulutus: Ensimmäinen käyttäytymisjakso. Kontekstuaalinen pelon ehdokasryhmä (CtxA-CtxB). Tässä ryhmässä rotat otettiin hellävaraisesti kotihäkistä, asetettiin ämpäriin ja kuljetettiin asumishuoneesta äänieristettyyn huoneeseen. Siellä eläimet asetettiin ilmastointilaitteeseen, joka koostui edellä mainitusta suorakaiteen muotoisesta mustasta häkistä, joka oli varustettu ruostumattomasta teräksestä valmistettujen tankojen ristikolla, joka oli yhdistetty iskunsyöttölaitteeseen. Rotat jätettiin häiritsemättä 1 minuutiksi. Tämän ajan jälkeen annettiin 5 US (0,5 mA, 1 s) 51 sekunnin välein. Istunnon päätteeksi eläimet tuotiin takaisin kotihäkkiinsä.

Vain shokkiryhmä (shock-CtxB). Rotat, kun ne asetettiin ilmastointilaitteen sisään, saivat välittömästi 5-jalkaiskuja (1 s, 0,5 mA) välittömästi peräkkäin. Ajan pysyvyys hoitohäkissä oli alle 7 sekuntia. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että tämä menettely mahdollistaa assosiatiivisten prosessien välttämisen tuskallisten ärsykkeiden ja sensoristen ärsykkeiden välillä [29,30].

Vain shokkiryhmä (shock-CtxB). Rotat, kun ne asetettiin ilmastointilaitteen sisään, saivat välittömästi 5-jalkaiskuja (1 s, 0,5 mA) välittömästi peräkkäin. Ajan pysyvyys hoitohäkissä oli alle 7 sekuntia. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että tämä menettely mahdollistaa assosiatiivisten prosessien välttämisen tuskallisten ärsykkeiden ja sensoristen ärsykkeiden välillä [29,30].

Uusi kontekstuaalinen pelon ehdolla ja viimeaikainen pelkomuistin säilyttäminen. Kaksi viikkoa yllä olevassa kappaleessa kuvattujen toimenpiteiden jälkeen kaikki ryhmät koulutettiin yhdistämään uusi kontekstuaalinen ympäristö (skinner box -moduuli, joka on sijoitettu eri huoneeseen) tuskalliseen US-kohtaukseen (0,5 mA, 1 s) . Jokainen eläin asetettiin uuteen kammioon ja jätettiin häiritsemättä 2 minuutiksi. Sitten se altistettiin 5 US:lle 30 sekunnin välein.

Kontekstuaalisen pelkomuistin säilyminen testattiin 4 päivää pelkokäsittelyn jälkeen asettamalla rotat uudelleen Skinner-laatikkokammioon 3 minuutiksi. Optogeneettisten kokeiden osalta viimeaikaisen muistin testi suoritettiin lasersyötöllä 24 tuntia CtxB-US-oppimisen jälkeen analogisesti aikavälin kanssa, jolloin suoritimme aivokuoren inaktivoinnin antamalla CNQX (eli 24 tuntia harjoituksen jälkeen). Jos kokeellinen kysyntä sitä vaati, rotat testattiin sitten kaukopelkomuistin säilymisen suhteen asettamalla eläimet Yhdysvaltoihin parilliseen kontekstiin 2 viikkoa ennen uutta assosiaatiota.

Eläimet kuljetettiin kahdessa eri ämpärissä käsittelykammioihin eri kontekstuaalisten menetelmien mukaisesti.

Jäädytysmitta. Kaikissa kokeellisissa toimenpiteissä pelkomuistin säilymisen arviointi määritettiin jäätymisvasteena [10], ja se analysoitiin somaattisen liikkuvuuden täydellisenä puuttumisena hengitysliikkeitä lukuun ottamatta. Jokaisen eläimen jäädytyksessä vietetyn ajan (sekunteina) mitattiin offline-tilassa 2 riippumattoman tarkkailijan toimesta, jotka olivat sokeutuneet eläinryhmille.

Kirurgiset toimenpiteet

Valittujen aineiden antamiseksi kohdealueille rotat nukutettiin isofluraanilla: Induktio suoritettiin 4 % [tilavuus/tilavuus] 2 l/min lääketieteellisessä ilmassa ja laajennettiin jatkuvaan altistumiseen 2 % [tilavuus/tilavuus]) kun rotat asennettiin stereotaksiseen laitteeseen.

Kalloon tehtiin viilto ja porattiin pieniä reikiä, jotta 28-mittarin infuusioneula pääsi tunkeutumaan. Aineiden annosteluun käytettiin 10-ul Hamilton-ruiskua, joka oli asennettu infuusiopumppuun. Infuusioiden jälkeen neula jätettiin paikalleen vielä 3 minuutiksi. Viilto suljettiin sitten ruostumattomasta teräksestä valmistetuilla haavaklipsillä ja eläimelle annettiin ihonalainen injektio analgeettista/anti-inflammatorista ketoprofeenia (2 mg/kg ruumiinpainoa), ja eläintä pidettiin lämpimänä ja tarkkailtuna anestesiasta toipumiseen asti.

Kuten aikaisemmissa tutkimuksissa [10,32–34], eläinten kanylointi oli tarpeetonta, sillä vaikuttavat aineet annettiin suoraan stereotaksisesti. Tämä toimenpide on edullinen, koska pysyvälle kanylaatiotoimenpiteelle ominaista kirurgista traumaa vältetään, mikä rajoittaa trauman yhteen neulan pistoon [10,32–34]. Yleisanestesia ei todellakaan vaikuta merkittävästi muistin lujittamiseen [10,32–34]. Sen varmistamiseksi, että oppimiskokeeseen liittyvä yhdisteiden antamisen ajoitus oli tarkka niin, että rotat saivat valitut yhdisteet noin 1 tunti ja noin 1 päivä harjoituksen jälkeen, isofluraanianestesia indusoitiin 5 minuuttia ennen suunnitellun injektion ajoitusta, esim. klo 55. min rotilla, joita hoidettiin 60 minuuttia harjoituksen jälkeen ja 23 tuntia ja 55 minuuttia eläimillä, jotka injektoitiin 24 tuntia harjoituksen jälkeen. Kukin rotta käsiteltiin ja sitten leikattiin erikseen. Eri käyttäytymisryhmiin kuuluvia eläimiä manipuloitiin lomitetulla tavalla.

AMPA/kainaattiglutamaattireseptoreiden selektiivinen estäjä CNQX ({{0}}Syaani-7-nitrokinoksaliini-2, 3-dioni) (Tocris, 10 ng /ul) [20,21] liuotettiin steriiliin suolaliuokseen (NaCl, 0,9 %) ja säädettiin pH 7,4:ään HCl:lla. Proteiinisynteesin estäjä anisomysiini (Merck, 125 ug/ul) liuotettiin ekvimolaariseen HCl:iin, laimennettiin steriilillä suolaliuoksella ja säädettiin pH-arvoon 7,4 NaOH:lla. Steriiliä suolaliuosta (0,9 % NaCl) käytettiin vehikkelikontrollina. Näitä aineita injektoitiin kahdenvälisesti nopeudella 0,1 ul/min ja tilavuudella 0,5 ul per kohtaa seuraavilla stereotaksisilla koordinaatteilla, jotka on otettu Paxinoksen ja Watsonin atlasesta [26], ja Te2 aivokuoren kenttä viittaa Zillesin atlasiin [25]:

Toissijainen kuulokuori (Te2): 1) AP: −5,8 L: ±7,2 DV: −6. 2) AP: -6,8 L: ±7,2 DV: −6.

Anterior cingulate cortex (ACC): 1) AP: +2,5 L: ±0,6 DV: −2,2. 2) AP: +3,7 L: ±0,6 DV: −2,2.

Injektiotilavuus (0,5 ul per kohta) valittiin aiempien tutkimusten perusteella, joissa aktiivisia yhdisteitä injektoitiin Te2:een [10,34] ja ACC:hen [55,63] aikuisille rotille.

Selän hippokampuksen inaktivoimiseksi injektoitiin aktiivisia yhdisteitä tilavuudella 0,6 ul per kohtaa seuraavilla stereotaksisilla koordinaatteilla:

Selän hippokampus: 1) AP: −2,8 L: ±1,6 DV: −3,3. 2) AP: −4,2 L: ±2,6 DV: −3.

Selän hippokampuksen palautumattomat leesiot indusoitiin antamalla NMDA:ta (Tocris, 18 ug/ul, liuotettu steriiliin suolaliuokseen, 0,4 ul per kohta) nopeudella 0,1 ul/ min pisteissä edellä mainituissa koordinaateissa. Samoja koordinaatteja käytettiin suolaliuoksella injektoiduille kontrolleille ja valeleikkauksille eläimille.

Red Retrobeads (Lumafluor, 1:2 laimennus suolaliuokseen, 0,6 ul) injektoitiin BLA:ssa seuraavien koordinaattien mukaisesti: AP: -2,8; L: ±5,4; DV: −8.3.

Kokeiden lopussa neulan jäljet ​​CNQX-, anisomysiini- tai suolaliuosinjektioiden tapauksessa tai leesioiden laajeneminen NMDA-injektioiden tapauksessa varmistettiin histologisesti. Rotat nukutettiin syvästi ja perfusoitiin sydämensisäisesti 4 % formaldehydillä. Heidän aivonsa leikattiin 30 μm:n kokoisiksi kryostaatilla. Nissl-värjätyt sarjaleikkeet valmistettiin käyttämällä tavanomaista menettelyä ja leikkeet varmennettiin histologisesti mikroskoopilla, joka suurennettiin 2,5x.

Optogeneettiset kokeet

Viruksen injektio. Adeno-assosioitunut virus AAV5:CaMKII ::eNpHR3.0-kirsikka ja kontrollivektori AAV5:CaMKII -kirsikka saatiin University of North Carolina Vector Coresta (Chapel Hill, Pohjois-Carolina, Yhdysvallat). Virustiitteri oli 5:8 molemmille viruksille 5,8 × 10^12 vg/ml. CaMKII-promoottorin käyttö mahdollistaa siirtogeenin ilmentymisen suosien pyramidaalisia hermosoluja. Virukset säilytettiin -80˚C pakastimessa. Te2:een tai ACC:hen kohdistuvat virusinfuusiot suoritettiin edellä mainituilla stereotaksisilla koordinaatteilla 0,5 ul:n tilavuuksilla kutakin reikää kohti. Virus injektoitiin nopeudella 0,1 ul/min, ja neula jätettiin paikalleen vielä 5 minuutiksi. Virusinjektiot suoritettiin 4 viikkoa ennen optogeneettisiä kokeita.

Valaistus.

Optiset kuidut (Plexon, 200/230 μm ydin; pituus 10 mm) istutettiin molemmin puolin BLA:han (AP=-2,8, L=± 5,4, V=-8,2 mm bregmasta). Optogeneettinen esto Te2-projektioille BLA:han tai ACC-projektioille BLA:han saatiin käyttämällä PlexBright Optogenetic Stimulation System -järjestelmää, joka oli kytketty laserdiodiin (Laserglow Technologies). Keltainen valo (589 nm) syntyy ja johdetaan optisen kuidun läpi. Valokuidun kärjessä arvioitu tehotiheys oli 10 - 15 mW projektiokohtien valaistukseen. Pelkomuistin säilyttämisen aikana valon emissio aloitettiin 4 sekuntia ennen sävyn alkamista, jatkui koko äänen ajan ja lopetettiin 4 sekuntia sävyn siirtymisen jälkeen. Kontekstuaaliseen pelkoryhmiin kuuluvat eläimet saivat valostimulaatiota koko kontekstin tutkimisen ajan (3 min). Rotat tutustuttiin patch-johtoon 2 päivää ennen muistin säilyttämiskoetta.

Immunohistokemia. Optogeneettisten kokeiden päätyttyä rotat nukutettiin syvästi ja perfusoitiin intrakardiaalisesti 4 % PAF:lla viruksen diffuusion tutkimiseksi. Aivot leikattiin, säilytettiin yön yli 4 °C:ssa ja siirrettiin lopuksi 30-prosenttiseen sakkaroosiin. Koronaalileikkeet (30 μm) leikattiin kryostaatilla ja kerättiin PBS:ään. Vapaasti kelluvia leikkeitä inkuboitiin estoliuoksessa 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Sitten niitä inkuboitiin primaarisessa monoklonaalisessa hiiren vasta-aineessa mCherryä vastaan ​​(1:500 laimennus, Abcam) estoliuoksessa yön yli huoneenlämpötilassa. Tämän jälkeen leikkeet pestiin PBS:llä ja inkuboitiin 1 tunti huoneenlämpötilassa sekundaarisen fluoresoivan AlexaFluor-568 anti-hiirivasta-aineen (1:600, Invitrogen) kanssa, joka oli laimennettu PBS:ään. Leikkeet pestiin PBS:ssä, kiinnitettiin kiinnitysvälineillä, jotka sisälsivät DAPI:ta (Vector), ja kansilasit peitettiin.

NMDA-injektiot saaneiden rottien aivot kerättiin samalla tavalla. Vapaasti kelluvia leikkeitä inkuboitiin useiden huuhtelujen jälkeen primaarisen monoklonaalisen hiiren anti-Neun-vasta-aineen kanssa (1:1, 000 laimennus, Merck) estoliuoksessa yön yli huoneenlämpötilassa. Tämän jälkeen leikkeet pestiin PBS:llä ja inkuboitiin 1 tunti huoneenlämpötilassa biotinyloidun hevosen anti-hiirivasta-aineen kanssa (1:200-laimennus, Vector). Avidiini-biotiinikompleksi (ABC-kompleksi 1:100, Vector, 2 tuntia ja puolet inkubaatiosta) kytkettiin diaminobentsidiiniin (0,03 %, Merck) Neunin värjäämiseksi. Leikkeet huuhdeltiin sitten PBS:ssä ja siirrettiin gelatiinilla päällystetyille objektilaseille, kuivattiin ja peitettiin peitinlasilla.

Retrohelmillä injektoitujen rottien Te2-osia inkuboitiin primaarisen polyklonaalisen kanin anti-Fos-vasta-aineen (1:2, 000, Cell Signaling) kanssa estoliuoksessa yön yli huoneenlämpötilassa. Sen jälkeen viipaleet pestiin PBS:llä ja inkuboitiin 1 tunti huoneenlämpötilassa anti-kani Alexa 488:n kanssa (1:1, 000, Invitrogen, PBS:ssä). Lopuksi immunoleimatut leikkeet pestiin PBS:ssä, kiinnitettiin gelatiinilla päällystetyille objektilaseille ja peitettiin DAPI:lla täydennetyllä kiinnitysväliaineella.

Mikroskooppi

mCherry-leimaus tutkittiin Zeiss Airyscan konfokaalimikroskoopilla: Käytettiin kahta laseria (405 ja 561 nm), joista kumpikin vastasi huippuemissiospektriä DAPI:lle (Nissl-värjäys solutumille) ja Alexa 568:lle (mCherry). ), vastaavasti. Viruksen diffuusion analysoimiseksi injektiokohdissa otettiin mikrokuvat Te2:sta ja ACC:stä mosaiikkikuvina (kukin yksittäinen otettiin käyttämällä 10-kertaista objektiivia). Axon-päätteet BLA:han analysoitiin käyttämällä 40-kertaista objektiivia 10 osan z-pinona, jotka oli sijoitettu 1 μm:n etäisyydelle toisistaan ​​(159 μm:n neliö; zoomausfraktio, 1,0).

Retrohelmillä injektoiduista eläimistä, joille tehtiin cFos-immunoleimaus, kuvat otettiin 40-kertaisella suurennuksella (159 μm:n neliö; zoomausfraktio, 1.0) kolmella eri laserilla, mikä vastasi huippuemissiospektriä. DAPI:lle (Nissl-värjäys solutumille), AlexaFluor 488:lle (cFos) ja Texas Redille (Retrobeads). 0,7 μm:n leikkeet hankittiin 10- μm:n z-pinoa pitkin. CFos:a, helmillä leimattua ja kaksoispositiivista (cFos+-helmet leimattu) ilmentävien ytimien lukumäärä määritettiin kullekin eläimelle Te2-alueella anteroposteriorisissa koordinaateissa 6,7-7,3 mm:n etäisyydellä bregmasta [10]. Sitten tiedoista laskettiin keskiarvo kunkin eläimen keskiarvon saamiseksi ja tuloksia verrattiin tilastollisesti. Neunin DAB-värjäytyneiden leikkeiden kuvat analysoitiin Neurolucida-ohjelmistolla, joka oli liitetty mikroskooppiin värillisen CCD-kameran kautta [10].

Tietojen analysointi ja poissulkemiskriteerit

Jokaisen ryhmän n määritettiin a priori aikaisempien tutkimustemme [10,16,17], alalla aiemmin julkaistujen töiden perusteella (katso viitteinä ACC [6,22,55] ja Te2 [10,59]), ja G-tehoarvioiden avulla seuraavan taulukon (taulukko 1) mukaisesti:

Kutakin analyysiä varten arvioimme lopullisen keskimääräisen 8-10 eläimen lukumäärän kussakin ryhmässä. Ryhmät ajettiin sisäisten kontrollien kanssa samassa koeistunnossa (S1-taulukko). Ottaen huomioon kirurgisten ja käyttäytymistoimenpiteiden vaihtelevuuden, sisällytimme a priori suuremman määrän koehenkilöitä (jopa 15 % enemmän), jotka joissakin tapauksissa täyttivät kokeelliset kriteerit ja otettiin mukaan, mikä välttää mielivaltaisen poissulkemisen. Hippokampustutkimusten tapauksessa NMDA- ja CNQX-injektioiden vaikutusten arvioimiseksi eri aikavälein tasapainotimme kontrolli-eläinten kokonaismäärän vehikkelillä ja näennäisesti leikattujen rottien välillä eri ryhmissä.

Käyttäytymisanalyysi, histologiset tarkastukset ja solumäärät suoritettiin sokeasti. Eläimet, joilla oli riittämätön neulanjäljen tai NMDA-reversiibelien leesioiden paikannus tai vaurio, jätettiin pois data-analyysistä (S1-taulukko). Farmakologisissa tutkimuksissa poistimme 57 eläintä yhteensä 465 eläimen joukosta, koska neula asetettiin väärin (22/255 Te2:lle, 31/179 ACC:lle ja 4/31 hippokampukselle). Jäljitystutkimuksissa 21 eläimellä eliminoimme 3 koehenkilöä, joille retrohelmien injektiolla ei saavutettu BLA:ta. Te2-optogenetiikkatutkimuksissa, yhteensä 30 eläimellä, poistimme yhden rotan, koska optisten kuitujen sijoitus ei ollut kohdealueen, 1 rotan, yläpuolella. Loppujen lopuksi virus puuttui Te2- ja kahdelta rotalta, koska viruksen diffuusio oli vastaavasti alle 4,7 % ja 5,3 % Te2-alueesta injektiokohdissa. Tilastolliseen analyysiin sisältyneillä rotilla viruksen minimaalinen diffuusio oli 39,6 % etummaisessa stereotaksisessa koordinaatissa ja 50,2 % posteriorisessa stereotaksisessa koordinaatissa.

Samoin ACC-optogeneettisissa kokeissa yhteensä 32 eläimellä eliminoitiin 2 rottaa, koska optisten kuitujen sijoitus ei ollut kohdealueen yläpuolella. Kaksi rottaa suljettiin pois, koska virus ACC:ssä puuttui, 1 eläin, koska virus oli viereisessä sekundaarisessa motorisessa aivokuoressa, ja 1 rotta, koska viruksen diffuusio oli alle 2,3 % ACC-alueesta injektiokohdissa. Muilla rotilla viruksen minimaalinen diffuusio oli 33,3 % etummaisessa stereotaksisessa koordinaatissa ja 42,2 % posteriorisessa koordinaatissa.

NMDA-leesiotutkimuksissa leesiot kohdistuivat enimmäkseen selkähippokampuksen CA1-alueeseen. Hippokampuksen leesioiden minimaalinen (punainen) ja maksimaalinen laajeneminen (vaaleanpunainen) koko selkähippokampuksen alueella olivat vastaavasti 23,2 % ja 53,5 % etummassa stereotaksisessa koordinaatissa ja 28,3 % ja 62,3 % posteriorisessa koordinaatissa. Yhteensä 73 eläimestä 4 rottaa eliminoitiin leesion puuttumisen vuoksi, ja lisäksi 3 eläintä hylättiin, koska leesioiden laajeneminen oli alle 50 % (eli 4,8 %, 4,3 %, 3,1). %) koskien hippokampuksen aluetta kahdessa koordinaatissa.

Alueen ääriviiva-analyysi suoritettiin visuaalisella tarkastuksella ja manuaalisella kvantitatiivisella määrityksellä ZEN 3.0 -ohjelmiston alueen ääriviivatyökalulla. Pinta-ala-arvot normalisoitiin sitten alueen kokonaispinta-alalle. Te2:n, ACC:n ja hippokampuksen stereotaksiset koordinaatit perustuivat Paxinoksen atlasiin [26] ja Te2:n tapauksessa aivokuoren kenttään viitaten Zillesin atlasiin [25].

Tilastollinen analyysi

Kaikki tiedot esitetään keskiarvona ± SEM. Kaikki tiedot läpäisivät Levenen varianssien yhtäläisyystestin. Siten kaikissa kokeissa käytettiin parametrisiä tilastoja. Kahden ryhmän tietoja verrattiin käyttämällä 2-tailed parittomia Studentin t-testejä. Useiden ryhmien vertailut arvioitiin käyttämällä 1-tapa-ANOVA-testiä Tukeyn post hoc -testin kanssa. Ryhmien välisten ja ryhmien sisäisten erojen poistamiseksi laskemme 3 × 2 sekamuotoisen ANOVA-mallin, jossa ryhmä (CS1-CS2, Tone-CS1-CS2, WN-CS2) koehenkilömuuttuja ja kunto (ennen ja jälkeen äskettäistä ehdollistamista +injektiota) koehenkilöiden sisäisenä muuttujana. Kun ryhmä × ehtovuorovaikutus oli merkittävä, suoritimme yksinkertaisen päävaikutusanalyysin ja säätimme jokaista p-arvoa Bonferroni-korjauksella. Jokaiselle seka-ANOVA-mallille arvioimme palloisuusoletuksen Mauchlyn pallomaisuustestin avulla.

Tilastolliset parametrit (eli n:n tarkka arvo jokaiselle ryhmälle, SEM, tilastollinen testi, vaikutuksen koko ja tarkka p-arvo) raportoidaan selitteissä. Samansuuruisille otoskooille vaikutuskoot parittomille t-testeille määritettiin laskemalla Cohenin d tai Glassin d SD:n samankaltaisuuden mukaan, kun taas eri näytekokoille Hedges'g. Solumäärän ja jäätymisen väliset korrelaatiot laskettiin käyttäen Pearsonin kerrointa. Sen määrittämiseksi, täyttivätkö tiedot tilastollisen lähestymistavan oletukset, hylkäsimme nollahypoteesin tasolla P < 0,05. Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttämällä SPSS Statistics 22:ta (IBM).

Tuki informaatio

S1 Kuva. Te2:n (A) ja ACC-kuoren (B) neulanjälkien suurennus, johon on injektoitu CNQX, valittu esimerkkeinä. (C) Kun niitä esitettiin samassa kontekstissa 2 viikkoa toimenpiteen jälkeen, vain shokkieläimet osoittivat vähäistä pelkovastetta, mikä osoitti, että toimenpide ei aiheuttanut ehdollista jäätymistä tilanteessa, jossa sokki annettiin. (D) Samanlaiset tulokset kuin kuvassa 1 saatiin tasapainottamalla CS:nä käytettyjä kahta ääntä (CS1, 3 kHz ja CS2, 15 kHz) (Opiskelijan t-testi, t(14)=3.44, p {{ 13}}.0040, Glassin d=4.14). (E) odor-CS-käsitellyissä rotissa hajuun jäätyminen 2 viikkoa käsittelyn jälkeen oli korkea, vaikka niitä testattiin eri ympäristössä koskien ehdollistamiskontekstia, mikä osoitti, että pelko liittyi erityisesti tähän vihjeen antamiseen. Mittakaavat, 300 μm. ��P < 0,01. Kaikki tiedot ovat keskiarvoja ja SEM. Yhteenvetotiedot S1 Fig:stä löytyvät tukitiedoista tiedostossa S1 Supporting Figure Data. (TIF)

S2 Kuva CNQX-injektio heikensi viimeaikaisten kuulopelkomuistojen säilymistä rotilla, joissa pelko yleistymistä alensi pelkkä sävy esialtistuminen tai käyttämällä valkoisen kohinan sävyä CS1:nä. 3 × 2 sekamuotoinen ANOVA (ryhmän päävaikutus: F(2,42)=6.478, p {{10}}.00 4, η2=0. 236, ehdon päävaikutus: F(1,42)=0.161, p=0.691, η2=0.004, ryhmä × ehtojen vuorovaikutus F(2,42)=3.942, p=0.027, η2=0.158) osoitti, että jäätyminen 3 kHz:n sävyyn ennen sen liittymistä Yhdysvaltoihin oli vähäisempi eläimillä, jotka saivat 15 kHz:n sävyn esialtistuksen ennen 15 kHz:n ja Yhdysvaltojen välistä pariliitosta (n=10, p=0.001) tai valkoiselle kohinalle valmistetuilla rotilla (n=13 , p=0.008) verrattuna CS1-CS2-eläimiin (n=22), jotka osoittivat vaihtelevaa pelon yleistysvastetta. Kuitenkin CS-US-oppimisen ja cnqx-injektioiden jälkeen Te2 aivokuoreen viimeaikainen pelkomuisti heikkeni kaikissa ryhmissä (p > 0,05). Yksinkertainen päävaikutus ryhmien sisällä (ennen ja jälkeen CS-US-oppimisen ja sen jälkeen cnqx-injektion): CS1-CS2, p=0.025; Tone-CS1-CS2, p=0.189; WN-CS2, p=0.347) �P < 0,05, ��P < 0,01. Kaikki tiedot ovat keskiarvoja ja SEM. Yhteenvetotiedot S2-kuvalle löytyvät tukitiedoista tiedostossa S1 Supporting Figure Data. (TIF)

S3 Kuva (A) Satunnainen esimerkki retrohelmien injektiosta, joka kohdistuu BLA:han. (B ja C) Esimerkkejä valokuitujen sijoittamisesta BLA:n yläpuolelle eläimillä, joihin on injektoitu AAV-vektoreita Te2:ssa (B) ja ACC-kuoressa (C). Mittakaavat, 500 μm.

Kiitokset

Kiitämme tohtori E. Manasseroa jatkuvasta tuestaan ​​ja neuvoistaan.

Tekijän panokset

Konsepti: Giulia Concina, Annamaria Renna, Benedetto Sacchetti.

Tietojen kuratointi: Giulia Concina, Luisella Milano, Benedetto Sacchetti.

Muodollinen analyysi: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Rahoitushankinta: Giulia Concina, Benedetto Sacchetti.

Tutkimus: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Metodologia: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Ohjaus: Benedetto Sacchetti.

Vahvistus: Benedetto Sacchetti.

Kirjoitus – alkuperäinen luonnos: Giulia Concina, Benedetto Sacchetti.

Kirjoitus – arvostelu ja editointi: Annamaria Renna, Luisella Milano.

Viitteet
1. Frankland PW, Bontempi B. Viimeaikaisten ja etäisten muistojen järjestäminen. Nat Rev Neurosci. 2005; 6:119–130. https://doi.org/10.1038/nrn1607 PMID: 15685217

2. Dudai Y. Konsolidaatioiden neurobiologia eli kuinka stabiili engrammi on? Annu Rev Psychol. 2004; 55:51–86. https://doi.org/10.1146/annurev.psych.55.090902.142050 PMID: 14744210

3. Squire LR, Genzel L, Wixted JT, Morris RG. Muistin vahvistaminen. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2015; 3:7. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a021766 PMID: 26238360

4. Alvarez P, Squire LR. Muistin konsolidointi ja mediaalinen ajallinen lohko: yksinkertainen verkkomalli. Proc Natl Acad Sci US A. 1994; 91:7041–7045. https://doi.org/10.1073/pnas.91.15.7041 PMID: 8041742

5. McClelland JL, McNaughton BL, O'Reilly RC. Miksi hippokampuksessa ja neokorteksissa on toisiaan täydentäviä oppimisjärjestelmiä: oivalluksia konnektionististen oppimis- ja muistimallien onnistumisista ja epäonnistumisista. Psychol Rev. 1995; 102:419–457.

For more information:1950477648nn@gmail.com