Neljän yhdisteen valmistava eristäminen ja puhdistaminen Cistanches Deserticola YC Ma:sta nopealla vastavirtakromatografialla

1. Esittely

Cistanches deserticolaYC Ma, lajiCistanchesjoka kuuluuOrobanchaceaeperhe, on hyvin tunnettu perinteinen kiinalainen lääketiede munuaisten vajaatoiminnan, naisten hedelmättömyyden, sairaalloisen leukorrean, neurapraksian ja seniilin ummetuksen hoitoon [1]. Se on loiskasvi, joka on laajalti levinnyt Luoteis-Kiinassa. Tähän mennessä useita yhdisteitä, mukaan lukienfenyylietanoidiglykosidit (PhG), iridoideja ja lignaaneja on eristetty tästä lajista [2]. Joillakin PhG:illä on raportoitu olevan antioksidatiivisia, hepatoprotektiivisia ja neuroprotektiivisia vaikutuksia [3–6]. PhG:iden eristäminen ja puhdistaminen on kuitenkin vaikeaa ja aikaa vievää. Lisäksi klassiset monikromatografiset menetelmät eivät ainoastaan ​​käytä suuria määriä orgaanisia liuottimia, vaan antavat myös pienemmän näytteen saannon. Nopea vastavirtakromatografia (HSCCC), kantajaton neste-neste-partitiokromatografiatekniikka, tarjoaa erinomaisen näytteiden talteenoton joihinkin tavanomaisiin menetelmiin verrattuna, ja sitä on käytetty laajalti erilaisten luonnontuotteiden erottamiseen ja puhdistukseen [7–9] . Vaikka useista PhG:istä on puhdistettuCistanchessuku ja muut HSCCC [10–14], mikään paperi ei ole raportoinut akteosidin, isoakteosidin, syringalidi A 3'- puhdistamisesta -L-ramnopyranosidi ja 2'-asetyylilakteosidi yhdessä kaksivaiheisessa järjestelmässä.

LUONNOLLINEN CISTANCHE TUBULOSA SEKSUAALITOIMINNON PARANTAMISEEN PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Tässä artikkelissa raportoimme yksinkertaisen menetelmän neljän PhG:n erottamiseksi ja puhdistamiseksi C. deserticolasta. Lopuksi yksivaiheisella erotuksella saatiin 30,9 mg akteosidia, 13,0 mg isoakteosidia, 12,5 mg syringalidi A 3'- -L-ramnopyranosidia ja 7,2 mg 2'-asetyylilakteosidia. 297 mg:sta fraktiota, jonka puhtausaste on 99 %, 95 %, 99 % ja 98 %. Niiden rakenteet karakterisoitiin1H- ja13C-NMR-spektritietojen ja HR-MS-spektrien perusteella. Tässä tutkimuksessa tunnistetun neljän PhG:n rakenteet on esitetty kuvassa 1.

2. Tulokset ja keskustelu

2.1. Raakauutteen HPLC-analyysi

C. deserticolan n-butanoliuutteen ainesosalla rikastettu fraktio analysoitiin HPLC-UV:lla. Käytetty kolonni oli Accurasil C18 (250 mm × 4,6 mm, id 5 μm) (Thermo-Fisher Scientific Instruments, kaupunki, osavaltiolyhenne, USA), liikkuva faasi oli metanoli-vesi (30:70, v/v). Virtausnopeus oli 1 ml/min. Ilmaisimen aallonpituus asetettiin 254 nm:iin. HPLC-kromatogrammi on esitetty kuvassa 2. Huiput 1-4 vastaavat akteosidia (1), isoakteosidia (2), syringalidi A 3'- -L-ramnopyranosidia (3) ja 2'-asetyylilakteosidia (4). .

2.2. Kaksifaasisen liuotinjärjestelmän valinta

Onnistunut erottaminen HSCCC:llä riippuu pitkälti sopivan kaksifaasisen liuotinjärjestelmän valinnasta, kaksifaasinen liuotinjärjestelmä valittiin kunkin kohdekomponentin jakautumiskerroinarvojen (K) mukaan ja optimaalisen K:n alueen tulisi olla {{ 2}}.5-2.

LUONNOLLINEN CISTANCHE TUBULOSA IMUNITEETTA PARANTAAN PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Kokeessa useiden kaksifaasisten liuotinjärjestelmien kohdekomponenttien K-arvot on esitetty taulukossa 1 (vaikkakin hieman korkeampi piikin 4 kohdalla, tulokset osoittautuivat hyväksyttäviksi). Niistä etyyliasetaatti-n-butanoli-etanoli-vesi (40:6:6:50, v/v/v/v) antoi sopivat jakautumiskertoimet kohdeyhdisteille. Lopulta liuotinjärjestelmää, joka koostui etyyliasetaatti-n-butanoli-etanoli-vedestä (40:6:6:50, tilavuus/tilavuus/tilavuus/tilavuus), käytettiin neljän C. deserticolan yhdisteen eristämiseen ja puhdistamiseen, kuten kuvassa on esitetty. Kuva 3. Kuten kuvassa 2, kunkin HSCCC-fraktion HPLC-analyysi paljasti, että neljä puhdasta PhG:tä (akteosidi, 99 %; isoakteosidi, 95 %; syringalidi A 3'- -L-ramnopyranosidi 99 % ja 2'- asetyylilakteosidi 98 %) voitiin saada raakafraktiosta.

3. Kokeellinen

3.1. Laite HSCCC

Tässä tutkimuksessa käytetty laite oli TBE{{0}}B-suurnopeusvastavirtakromatografiajärjestelmä (Shanghai Tauto Biotech Co., Shanghai, Kiina), jossa oli kolme preparatiivista monikerroksista kelaerotuskolonnia, jotka on kytketty sarjaan (halkaisija) putkesta=2,6 mm, kokonaistilavuus=300 ml) ja 2{{10}} ml:n näytesilmukka. Pyörimissäde tai pidikkeen akselin ja sentrifugin keskiakselin välinen etäisyys (R) oli 5 cm, ja arvo vaihteli 0,5:stä sisäisessä liittimessä 0,8:aan ulkoisessa liittimessä (= r/R, missä r on etäisyys kelasta pidikeakseliin). Kokeessa lämpötilan säätelyyn käytettiin HX 105 vakiolämpötilan kiertolaitetta (Beijing Changliu Lab Instrument Company, Peking, Kiina). HSCCC-järjestelmä oli varustettu mallilla TBP-5002 keskipaine vakiovirtauspumpulla, mallin TBP-2000 UV-detektorilla, joka toimii aallonpituudella 254 nm, ja mallin V4.0 työasemalla (Jinda Bio-chemistry Instrument). Yritys, Shanghai, Kiina).

Käytetty korkean suorituskyvyn nestekromatografia (HPLC) oli Agilent 1200 -järjestelmä, joka koostuu G1312A-binääripumpusta, G1329A-automaattisesta näytteenottimesta, G1314A-muuttuvan aallonpituuden detektorista (VWD), G1316A-termostatoidusta kolonniosastosta ja G1379Bgilents-LC379Bgilents-työstöstä. . Puhtauksien havaitsemiseen käytettiin alltech 3300 ELSD:tä. Agilent 6520 Q-TOF ja Bruker AVANCE III 500-NMR-spektrometrejä käytettiin yhdisteiden rakenteelliseen tunnistamiseen. 1H- ja 13C-NMR-spektrit (500 ja 125 MHz, vastaavasti) mitattiin huoneenlämpötilassa (22 astetta /295,1 K).

3.2. Reagenssit ja materiaalit

Etyyliasetaatti, n-butanoli ja etanoli olivat analyyttistä laatua ja metanoli oli HPLC-laatua. Kaikki liuottimet ostettiin Tianjin Concord Technology Companylta (Tianjin, Kiina). Milli-Q-vettä (18,2 MΩ) (Millipore, Bedford, MA, USA) käytettiin kaikkiin liuoksiin ja laimennoksiin. C. deserticolan juurakot kerättiin Sisä-Mongolian maakunnasta Kiinan kansantasavallasta kesäkuussa 2009. Professori Lijuan Zhang tunnisti kasvin ja laboratorioimme talletettiin lahjakorttinäyte (nro 20091001).

3.3. Raakanäytteen valmistus

Jauhettuja ilmakuivattuja meheviä C. deserticolan varsia (1 kg) refluksoitiin kahdesti vesipitoisella etanolilla (8 1, 60 % tilavuus/tilavuus) 2 tuntia kullakin kerralla. Uute haihdutettiin alennetussa paineessa ja 60 asteen lämpötilassa, kunnes etanoli oli haihtunut kokonaan. Jäännös suspendoitiin veteen ja uutettiin peräkkäin kolme kertaa kloroformilla, etyyliasetaatilla ja n-butanolilla, jolloin saatiin 5,16 g n-butanoliuutetta alennetussa paineessa kuiviin haihduttamisen jälkeen. Sen jälkeen n-butaaniuute erotettiin silikageelikolonnissa (200-300 mesh) käyttämällä progressiivista gradienttieluointia (CHCl3-MeOH, 10:1 → 1:1), jolloin saatiin kahdeksan fraktiota. Fraktiota 6 (297 mg) käytettiin HSCCC:n lisäeristykseen ja erottamiseen.

LUONNOLLINEN CISTANCHE TUBULOSA PERINTEINEN KIINALAINEN LÄÄKKEET PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3.4. Kaksifaasisten liuotinjärjestelmien valinta

Kaksifaasiset liuotinjärjestelmät valittiin kohdekomponenttien jakaantumiskertoimen (K) mukaan C. deserticolan fraktiossa. K-arvot määritettiin LC-analyysillä seuraavasti: Sopiva määrä raakauutejauhetta (fraktio 6) liuotettiin liuotinjärjestelmän alempaan faasiin ja analysoitiin HPLC:llä. Piikkien pinta-alat kirjattiin A1:ksi. Sitten sama tilavuus ylempää faasia lisättiin liuokseen ja sekoitettiin perusteellisesti jakautumistasapainon saavuttamiseksi. Alempi faasi analysoitiin sitten uudelleen HPLC:llä. Jälkimmäiset huippualueet kirjattiin A2:ksi. K-arvot laskettiin seuraavan yhtälön mukaisesti: K=(A1 − A2)/A2 [15,16].

3.5. Kaksifaasisen liuotinjärjestelmän ja näyteliuoksen valmistaminen

Tässä tutkimuksessa HSCCC-erotukseen käytettiin kaksifaasista liuotinjärjestelmää, joka koostui etyyliasetaatti-n-butanoli-etanoli-vedestä (40:6:6:50, v/v/v/v). Kukin liuotin lisättiin erotussuppiloon ja tasapainotettiin perusteellisesti huoneenlämpötilassa. Ylempi faasi ja alempi faasi erotettiin ja niistä poistettiin kaasut sonikaatiolla 30 minuutin ajan juuri ennen käyttöä. Näyteliuos valmistettiin liuottamalla 297 mg fraktiota 6 15 ml:aan etyyliasetaatti-n-butanoli-etanoli-vesi (40:6:6:50, v/v/v/v) alempaa faasia.

3.6. HSCCC-erottelumenettely

HSCCC suoritettiin seuraavasti. Monikerroksinen kierrekolonni täytettiin ensin ylemmällä orgaanisella stationäärifaasilla. Alempi vesipitoinen liikkuva faasi pumpattiin sitten kolonnin päähän virtausnopeudella 1,5 ml/min, ja samaan aikaan HSCCC-laitetta käytettiin kierrosnopeudella 900 rpm. Sen jälkeen, kun hydrodynaaminen tasapaino oli vakiinnuttanut, kuten kirkas liikkuva faasi, joka eluoitui hännän ulostulossa (noin kaksi tuntia myöhemmin), injektoitiin injektioventtiilin läpi 15 ml:n näyteliuosta, joka sisälsi 297 mg raakauutetta (fraktio 6). Kolonnin effluenttia tarkkailtiin jatkuvasti 254 nm:ssä. Neljä huippufraktiota kerättiin kromatogrammin mukaan ja haihdutettiin sitten alennetussa paineessa. Laitteen lämpötila asetettiin 25 asteeseen.

3.7. HPLC-analyysi ja HSCCC-huippufraktioiden tunnistus

HSCCC:n huippufraktiot analysoitiin HPLC-ELSD:llä. Käytetty kolonni oli Accurasil C18 (250 mm × 4,6 mm, id 5 µm), ja liikkuva faasi oli metanoli-vesi (30:70, tilavuus/tilavuus). Virtausnopeus oli 1 ml/min. ELSD:tä käytettiin seuraavissa olosuhteissa: Temp 45 astetta, kaasu 1,6 l/min. Neljän HSCCC-huippufraktion rakenteellinen tunnistus suoritettiin HR-ESI-MS-,1H- ja13C-NMR-spektroskopialla.

3.8. Rakenteellinen identifiointi

Fraktio I: HR-ESI-MS havaittu m/z 623,2001 (M-H)-, laskettu yhdisteelle C29H35O15, 623,1981. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) 8 ppm: 1,09 (3H, d, J=6 Hz, ramnoosin CH3), 2,79 (2H, t, J=7,5 Hz, Ar- CH2-), 4,37 (1H, d, glukoosin J=8 Hz, H-1), 5,18 (1 H, d, J=1 Hz, H{{34) ramnoosin }}), 6,27 (1H, d, J=15,5 Hz, Ar-CH=CH-), 7,59 (1H, d, J=15,5 Hz, Ar-CH=CH-), 6,5-7,1 (6H, aromaattinen H). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) 8 ppm: 131,5 (C{62}}), 117,2 (C{65}}), 146,2 (C{68}}), 144,7 (C{71}}). ), 116,4 (C-5), 121,3 (C-6), 72,4 (C- ), 36,6 (C- ), 127,7 (Caf-1), 115,3 (Caf{{89) }}), 146,9 (Caf-3), 149,8 (Caf-4), 116,6 (Caf-5), 123,2 (Caf-6), 168,3 (Caf- ), 114,8 (Caf-), 148,1 (Caf-), 104,3 (G-1), 76,1 (Glc-2), 81,7 (Glc-3), 70,5 (Glc-4 ), 76,3 (Glc-5), 62,4 (Glc-6), 103,1 (Rha-1), 72,3 (Rha-2), 72,1 (Rha-3 ), 73,9 (Rha-4), 70,7 (Rha-5), 18,5 (Rha-6). Verrattuna kirjallisuuden [17] tietoihin fraktio I vastasi akteosidia.

Fraktio II: HR-ESI-MS havaittu m/z 623,1987 (M-H)-, laskettu yhdisteelle C29H35O15, 623,1981. 1H-NMR (5{54}} MHz, CD3OD) 8 ppm: 1,25 (3H, d, J=6,5 Hz, ramnoosin CH3), 2,78 (2H, t, J=7 Hz, Ar-CH2-), 4,33 (1H, d, glukoosin J=8 Hz, H-1), 5,17 (1H, d, J { {33}} Hz, ramnoosin H-1), 6,28 (1H, d, J=15,5 Hz, Ar-CH=CH-), 7,56 (1H, d, J=15,5 Hz, Ar-CH=CH-), 6,5-7,0 (6H, aromaattinen H). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) 8 ppm: 131,5 (C{62}}), 117,2 (C{65}}), 146,2 (C{68}}), 144,7 (C{71}}). ), 116,5 (C-5), 121,3 (C-6), 72,4 (C- ), 36,7 (C- ), 127,8 (Caf-1), 115,2 (Caf{{89) }}), 146,8 (Caf-3), 149,7 (Caf-4), 116,6 (Caf-5), 123,2 (Caf-6), 169,2 (Caf-), 115,0 (Caf-), 147,3 (Caf-), 104,5 (G-1), 75,5 (Glc-2), 84,2 (Glc-3), 70,1 (Glc-4 ), 75,7 (Glc-5), 64,7 (Glc-6), 102,8 (Rha-1), 72,4 (Rha-2), 72,4 (Rha-3 ), 74,1 (Rha-4), 70,5 (Rha-5), 17,9 (Rha-6). 1H-NMR- ja13C-NMR-spektritiedot olivat yhtäpitäviä isoakteosidin tulosten kanssa, kuten kirjallisuudessa on raportoitu [18].

Fraktio III: HR-ESI-MS havaittu m/z:llä 6{{108}}7,2032 (M-H)-, laskettu yhdisteelle C29H35O14, 607,2032. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) 8 ppm: 1,09 (3H, d, J=6 Hz, ramnoosin CH3), 2,84 (2H, t, J=7,5 Hz, Ar- CH2-), 4,37 (1H, d, glukoosin J=8 Hz, H-1), 5,19 (1 H, d, J=1,5 Hz, H{ {35}} ramnoosista), 6,27 (1H, d, J=16 Hz, Ar-CH=CH-), 7,59 (1H, d, J=16 Hz, Ar- CH=CH-), 6,6-7,1 (7H, aromaattinen H). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) 8 ppm: 130,8 (C{61}}), 116,2 (C{64}}), 130,9 (C{67}}), 156,8 (C{70}} ), 130,8 (C-5), 116,2 (C-6), 72,4 (C- ), 36,4 (C- ), 127,8 (Caf-1), 114,8 (Caf{{88) }}), 149,8 (Caf-3), 146,9 (Caf-4), 116,6 (Caf-5), 123,2 (Caf-6), 168,3 (Caf-), 115,4 (Caf-), 148,0 (Caf-), 104,3 (G-1), 76,3 (Glc-2), 81,7 (Glc-3), 70,4 (Glc-4 ), 76,1 (Glc-5), 62,5 (Glc-6), 103,0 (Rha-1), 72,3 (Rha-2), 72,2 (Rha-3 ), 73,9 (Rha-4), 70,7 (Rha-5), 18,4 (Rha-6). Kirjallisuuden [18] mukaan fraktio III vastasi syringalidi A 3'- -L-ramnopyranosidia.

Fraktio IV: HR-ESI-MS havaittu m/z 665,21{{20}} (M-H)-, laskettu yhdisteelle C31H37O16, 665,2087. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) 8 ppm: 1,09 (3H, d, J=6,5 Hz, ramnoosin CH3), 2,00 (3H, s, OAc), 2,72 (2H, t, J=7,5 Hz, Ar-CH2-), 4,55 (1H, d, J=8 Hz, glukoosin H-1), 4,90 (1H, d, J=1 Hz, ramnoosin H-1), 6,29 (1H, d, J=15,5 Hz, Ar-CH=CH-), 7,62 (1H, d) , J=15,5 Hz, Ar-CH=CH-), 6,5-7,0 (6H, aromaattinen H). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) 8 ppm: 131,9 (C{66}}), 117,3 (C{69}}), 146,1 (C{72}}), 144,7 (C{75}}). ), 116,4 (C-5), 121,4 (C-6), 72,7 (C- ), 36,4 (C- ), 127,7 (Caf-1), 115,4 (Caf{{93}) }}), 146,9 (Caf-3), 149,9 (Caf-4), 116,6 (Caf-5), 123,2 (Caf-6), 168,1 (Caf-), 114,7 (Caf-), 148,2 (Caf-), 101,8 (G-1), 75,3 (Glc-2), 80,3 (Glc-3), 70,8 (Glc-4 ), 76,2 (Glc-5), 62,3 (Glc-6), 103,3 (Rha-1), 72,0 (Rha-2), 71,8 (Rha-3 ), 73,7 (Rha-4), 70,8 (Rha-5), 18,5 (Rha-6), 171,5 (C=O), 20,9 (OAC). 1H-NMR- ja13C-NMR-spektritiedot olivat yhtäpitäviä 2'-asetyylilakteosidin [17] kanssa.

4. Johtopäätökset

Perustettiin HSCCC-menetelmä Cistanches deserticola YC Ma:n akteosidin, isoakteosidin, syringalidi A 3'- -L-ramnopyranosidin ja 2'-asetyylilakteosidin preparatiivista erottamista ja puhdistamista varten. Tämä tutkimus osoittaa, että HSCCC on erittäin tehokas tekniikka bioaktiivisten komponenttien preparatiiviseen erottamiseen ja puhdistamiseen kasvimateriaaleista. Yhdisteet voidaan myös eristää riittävän suuressa mittakaavassa korkeilla puhtauksilla ja niitä voidaan sitten käyttää vertailuaineina kromatografiaan tai bioaktiivisuustutkimuksiin. Menetelmä on käyttökelpoinen, taloudellinen ja tehokas tekniikka monimutkaisten luonnontuotteiden nopeaan preparatiiviseen eristykseen.

LUONNOLLINEN CISTANCHE TUBULOSA SEKSUAALITOIMINNON PARANTAMISEEN PHGS75% ECH 30% ACT 12%