Esikäsittelyllä aktivoitu AKT säätelee hermoston toleranssia iskemialle MDM2-p53-reitin kauttaⅠ

Abstrakti

Yksi tärkeimmistä esikäsittelyvälitteisen hermosolujen suojauksen mekanismeista on solujen apoptoosin heikkeneminen, mikä indusoi aivojen toleranssia myöhemmän vaurioittavan iskemian jälkeen. Tässä yhteydessä antiapoptoottisella PI3K/AKT-signalointireitillä on keskeinen rooli solujen erilaistumisen ja eloonjäämisen säätelyssä.

Klikkaa nähdäksesi cistanche tubulosa jauhehermosolujen suojaus

Aktiivisen AKT:n tiedetään lisäävän hiiren kaksoisminuutin-2 (MDM2), E3-ubikitiiniligaasin, joka destabiloi p53:n ja edistää syöpäsolujen eloonjäämistä, ekspressiota. Neuroneissa osoitimme äskettäin, että MDM2–p53-vuorovaikutusta voimistaa farmakologinen esikäsittely, joka perustuu NMDA-glutamaattireseptorin subtoksiseen stimulaatioon, mikä estää iskemian aiheuttamaa hermosolujen apoptoosia.

Ei kuitenkaan tiedetä, vaikuttaako tämä mekanismi hermosolujen toleranssiin iskeemisen esikäsittelyn (IPC) aikana. Tässä osoitamme, että IPC indusoi AKT:n PI3K-välitteisen fosforylaation Ser473:ssa, mikä puolestaan ​​fosforyloi MDM2:n Ser166:ssa. Tämä fosforylaatio laukaisi MDM2:n tuman stabilisaation, mikä johti p53:n destabiloitumiseen, mikä esti hermosolujen apoptoosia iskeemisen vamman yhteydessä. PI3K/AKT-reitin esto wortmanniinilla tai AKT-hiljennyksellä indusoi sytosolisen MDM2:n kertymistä, mikä kumosi IPC-indusoidun hermosuojan.

Siten IPC tehostaa PI3K/AKT-signalointireitin aktivaatiota ja edistää hermosolujen toleranssia säätelemällä MDM2-p53-vuorovaikutusta. Löytömme tarjoavat uuden mekaanisen reitin, joka liittyy IPC-indusoituun hermosolujen suojaamiseen AKT-signaloinnin moduloinnin kautta, mikä viittaa siihen, että AKT on mahdollinen terapeuttinen kohde iskeemistä vauriota vastaan. Avainsanat: AKT; MDM2; p53; PI3K; iskeeminen toleranssi; esikäsittely

1. Esittely

Ihmisillä ohimenevän iskeemisen kohtauksen (TIA) olemassaolo on paljastunut endogeeniseksi esiehdoitukseksi tilaksi, joka hyödyttää aivohalvauspotilaiden toiminnallisia tuloksia [1–3]. Lyhyen, subtoksisen iskeemisen ärsykkeen indusoima endogeeninen hermosuojaus, joka tunnetaan nimellä iskeeminen esikäsittely (IPC), pidetään strategiana kehittyvällä neuroprotektion alalla iskeemisiä vaurioita vastaan ​​[4–6].

Todisteet osoittavat, että IPC:n edistämä hermosolujen suojaus riippuu transkriptiosta, translaatiosta ja translaation jälkeisistä mekanismeista, mikä muuttaa avainproteiinien toimintaa iskemian jälkeen [6–11]. IPC-indusoidun iskeemisen toleranssin (IT) mekanismia ei kuitenkaan ole täysin selvitetty ihmisen aivoissa [12,13].

Uusien kokeellisten lähestymistapojen kehittäminen IPC-välitteisen neuroprotektion ymmärtämiseksi on tehokas työkalu aivojen IT:n taustalla olevien endogeenisten mekanismien tulkitsemiseen [6], joilla on potentiaalia paljastaa uusia terapeuttisia kohteita aivohalvauspotilaiden aivovaurioiden minimoimiseksi. Kahden viime vuosikymmenen aikana apoptoottinen hermosolukuolema on asettanut itsensä olennaiseksi mekanismiksi, joka liittyy aivoiskeemiseen vaurioon [14–16]. Tässä mielessä proteiinikinaasi B tai AKT, seriini/treoniinikinaasi, joka vaatii toiminnallisen fosfoinositidikinaasin (PI3K) aktivoitumisen, on pidetty tärkeänä kohteena iskemian jälkeisissä hermosoluja suojaavissa hoidoissa [17,18].

Äskettäin osoitimme, että PI3K/AKT-signalointireitin estäminen lisää hermosolujen herkkyyttä eksitotoksisuuteen [19]. AKT on mukana monimutkaisessa anti-apoptoottisessa signalointiverkostossa [20], jonka komponentit voivat olla läsnä eri subsellulaarisissa paikoissa kudostyypistä riippuen [21,22]. Sydämessä AKT on osallistunut esihoitoon edistämään sydänsuojaukseen [23].

Todisteet osoittavat myös, että fosforyloitu AKT edistää hermosolujen selviytymistä aivoiskemian alkaessa [24]. Vaikka AKT-aktivaatio voi myötävaikuttaa IT:n induktioon aivoissa [25], tarkka mekanismi sen IPC-välitteiseen aktivaatioon on edelleen vaikeaselkoinen. Kasvainsoluissa PI3K/AKT-signalointireitin aktivaatio johtaa MDM2:n fosforylaatioon Ser166/186:ssa, mikä edistää MDM2:n [26,27] tuman translokaatiota ja tehostaa sen ubikvitinaatioaktiivisuutta [28].

Tumassa MDM2 sitoutuu p53:een ja edistää sen ubikvitinaatiota ja sitä seuraavaa proteasomaalista hajoamista, mikä estää p53:n toimintaa [29]. Stressiolosuhteissa p53 voi myös laukaista MDM2:n yli-ilmentymisen, mikä päinvastoin vaimentaa p53:n aktivaatiota negatiivisessa takaisinkytkentäsilmukassa [30]. PI3K:n esto estää AKT-aktivaatiota [31] ja MDM2-fosforylaatiota esikäsitellyssä sydämessä [32].

Tässä yhteydessä havaitsimme aiemmin, että in vivo aivojen esikäsittely vähensi infarktin tilavuutta ohimenevän keskimmäisen aivovaltimotukoksen (tMCAO) jälkeen lisäämällä MDM2-proteiinitason ilmentymistä. Näin ollen MDM2–p53-kompleksi heikensi iskemian aiheuttamaa p53/PUMA/kaspaasi-3-signalointireitin aktivaatiota primaarisissa aivokuoren neuroneissa [33].

Täällä kaivetaan PI3K/AKT-signalointireitin roolia IPC-välitteisessä hermosolutoleranssissa myöhempää iskeemistä vauriota vastaan ​​sekä taustalla olevaan mekanismiin, ja keskitymme pääasiassa mahdolliseen yhteyteen AKT-aktivaation ja MDM2-p53-kompleksin välillä. .

2. Tulokset

2.1. IPC-promoted neuroprotection

Välittyy AKT:n fosforylaatio Ser473:ssa, MDM2:n fosforylaatio Ser166:ssa ja p53-destabilaatio Kuvasimme aiemmin MDM2–p53-vuorovaikutuksen vaikutuksen hermosolujen herkkyyteen iskemialle [34] ja IT [33]. Täällä tutkimme AKT:n mahdollista roolia IPC-välitteisessä neuroprotektiossa ehdokkaana osallistua MDM2-p53-reitti.

Ensinnäkin vahvistimme, että iskemia edisti AKT-aktivaatiota neuroneissa, kuten AKT-fosforylaatio Ser473:ssa osoittaa. Kuten kuvassa 1A esitetään, lyhyt (20 min) OGD indusoi merkittävästi p(Ser473)AKT- ja MDM2-ilmentymistä, kun taas AKT-proteiinitasot pysyivät muuttumattomina (kuvio S1A). AKT-fosforylaatiota ei kuitenkaan havaittu, kun neuronit altistettiin pitkitetylle OGD:lle (90 min). Lisäksi MDM2-proteiinitasot olivat alhaisemmat, mikä on yhdenmukainen p53-proteiinin korkeamman ilmentymisen kanssa, kuten kuvassa 1A esitetään.

Aikariippuvainen Mdm2:n ilmentymisen lisääntyminen OGD:n jälkeen (kuva 1B) vahvistaa, että subakuutti iskemia voi olla tärkeä indusoimaan mekanismeja, jotka estävät p53:n stabiloitumisen OGD:n jälkeen, kuten aiemmin on kuvattu [33]. Käytimme lyhyttä OGD:tä (20 min), jota seurasi 2 tunnin uudelleenhapetus IPC-mallina (kuva S1B) [33]; näin ollen analysoimme hermosolujen uutteita, jotka kerättiin 4 tunnin uudelleenhapetuksen jälkeen OGD:n jälkeen (OGD/R) tai OGD:n jälkeen, jota edelsi IPC-protokolla (IPC plus OGD/R). Samanaikaisesti hermosoluja inkuboitiin normoksiassa (Nx) tai esikäsittelyssä (IPC) (kuva S1B).

Kuten kuvioissa 1C ja S1C esitetään, IPC indusoi AKT:n varhaisen aktivaation, mikä paljasti fosforylaatiolla Ser473:ssa [35], mitä seurasi MDM2-proteiinin stabilointi ja fosforylaatio Ser166:ssa. IPC esti myös OGD/R:n indusoiman p53:n stabiloitumisen (kuvio 1C). Mielenkiintoista on, että kuviossa 1D esitetyt immunofluoresenssikuvat paljastivat, että IPC edisti AKT-fosforylaatiota Ser473:ssa hermosoluissa, jotka kertyivät pääasiassa ytimeen, ja vähensi p53:n stabiloitumista OGD/R:n jälkeen (IPC plus OGD/R) verrattuna esikäsittelemättömiin hermosoluihin (OGD). /R).

Tämän seurauksena IPC esti OGD/R:n aiheuttaman hermosolujen apoptoosin ja kaspaasin-3 aktivoitumisen virtaussytometrillä (kuva S1D) ja fluorimetrisillä määrityksillä (kuva S1E) mitattuna. Vahvistaaksemme p53:n roolia IPC-välitteisessä neuroprotektiossa käytimme hermosoluja, jotka ekspressoivat (villityyppi; wt) tai eivät (knockout; ko) p53-proteiinia. Tuloksemme osoittavat, että neuronit, joista puuttui p53 (kuvio S1F), olivat vastustuskykyisempiä OGD-indusoidulle apoptoosille kuin p53 wt -neuronit.

Lisäksi apoptoositasot p53KO-hermosoluissa olivat samanlaisia ​​kuin esikäsitellyissä (IPC plus OGD/R) wt-hermosoluissa havaitut (kuva S1G), mikä vahvistaa p53:n destabiloinnin keskeisen roolin IPC-välitteisessä neurosuojauksessa [33]. Tuloksemme osoittavat, että IPC aiheutti hermosuojan iskeemistä vammaa vastaan ​​mekanismin kautta, johon sisältyy AKT:n fosforylaatio Ser473:ssa, MDM2:n stabilointi ja fosforylaatio Ser166:ssa ja p53:n destabiloituminen.

2.2. IPC laukaisee MDM2-fosforylaation Ser166:ssa PI3K/AKT-polun kautta

PI3K/AKT-signalointireitti on osallisena hermosolujen IT:ssä sekä in vitro [36] että in vivo [37]. IPC-välitteisen PI3K/AKT-reitin aktivoitumisen roolia MDM2-p53-kompleksin säätelyssä ei kuitenkaan ole tutkittu. Tämän selventämiseksi hermosoluja inkuboitiin peruuttamattoman ja spesifisen PI3K/AKT-reitin inhibiittorin, wortmanniinin kanssa [19].

Kuten kuviossa 2A esitetään, wortmanniini kumosi IPC:llä tehostetun (Ser473)AKT-fosforylaation ja p53:n destabiloinnin, kuten kuvassa 1D esitetään. Nämä tulokset viittaavat suoraan yhteyteen AKT-aktivaation ja p53-välitteisen hermosolujen apoptoosin (kuva S1D) ja OGD/R:n jälkeen indusoidun kaspaasi-3-aktivaation (Kuva S1E) eston välillä. P53:n stabiloinnin pääsäätelijä, MDM2, on AKT:n kohde [26], joka fosforyloi MDM2:ta Ser166:ssa ja Ser186:ssa [26]. PI3K:n esto wortmanniinilla esti sekä (Ser473)AKT:n että (Ser166)MDM2:n IPC:n indusoiman fosforylaation (kuvio 2B).

IPC:n indusoima MDM2:n spesifinen Akt-välitteinen fosforylaatio Ser166:ssa varmistettiin käyttämällä pientä häiritsevää RNA:ta (siRNA), joka on erityisesti suunniteltu AKT1-proteiinia (siAkt) vastaan. Se ilmentyy voimakkaasti aivokuoren hermosoluissa ja jonka aktiivisuus on välttämätöntä hermosolujen selviytymiselle iskemian jälkeen. 38]. Kuten kuvassa 3 esitetään, siAkt alensi AKT- ja p(Ser473)AKT-proteiinin kokonaistasoja päivänä 3 transfektion jälkeen sekä HEK-293T-soluissa (kuvio 3A) että aivokuoren neuroneissa (kuvio 3B).

Lisäksi AKT-knockdown (siAkt) esti (Ser166)MDM2-fosforylaation (kuvio 3B). Nämä tulokset osoittavat, että IPC-aktivoitu PI3K/AKT-signalointireitti edistää MDM2:n fosforylaatiota Ser166:ssa, mikä saattaa olla vastuussa MDM2:n stabiloitumisesta ja siitä johtuvasta p53:n destabiloitumisesta iskeemisen vaurion jälkeen.

2.3. IPC-aktivoitu AKT laukaisee nukleaarisen MDM2-proteiinin stabiloinnin iskemian jälkeen

AKT:n aktivaatio on osallistunut MDM2:n tumaan translokaatioon kasvainsoluissa [26]. Ottaen huomioon tuman MDM2-stabiloinnin merkityksen hermosolujen eloonjäämiselle iskemian jälkeen [34] ja tarkemmin sanottuna sen hermostoa suojaavan roolin IPC:ssä [33], päätimme tutkia edelleen PI3K/AKT-signalointireitin merkitystä MDM2:n subsellulaarisen lokalisoinnin säätelyssä. proteiinia.

Siten neuronit tai HEK{0}}T-solut transfektoitiin ihmisen MDM2--merkittyllä proteiinilla (MDM2-GFP). Transfektoitujen HEK-293T-solujen edustavat blotit ja kuvat ihmisen MDM2-proteiinia ektooppisesti ekspressoivista neuroneista neljän erilaisen koetilan jälkeen (Nx, IPC, OGD/R ja IPC plus OGD/R) on esitetty kuvioissa 4A ja S1H. , vastaavasti.

MDM{0}} GFP:n ektooppinen ilmentyminen vahvisti, että IPC edistää MDM2:n tuman kertymistä verrattuna esikäsittelemättömiin iskeemisiin (OGD/R) tai normoksisiin (Nx) hermosoluihin (kuvat 4A, B), kuten tuman/sytosolin fluoresenssisuhteen kvantifiointi paljasti. (Kuva S2B) ja MDM2-GFP:n ydinfluoresenssin intensiteetti (kuva S2C).

2.4. IPC edistää p(Ser473)AKT:n ja MDM2:n vuorovaikutusta, mikä tehostaa MDM2:n stabiloitumista ytimessä ja vähentää indusoitua hermoston apoptoosia iskemian yhteydessä

Sen jälkeen kun oli osoitettu IPC:llä tehostetun PI3K/AKT-reitin aktivaation rooli MDM2:n ydinstabiloinnissa, tutkimme edelleen, olivatko p(Ser473)AKT ja MDM2 vuorovaikutuksessa ytimessä (kuvio 6A). MDM2-immunosaostus tumaproteiiniuutteista, jota seurasi immunoblottaus MDM2:ta ja p(Ser473)AKT:ta vastaan, paljasti, että IPC edisti p(Ser473)AKT:n ja MDM2:n välistä vuorovaikutusta OGD/R:n jälkeen, estäen siten OGD/R-indusoidun tuman p53:n stabiloitumisen, kuten ytimen syötössä on esitetty (kuva 6A).

Lopuksi tutkimme PI3K/AKT-reitin katkeamisen haitallista vaikutusta hermosolujen apoptoosiin (kuvio 6B). AKT:n esto vastusti IPC:n suojaavaa vaikutusta ennen OGD:tä, mikä vahvistaa AKT-MDM2:n hermoja suojaavan roolin IT:n kontekstissa. Tuloksemme osoittavat siis, että IPC indusoi AKT:n fosforylaatiota ja aktivaatiota, mikä edistää MDM2:n fosforylaatiota Ser166:ssa ja tuman translokaatiota, jossa se on vuorovaikutuksessa p(Ser473)AKT:n kanssa. Tämä mekanismi voi myötävaikuttaa MDM2:n parantuneeseen tuman stabiloitumiseen, jolla on olennainen rooli IPC-indusoidussa iskeemisessä toleranssissa.

Miten Cistanche suojaa hermosoluja?

On olemassa todisteita, jotka viittaavat siihen, että Cistanche voi suojata hermosoluja vähentämällä apoptoosia (ohjelmoitua solukuolemaa) ja edistämällä hermosolujen eloonjäämistä. Apoptoosi on luonnollinen prosessi, joka tapahtuu kehossa vaurioituneiden tai ei-toivottujen solujen poistamiseksi, mutta se voi olla haitallista, jos sitä tapahtuu liikaa tai sopimattomasti. Cistanchen on havaittu estävän apoptoosia laboratoriotutkimuksissa, ja tämä vaikutus voi auttaa suojaamaan hermosoluja vaurioilta.

Lisäksi Cistanche sisältää useita bioaktiivisia yhdisteitä, joilla on osoitettu olevan hermostoa suojaavia vaikutuksia. Se sisältää esimerkiksi ekinakosidia, jonka on osoitettu suojaavan hermosoluja oksidatiiviselta stressiltä ja tulehdukselta. Se sisältää myös akteosidia, jolla on todettu olevan anti-inflammatorisia ja antioksidanttisia ominaisuuksia.

Jatkuu...

Emilia Barrio 1,†, Rebeca Vecino 1,2,†, Irene Sánchez-Morán 1, Cristina Rodríguez 1,2,3, Alberto Suárez-Pindado 1, Juan P. Bolaños 1,2,3,4, Angeles Almeida 1, 2,3 ja Maria Delgado-Esteban 1,2,3,*

1 Institute of Functional Biology and Genomics, University of Salamanca, CSIC, 37007 Salamanca, Espanja; emibg7@gmail.com (EB); rebecavecino@usal.es (RV); irene_sm@usal.es (IS-M.); c.rodriguez@usal.es (CR); Alsuap77@gmail.com (AS-P.); jbolanos@usal.es (JPB); aaparra@usal.es (AA)

2 Salamancan biolääketieteen tutkimuslaitos, Salamancan yliopistollinen sairaala, Salamancan yliopisto, CSIC, 37007 Salamanca, Espanja

3 Biokemian ja molekyylibiologian laitos, Salamancan yliopisto, 37007 Salamanca, Espanja 4 Centro de Investigación Biomédica en Red de Fragilidad y Envejecimiento Saludable (CIBERFES), Instituto de Salud Carlos III, 28029 Madrid, Espanja} ; Puh.: plus 34-923-29-4908