Mahdolliset kyynelbiomarkkerit Parkinsonin taudin diagnosointiin – pilottitutkimusⅡ

3. Tulokset

3.1. Potilaat ja kliiniset parametrit

Maaliskuun 2019 ja lokakuun 2019 välisenä aikana tähän pilottitutkimukseen osallistui 24 iPD-potilasta, kolme oireenmukaista E46K-SNCA-mutaation kantajaa ja 27 CT-potilasta, joiden yleiset ominaisuudet on esitetty taulukossa 1. PD-potilaiden keskimääräinen sairauden kesto oli 9,36 vuotta, ja heillä oli lievä molemminpuolinen motorinen vajaatoiminta (UPDRS-pisteet) sekä Hoehn- ja Yahr-pisteet, jotka viittasivat lievästä keskivaikeaan motoriseen vajaatoimintaan. IPD-potilaille oli ominaista, että 40 prosentilla heistä oli lievä tai keskivaikea blefariitti.

3.2. nLC MS/MS-tiedot Tässä analysoiduista näytteistä tunnistettiin yhteensä 560 kyynelproteiinia aiempien kyynelten proteomisten tutkimusten perusteella, ja useita ryhmäspesifisiä kyynelproteomimuutoksia havaittiin PD-potilailla verrattuna TT:ihin. Proteiineja, joiden runsaus oli erilainen aiempien kyynelten proteomisten tutkimusten kanssa, ja useita ryhmäspesifisiä kyynelproteomimuutoksia havaittiin PD-potilailla verrattuna TT:ihin. Molemmissa ryhmissä havaittiin erilaisia ​​proteiineja, vaikka useimmat PD-potilaiden kyynelproteomin säätelemättömät proteiinit olivat yli-ilmentyneitä. STRING PPI-verkoston analyysi suoritettiin sellaisten proteiinien välisten vuorovaikutusten arvioimiseksi, jotka erosivat merkittävästi PD-potilailla ja CT-potilailla (kuva 1). Proteiinit, jotka yli-ilmennettiin PD-potilailla, osallistuivat merkittävästi odotettua enemmän yhteisvaikutuksiin, mikä osoittaa, että näiden proteiinien lisääntymisellä on jokin biologinen yhteys (kuvio 1A). Kuitenkin heikompia suhteita havaittiin niiden proteiinien välillä, joita säädeltiin alaspäin, mikä edustaa erilaistunutta klusteria (kuvio 1B). Suurin osa differentiaalisesti ilmennetyistä proteiineista voitiin lokalisoida joko solunulkoisiin tai solunsisäisiin osiin.

Jotta voitaisiin paremmin ymmärtää differentiaalisesti ekspressoituneiden proteiinien potentiaalinen rooli biologisessa kontekstissa, funktionaaliset annotaatioanalyysit suoritettiin erilaisilla geeniontologian (GO) termeillä. Tämän seurauksena sääntelemättömien proteiinien havaittiin osallistuvan erilaisiin biologisiin prosesseihin (Kuva 2): immuunivasteeseen (lipokaliini 2-LCN 2, serpiini B3-SPB3, follikulaarisen dendriittisolun erittämä peptidi - FDSCP, kadheriini - MFGM ja neutrofiilien gelatinaasi- liittyvä lipokaliini – NGAL); apoptoosi (olfaktomediini-4—OLFM4, kaspaasi-14—CASPE ja gammaglutamyylisyklotransferaasi — GGCT); tulehdus (Calprotectin-S100A8, S100A9); kollageenin hajoaminen (myeloblastinen - PRTN3 ja metalloproteinaasi 9 - MMP9); proteiinisynteesi (heterogeeninen tuman ribonukleoproteiini A3-ROA3); keratinosyyttien erilaistuminen (kalmoduliinin kaltainen proteiini 5 – CALML5); lipidien kuljetus (apolipoproteiini D-APOD, apolipoproteiini A2-APOA2 ja matalatiheyksiseen lipoproteiiniin liittyvä proteiini 2-LRP2); ja puolustus (myeloperoksidaasi – MPO, defensiini alfa 3 – DEFA 3, glutationiperoksidaasi 3 – GPX3, kitinaasi-3-kuten proteiini 2 – CH3L2 ja lysotsyymi C – LYSC).

Jos PD-potilaita tarkasteltiin kaikkia yhdessä ja erikseen iPD-potilaina ja potilaina, joilla oli E46K-SNCA-mutaatio, lisääntyneet kyynelproteiinit olivat ilmeisiä kaikissa kolmessa ryhmässä, ja niiden ilmentyminen vaihteli kussakin (kuvio 3). On huomattava, että vain kolmea potilasta, joilla oli E46K-SNCA-mutaatio, tutkittiin, ja siitä saatujen tietojen hajonta oli suurempi. Samat proteiinit ilmentyivät voimakkaammin potilaiden, joilla oli E46K-SNCA-mutaatio, kyynelissä kuin iPD-potilaiden kyynelissä. Kaikki nämä vertailut tehtiin arvoilla suhteessa CT-kyynelnäytteiden arvoihin.

Taulukossa 2 esitetään proteiinit, jotka säädeltiin ylös (kertain > 1,5) ja alasääntelyyn (kertaiseksi < 0,5) IPD-ryhmässä, jolla oli blefariitti, verrattuna IPD-potilaisiin, joilla ei ollut blefariittia. Potilaille, joilla oli E46K-SNCA-mutaatio, ei kehittynyt blefariittia.

Kyynelproteiinien joukossa, joista PD-potilailla oli säädelty, erottui kuuden proteiinin ryhmä, joista viisi yli-ilmentyi PD-ryhmässä CT:ihin verrattuna (prelamiini A/C – LMNA, katepsiini D – CATD, hapan keramidaasi – ASAH1, siirtymävaiheen endoplasminen reticulumin ATPaasi-TERA ja sytoplasminen dyneiini 1-DYHC1), kun taas yksi niistä oli alasäädelty (tripeptidyylipeptidaasi 1-TPP1: Taulukko 3). Nämä proteiinit liittyivät neurodegeneratiivisiin prosesseihin, pääasiassa muutoksiin lysosomaalisessa autofagiassa, apoptoosiin, retrogradiseen aksonikuljetukseen ja demyelinaatioprosesseihin. Oli mielenkiintoista huomata näiden proteiinien suhde lysosomaalisen toiminnan muutoksiin. Kuudesta proteiinista kolmella oli hyvä kyky luokitella PD-potilaat ja CT:t oikein, kuten ROC-käyrien AUC-arvot osoittavat, ja ne liittyivät lysosomaalisen toiminnan muutoksiin: CATD, ASAH1 ja DYHC1.

Yksimuuttujainen logistinen regressioanalyysi tunnisti neljä muuttujaa, joilla oli tilastollinen merkitsevyys=0.05: potilaiden ikä ja CATD-, ASAH1- ja DYHC1-proteiinien kerta-muutos (taulukko 4).

Lisäksi LMNA- ja DYHC1-proteiineilla havaittiin olevan tilastollinen merkitys kohdassa=0.1. Monimuuttujalogistinen regressiomalli muodostettiin ottamalla huomioon ikä ja proteiinit millä tahansa merkitsevyystasolla. Vaikka yleinen malli osoitti merkitystä vain CATD-proteiinin tapauksessa (taulukko 5), malliin oli todennäköisesti vaikuttanut saatavilla olevien näytteiden pieni määrä, ja tutkittujen näytteiden lukumäärän lisääminen saattoi tunnistaa muita merkittäviä muuttujia.

4. Keskustelu

Tässä tutkimuksessa analysoitiin proteiineja nanonestekromatografialla-massaspektrometrialla (nLC-MS/MS) ja valittiin ne, jotka liittyvät hermostoa rappeuttaviin sairauksiin, joilla oli suurempi erotuskyky tutkittujen PD- ja TC-ryhmien välillä. PD-potilaiden kyynelistä on tutkittu useita ehdokasbiomarkkereita viime vuosina; johtopäätös oli kuitenkin, että lisävalidointitutkimuksia tarvitaan parhaan ehdokas diagnostisen tai prognostisen biomarkkerin löytämiseksi tälle patologialle. PD:n diagnoosi perustuu tällä hetkellä motorisiin ja ei-motorisiin oireisiin, mukaan lukien unihäiriöt tai hajuhäiriöt. Motoriset oireet ilmaantuvat pääasiassa, kun dopaminergisten hermosolujen häviäminen on noin 50–60 prosenttia.

Klikkaa eliniän pidentämiseen Parkinsonin tautia varten

Siksi varhaisen diagnoosin saavuttaminen avaa tien muuttaa taudin kulkua ja toivottavasti viivyttää tämän patologian aiheuttamaa vakavaa vammaa. Tästä aiheesta on tullut keskeinen näkökohta PD-tutkimuksessa, vaikka validien biomarkkereiden puute onkin suuri este, joka estää potilaiden tunnistamisen prekliinisissä tai prodromaalisissa vaiheissa sekä taudin kehityksen ja hoitojen vaikutusten seurannan.

Tästä syystä tässä tutkimuksessa pyrittiin etsimään luotettavaa PD:n biomarkkeria ei-invasiivisesta nesteestä, kuten kyynelistä. Silmässä on monia hermo- ja verisuonielementtejä, joita löytyy myös aivoista, mikä tekee siitä ihanteellisen sellaisten uusien biomarkkerien löytämiseen, joita voitaisiin käyttää PD:n tai muiden hermostoa rappeuttavien sairauksien diagnosoimiseen, sekä uusien terapeuttisten kohteiden löytämiseen. Täällä kyyneleet PD- ja CT-potilailta saatiin lasikapillaarien kautta ilman aikaisempaa anestesiaa ja koskettamatta silmän pintaa. Aiemmat pilottitutkimukset potilaan kyynelistä on tehty ryhmällä potilaiden kyyneleitä [19], ja analyysimme on ensimmäinen yksittäinen kyynelanalyysi, joka mahdollistaa tiettyjen yksittäisten merkkiaineiden tunnistamisen. Käyttämällä kapillaareja kyynelnäytteiden saamiseksi vältämme koskettamasta sidekalvon epiteelia, mikä erottaa kyynelkalvon proteiinit sidekalvon proteiineista, kuten tapahtuu Schirmer-liuskoja käytettäessä. Tutkimuksessamme havaitsimme PD-potilailla merkittävästi dereguloituja proteiineja.

Nämä proteiinit osallistuvat pääasiassa tulehdus- ja neurodegeneratiivisiin prosesseihin, apoptoosiin ja immuunivasteisiin. Tulehdus esiintyy kaikkialla hermosolujen rappeutumissairauksissa, mukaan lukien PD, ja viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että syn-peräiset T-soluepitoopit tunnistetaan ensisijaisesti PD-potilailla, samoin kuin T-solut PD-kohdealueilla, mikä mahdollisesti viittaa PD:n autoimmuunikomponenttiin [20 ]. Hermosolujen uskottiin olevan suojattu autoimmuunihyökkäykseltä, mutta dopaminergiset neuronit ovat haavoittuvia, koska niiden solupinnalla on proteiineja, jotka auttavat immuunijärjestelmää tunnistamaan vieraita aineita [21]. T-solut voivat mahdollisesti erehtyä erehtymään taudin vaurioittamiin hermosoluihin vieraisiin aineisiin, ja tämän seurauksena Sulzer et ai. ehdotti mallia, jossa -syn-spesifiset T-solut aiheuttavat hermosolujen kuoleman hermostoa rappeutuvissa sairauksissa, jotka liittyvät tämän proteiinin spesifiseen väärinlaskostumiseen. Tutkimuksessamme havaittiin kyynelnäytteissä ryhmiä immuunivasteeseen liittyviä säätelemättömiä proteiineja, kuten LCN2, SPB3 ja FDSCP. Tietyt immuunivasteeseen osallistuvat immunoglobuliinit, kuten IgA2, eivät kuitenkaan osoittaneet tilastollisesti merkitseviä eroja PD-ryhmän ja CT-ryhmän välillä.

Lisätutkimuksia tarvitaan sen selvittämiseksi, liittyykö tämä immuunivasteen ja kyynelissä olevien proteiinien välinen suhde suoraan PD:hen. Neurotulehdus voidaan määritellä epäspesifiseksi tulehdustapahtumaksi aivoissa, ja koko keskushermostossa on hermo-inflammatorinen komponentti, mikä ilmenee sairauksissa, kuten multippeliskleroosissa (MS), aivojen aneurysmissa ja aivoverisuonitapauksissa, epilepsiassa, AD:ssa ja PD:ssä ja jossa ekstrasellulaarista matriisia (ECM) hajottavien entsyymien tai metalloproteaasien (MMP) aktiivisuus on osallisena. MMP:t osallistuvat moniin fysiologisiin ja patologisiin prosesseihin aivoissa ja veressä. Veri-aivoesteen (BBB) ​​muodostavat endoteelisolut, jotka erottavat aivojen verenkierron, ja sen toiminta tapahtuu kolmessa sen eheyden kannalta kriittisessä rakenteessa: aivojen kapillaarien endoteelisoluissa, tiukoissa liitoksissa (TJ:t). ) näiden solujen ja tyvikalvon välillä. Endoteeli on este pienille hydrofiilisille yhdisteille, koska TJ:t tiivistävät viereisten endoteelisolujen väliset raot, estäen liuenneiden aineiden hallitsemattoman kulkemisen näiden solujen välillä ja muuttaen aivojen endoteelin suhteellisen läpäisemättömäksi esteeksi [22,23].

Kuitenkin tyvikalvo yhdistää nämä endoteelisolut perisyytteihin ja astrosyytteihin muodostaen neurovaskulaarisen yksikön, joka helpottaa solujen välistä viestintää. Tämä kalvo on välttämätön BBB:n toiminnalle ja sellaisenaan aivojen homeostaasille ja sen yleiselle terveydelle. On ehdotettu, että MMP:t häiritsevät spesifisesti TJ:itä ja sulattavat endoteelin tyvikalvoa, mikä myötävaikuttaa tiettyihin aivosairauksiin [24]. Vaikka MMP-aktiivisuuden osoittaminen in vivo on teknisesti vaikeaa, vahvempi MMP-aktiivisuus liittyi suurempaan BBB-läpäisyyteen aivoverisuonionnettomuuden jälkeen ja reperfuusion aikana in vivo [25]. MMP-2- ja MMP-9-mRNA:n ja -aktiivisuuden lisääntymistä on kuvattu reperfuusion jälkeen hypertensiivisillä rotilla, joilla on mediaalisen aivovaltimon tukkeuma (MCAO) [26]. Lisäksi BBB-vuoto havaittiin myös näiden rottien piriformisessa aivokuoressa yhdessä TJ:iden katkeamisen kanssa, mikä osoittaa, että nämä MMP:t muuttavat BBB:n eheyttä hajottamalla TJ-proteiineja [26]. Sellaisenaan ja teknisistä haasteista huolimatta on olemassa todisteita siitä, että MMP:t sulattavat TJ- ja ECM-proteiineja in vivo.

MMP:n-1, -2 ja -9 ilmentyminen ja aktiivisuus on määritetty PD-potilaiden kuolemanjälkeisessä aivokudoksessa, ja vaikka MMP:ssä-1 ja MMP:ssä ei havaittu muutoksia -9 verrattuna samanikäisiin kontrolleihin, 50 prosentin lasku MMP-2-aktiivisuudessa oli ilmeinen PD-potilaiden SN:ssä [27]. Esitettiin, että heikompi MMP 2 -aktiivisuus voisi auttaa dopaminergisiä hermosoluja ja niiden neuriitteja selviytymään SN:ssä [27]. Lisäksi MMP:tä-3 on tutkittu myös PD:stä, joka voi mahdollisesti olla osallisena -syn:n katkaisemisessa. MMP-3 pilkkoo puhdistetun -syn:n in vitro ja -syn:n aggregaatio lisää MMP-3-aggregaattien läsnä ollessa, mikä olisi erityisen vahingollista dopaminergisille soluille PD:ssä. Merkittävää on, että MMP-1, -2 ja -9 sekä MT1-MMP pilkkoo myös puhdistetun -syn, vaikkakin vähemmän tehokkaasti kuin MMP-3 [28]. MMP-3 näyttää liittyvän dopaminergiseen hermosolujen rappeutumiseen, hermotulehdukseen ja BBB-eheyteen PD:ssä; kuitenkin tarvitaan lisätutkimuksia kaikkien näiden MMP:iden roolin selvittämiseksi PD:ssä ja voisiko niiden spesifinen esto edustaa pätevää terapeuttista strategiaa. Tässä MMP-9-tasot olivat korkeammat PD-potilaiden kyynelissä, sekä iPD-potilailla (28--kertainen) että E46K-SNCA-mutaatiota kantavien potilaiden (3--kertainen).

Jälkimmäisille PD-potilaille ei kehittynyt blefariittia, mikä viittaa siihen, että MMP{0}}-pitoisuuksien nousu ei ole yhtä vahvasti yhteydessä blefariittiin kuin PD:n patologiaan. Kuitenkin analysoimalla iPD-ryhmiä erikseen näemme, että MMP-9-yliekspressio on voimakkaampaa IPD-potilailla, joilla on blefariitti, 3,08 kertaa enemmän kuin IPD-potilailla, joilla ei ole blefariittia. Olemme aiemmin tutkineet tämän MMP:n osuutta repeytymiseen potilailla, joilla on silmän pinnan patologia [29,30]. Lisätutkimukset ovat kuitenkin tarpeen sen määrittämiseksi, liittyykö MMP:n-9 nousu suoraan PD:hen tai silmän pinnan patologioihin, jotka voivat muuttaa kyynelanalyysiä.

Todisteita kertyy energia-aineenvaihdunnan tärkeästä roolista neurodegeneratiivisissa sairauksissa, mukaan lukien PD. Epänormaaleja lipidifraktioita ja lipidiperoksidaatiota on arvioitu PD-potilailla [31], ja sen seurauksena lipidifraktioita ehdotettiin mahdollisiksi PD:n suojaaviksi biomarkkeriksi. Viimeaikaiset epidemiologiset tutkimukset mahdollisella kohortilla tai tapauskontrollisuunnitelmilla yrittivät arvioida lipidifraktioiden ja PD-riskin välisiä yhteyksiä [32–35]. Joissakin näistä tutkimuksista oli pieni otoskoko, kun taas toisissa tutkittiin vain tiettyjä lipidifraktioita, pääasiassa kolesterolia, tai niitä kontrolloitiin rajoitetun määrän mahdollisten sekaannusten varalta. Vaikka korkeampien kolesterolitasojen ja pienemmän PD-riskin välillä on havaittu johdonmukainen yhteys, taustalla olevaa syytä ei tunneta, ja on arvioitava, onko samanlaisia ​​tuloksia muiden lipidifraktioiden osalta. Tässä testatuissa kyynelnäytteissä apolipoproteiini (APO) -perheen jäsenet näyttävät olevan säädellyt, proteiiniperhe, joka liittyy moniin hermostoa rappeutuviin sairauksiin. APOE-proteiini osallistuu useisiin aivosairauksiin, mukaan lukien AD, MS, traumaattiset aivovauriot ja Creutzfeldt–Jakobin tauti [36–38], mikä lisää mahdollisuutta, että ApoE:llä voi myös olla merkittävä rooli PD:n kehittymisessä. Lisäksi korkeampia kolesterolitasoja havaittiin PD:n siirtogeenisen hiirimallin aivoissa, ja koska APO:t ovat osallisena kolesterolin homeostaasin ylläpitämisessä, APO:iden ja PD:n välillä voi olla mahdollinen yhteys [39].

Harvat tutkimukset ovat kuitenkin keskittyneet APO:iden rooliin PD: ssä. Keskushermostossa gliasolut tuottavat APO:ita, ja neuronit ottavat ne vastaan ​​käytettäväksi aksonien kasvussa ja synaptisessa aktiivisuudessa. Lisäksi ApoE:llä uskotaan olevan hermoja suojaava rooli, sillä se estää hermosolujen ja verkkokalvon ganglionsolujen (RGC) apoptoosia [40]. APO:iden ilmentymiseen ihmisen aivoissa vaikuttavat APO:n tyyppi ja yksilön ikä. Eri APO:ista ApoE, ApoD ja ApoJ ilmentyvät voimakkaimmin aivoissa. Niiden ilmentymistasot voivat kuitenkin muuttua eri elämänvaiheissa ja esimerkiksi vastasyntyneen aivoissa on 50 prosenttia enemmän ApoE:tä kuin aikuisen aivoissa, kun taas aikuisen aivoissa on noin 10 kertaa enemmän ApoD:tä ja ApoJ:tä kuin alkiossa. ApoD ilmentyy pääasiassa aivoissa, ääreishermoissa, istukassa, keuhkoissa, munasarjoissa ja pernassa [41]. Kyynelnäytteissämme ApoD näyttää yli-ilmentyneen potilailla, joilla on PD. PD-potilaiden SN:n lähellä olevissa gliasoluissa on enemmän ApoD:tä, jonka uskotaan liittyvän oksidatiiviseen stressiin, koska ApoD suojaa soluja oksidatiiviselta stressiltä ja sen lisääntynyt ilmentyminen estää lipidien peroksidaatiota [42].

Itse asiassa ApoD:n ilmentyminen aivorungossa näyttää suojaavan hermosolujen rappeutumista vastaan, ja vaurioituneissa aivoissa hermosolut eivät ilmennä ApoD:tä [41]. Siten kyynelten ApoD vaatii lisätutkimuksia PD-potilailla ja niillä, joilla on muita hermostoa rappeuttavia sairauksia, jotta voidaan arvioida, onko sillä todellinen hermostoa suojaava vaikutus tällaisissa potilaissa. Muiden tässä tutkimuksessa säätelemättömien proteiinien joukossa valittiin pieni ryhmä, koska he osallistuivat hermostoa rappeutuviin prosesseihin, erityisesti lysosomaaliseen autofagiaan tai hermosolujen kuljetukseen. Ubikitiini-proteasomireitin (UPP) on ehdotettu olevan avainrooli -syn:n hajoamisessa [43]; Kuitenkin on yhä enemmän todisteita siitä, että lysosomi voi myös välittää -syn:n hajoamista [44,45]. Huolimatta tarkasta autofagiareitistä, jota pitkin -syn tulee lysosomiin, oletetaan, että "synukleinaasi" hajottaa sen nopeasti normaaleissa olosuhteissa. Dopaminergisissä hermosoluissa vallitsee dynaaminen tasapaino -syn-proteiinin eri konformaatiomuotojen ja oligomeeristen tilojen välillä, jota moduloivat tekijät, jotka voivat kiihdyttää tai estää fibrillien aggregaatiota ja muodostumista [46]. Myrkyllisten -syn-lajien tunnistaminen ja karakterisointi on vielä kesken, ja monet tutkimukset ovat keskittyneet proteiinien aggregaation eri tiloihin.

Näillä tutkimuksilla yritettiin määrittää, vastaavatko myrkylliset lajit liukenemattomia fibrillaarisia proteiineja, joita löytyy pääasiassa LB:istä, tai päinvastoin esifibrillaarisia proteiinioligomeerejä tai protofibrillejä. On yhä enemmän todisteita in vivo ja in vitro siitä, että oligomeeriset lajit ovat patologisesti merkittävimpiä isoformeja [47, 48], ja on jopa ehdotettu, että LB:t voisivat olla suojaavia, edustaen aggressiivisen muotoa. Fysiologisissa olosuhteissa -syn on aktiivinen synapseissa ja se osallistuu prosesseihin, kuten synaptisten vesikkelien (SV:iden) muodostumiseen, kauppaan ja kytkeytymiseen. Se liittyy myös SV:n kierrätykseen ja dopamiinin varastointiin.

-syn:n fosforylaatio ja defosforylaatio johtavat tämän proteiinin aktivoitumiseen ja deaktivoitumiseen, jota myös säätelee lysosomaalinen autofagia ja ubikvitinylaation aiheuttama proteasomin hajoaminen [49]. Erilaisten ärsykkeiden aiheuttamissa patologisissa olosuhteissa -syn:ssä tapahtuu virheellinen laskostuminen, mutaatio tai fosforylaatio, joka johtaa sen aggregoitumiseen, mikä vaikuttaa lysosomaalisten rakkuloiden muodostumiseen ja kytkeytymiseen tuottamatta lysosomaalista autofagiaa ja johtaa sen kerääntymiseen dopaminergisiin neuroneihin, LB:n muodostumiseen. ja apoptoosi [49]. Tässä esitetyt tulokset osoittavat, että PD-potilaiden, sekä iPD-potilaiden että E46K-SNCA-mutaation kantajien kyynelnesteessä säätelemättömien proteiinien joukossa on kaksi lysosomaaliseen autofagiaan liittyvää proteiinia: CATD ja ASAH1. CATD on tärkeä lysosomaalinen aspartyyliproteaasi, ja mielenkiintoista kyllä, CATD:n puutos ja sen entsymaattinen inaktivaatio ihmisissä johtavat varhaiseen etenevän ja lopulta kuolemaan johtavan hermosolujen rappeutumisen alkamiseen, joka on luokiteltu yhdeksi useista hermosolujen seroidilipofuskinoosisyndroomista (NCL) [50,51]. ]. In vitro CATD tuottaa rekombinantin -syn:n osittaisen proteolyysin [52], ja CATD:n kykyä säädellä -syn:iä on arvioitu villityypin ja mutanttien dopaminergisissä soluissa viljelmässä.

Lisäksi useiden CATD-puutteisten nisäkkäiden aivoja, joilla oli NCL, tutkittiin endogeenisen -syn-prosessoinnin arvioimiseksi, ja näin ollen pääteltiin, että CATD:n entsymaattinen aktiivisuus on tärkeä rooli -syn:n metaboliassa. ASAH1-proteiini on lysosomaalinen entsyymi, joka muuttaa lysosomaalisen keramidin sfingosiiniksi. ASAH1:n esto lisää keramiditasoja vähentäen myös hapettuneen -syn:n ja ubikvitinyloidun proteiinin määrää PD-potilaista peräisin olevissa dopaminergisissa neuroneissa. Lisääntyneen ASAH1-aktiivisuuden aiheuttama keramiditasojen lasku voi myötävaikuttaa solunsisäisen -syn:n kertymiseen, koska se muuttaa lysosomaalista autofagiaa ja ehkäisee -syn:n vapautumista solunulkoiseen tilaan.

DYHC1 ja LMNA ovat kaksi muuta relevanttia proteiinia, jotka on poistettu PD-potilaiden kyynelistä. DYHC1 on proteiini, joka osallistuu organellien liikkumiseen solussa ja retrogradiseen kuljetukseen aksoneissa. Muiden neurodegeneratiivisten sairauksien joukossa se liittyy AD:hen ja PD:hen. Muutokset DYHC1:ssä aiheuttavat huonon kuljetuksen sen normaaliin synaptiseen sijaintiin ja huonon proteiinin puhdistuman, kuten lysosomaalisen proteaasikatepsiini D:n [53]. Tämä ehdotettu tapahtumasarja synnyttäisi autokatalyyttisen spiraalin, jossa prosessit, jotka johtavat aksonaalisen kuljetuksen estoon ja fosforyloidun -syn:n tuotantoon, tulevat toisiaan stimuloiviksi, mikä tarjoaa järkevän selityksen PD-potilaiden aivojuovion varhaiselle synaptiselle menetykselle. Lopuksi, LMNA-proteiinin yli-ilmentyminen PD-repäisyssä on osallisena demyelinisaatiossa, mutta tämä ei ole tähän mennessä liittynyt PD:hen [54].

Tämä on kuitenkin reitti, jota kannattaa harkita tulevissa tutkimuksissa. Tällä tutkimuksella on joitain rajoituksia, kuten mukana olevien potilaiden alhainen määrä, joten sitä tulee pitää pilottitutkimuksena ja tämä tulee ottaa huomioon tuloksia tulkittaessa. Lisäksi ehdokasproteiinit olisi validoitava, ei vain suuremmassa kohortissa, vaan myös sen tarkistamiseksi, esiintyykö niitä muissa kehon nesteissä (eli veressä tai aivo-selkäydinnesteessä). On myös tärkeää pitää mielessä, että tässä artikkelissa ehdotetut mahdolliset mekanismit ovat vain hypoteeseja, jotka olisi tarkistettava jatkotutkimuksissa. Lisäksi on huomattava, että koska tietokantahauissa otettiin huomioon kanoniset proteiinisekvenssit, proteoformeista ei saatu tietoa. Vaikka tämä saattaa rajoittaa tulosten spesifisyyttä, uskomme, että kanonisella sekvenssitasolla saadulla tiedolla on edelleen suuri arvo ja se tarjoaa arvokkaita näkemyksiä taudin molekyyliominaisuuksista.

Mahdollisuus, että tietyt proteomuodot voivat olla vastuussa annotoiduista tuloksista, tulee kuitenkin pitää mielessä dataa tulkittaessa.

5. Johtopäätökset

Tässä pilottitutkimuksessa proteominen analyysi paljasti, että PD-potilaiden, pääasiassa lysosomaaliseen toimintaan osallistuvien, kyynelissä säädeltiin tiettyjä proteiineja. Tämän tutkimuksen merkitystä hermoston rappeutumiseen liittyvien kyynelten proteiinien tunnistamisessa tulisi korostaa niiden suhteena PD-potilaisiin, joilla on aggressiivinen sairauden fenotyyppi. Koska tämä oli pilottitutkimus, tutkittiin vain rajoitettu määrä potilaita. Tutkimuksen rajoituksena on ikäero kontrolliryhmän ja PD-ryhmän välillä. Analyysi kyynelnäytteillä terveillä koehenkilöillä, joilla ei ole silmäsairauksia, on monimutkaista, koska tietyssä iässä on vaikea löytää vapaaehtoisia ilman muutoksia kyynelkalvossa. Tulevat tutkimukset suuremmilla potilasryhmillä antavat meille mahdollisuuden tunnistaa PD:n biomarkkereita, jotka auttaisivat ihanteellisesti ennustamaan tämän taudin alkamista.

Tästä huolimatta tarjoamme todisteita siitä, että yksittäisten potilaiden proteomi voidaan analysoida käyttämällä vain rajoitettua määrää kyyneleitä. Hyvällä harjoittelulla paras tapa poimia kyyneleitä proteomisia tutkimuksia varten on käyttää lasikapillaaria, jolloin vältetään solukontaminaatio, jota voi esiintyä käytettäessä Schirmerin liuskoja. Tulevissa tutkimuksissa toivomme voivamme validoida tässä esitetyt tulokset ja tunnistaa PD:n endofenotyypit kyynelproteomisen profiilin kautta, mikä voisi auttaa saavuttamaan PD:n varhaisen diagnoosin.

Viitteet

1 George, JM Synucleins. Genome Biol. 2001, 3, 1–6. [CrossRef]

2. Love, S. Dementian neuropatologinen tutkimus: Opas neurologeille. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 2005, 76 (lisäosa 5), ​​v8–14. [CrossRef]

3. Spillantini, MG; Schmidt, ML; Lee, VM-Y.; Trojanowski, JQ; Jakes, R.; Goedert, M. -Synukleiini Lewyn ruumiissa. Nature 1997, 388, 839–840. [CrossRef]

4. Atik, A.; Stewart, T.; Zhang, J. Alfa-synukleiini Parkinsonin taudin biomarkkerina. Brain Pathol. 2016, 26, 410–418. [CrossRef] [PubMed]

5. Satake, W.; Nakabayashi, Y.; Mizuta, I.; Hirota, Y.; Ito, C.; Kubo, M.; Kawaguchi, T.; Tsunoda, T.; Watanabe, M.; Takeda, A.; et ai. Genominlaajuinen assosiaatiotutkimus tunnistaa yleiset variantit neljässä lokuksessa Parkinsonin taudin geneettisiksi riskitekijöiksi. Nat. Genet. 2009, 41, 1303–1307. [CrossRef] [PubMed]

6. Polymeropoulos, MH; Higgins, JJ; Golbe, LI; Johnson, WG; Ide, SE; Di Iorio, G.; Sanges, G.; Stenroos, ES; Pho, LT; Schaffer, AA; et ai. Parkinsonin taudin geenin kartoitus kromosomiin 4q21-q23. Science 1996, 274, 1197–1199. [CrossRef] [PubMed]

7. Zarranz, JJ; Alegre, J.; Gomez-Esteban, JC; Lezcano, E.; Ros, R.; Ampuero, I.; Vidal, L.; Hoenicka, J.; Rodriguez, O.; Atarés, B.; et ai. Synukleiinin uusi mutaatio E46K aiheuttaa Parkinsonin ja Lewyn kehon dementiaa. Ann. Neurol. 2003, 55, 164–173. [CrossRef]

8. Archibald, NK; Clarke, kansanedustaja; Mosimann, UP; Burn, DJ Visuaaliset oireet Parkinsonin taudissa ja Parkinsonin taudin dementiassa. Mov. Häiriö. 2011, 26, 2387–2395. [CrossRef] [PubMed]

9. Safranow, K.; Nowacka, B.; Lubi 'nski, W.; Honczarenko, K.; Potemkowski, A. Parkinsonin taudin oftalmologiset ominaisuudet. Med Sci. Monit. 2014, 20, 2243–2249. [CrossRef] [PubMed]

10. Chesnokova, NB; Pavlenko, TA; Ugrumov, MV Silmäsairaudet Parkinsonin taudin ilmentymänä. Zhurnal Nevrologii i Psikhiatrii Imeni SS Korsakova 2017, 117, 124–131. [CrossRef] [PubMed]

11. Murueta-Goyena, A.; Del Pino, R.; Galdós, M.; Arana, B.; Acera, M.; Carmona-Abellán, M.; Fernández-Valle, T.; Tijero, B.; Lucas-Jiménez, O.; Ojeda, N.; et ai. Verkkokalvon paksuus ennustaa Parkinsonin taudin kognitiivisen heikkenemisen riskiä. Ann. Neurol. 2020, 89, 165–176. [CrossRef]

12. Nakahara, T.; Mori, A.; Kurauchi, Y.; Sakamoto, K.; Ishii, K. Neurovaskulaariset vuorovaikutukset verkkokalvossa: fysiologiset ja patologiset roolit. J. Pharmacol. Sci. 2013, 123, 79–84.3. [CrossRef]

13. Lopatina, EV; Penniyaynen, VA; Tsyrline, VA Norepinefriinin ja selektiivisten 1 -adrenoseptorisalpaajien vaikutus verkkokalvon kudoseksplantaattien kasvuun. Sonni. Exp. Biol. Med. 2012, 153, 48–50. [CrossRef] [PubMed]

14. Bowd, C.; Zangwill, LM; Weinreb, RN; Girkin, CA; Fazio, MA; Liebmann, JM; Belghith, A. Rotuiset erot spektrialueen optisen koherenssin muutosnopeudessa – mitattu vähimmäiskehän leveys ja verkkokalvon hermokuitukerroksen paksuus. Olen. J. Ophthalmol. 2018, 196, 154–164. [CrossRef] [PubMed] 15. Wisniewski, JR; Zougman, A.; Nagaraj, N.; Mann, M. Universaali näytteen valmistusmenetelmä proteomianalyysiin. Nat. Methods 2009, 6, 359–362. [CrossRef]

16. Meier, F.; Geyer, PE; Talvi, SV; Cox, J.; Mann, M. BoxCar-hankintamenetelmä mahdollistaa yhden laukauksen proteomiikan 10,000 proteiinin syvyydellä 100 minuutissa. Nat. Methods 2018, 15, 440–448.3. [CrossRef] [PubMed]

17. Tyanova, S.; Temu, T.; Sinitcyn, P.; Carlson, A.; Hein, MY; Geiger, T.; Mann, M.; Cox, J. Perseus-laskentaalusta (prote)omics-datan kattavaan analysointiin. Nat. Methods 2016, 13, 731–740. [CrossRef] [PubMed]

18. Perez-Riverol, Y.; Csordas, A.; Bai, J.; Bernal-Llinares, M.; Hewapathirana, S.; Kundu, DJ; Inuganti, A.; Griss, J.; Mayer, G.; Eisenacher, M.; et ai. PRIDE-tietokanta ja siihen liittyvät työkalut ja resurssit vuonna 2019: Kvantitointitiedon tuen parantaminen. Nucleic Acids Res. 2019, 47, D442–D450. [CrossRef]

19. Boerger, M.; Funke, S.; Leha, A.; Roser, A.-E.; Wuestemann, A.-K.; Maass, F.; Bähr, M.; Grus, F.; Lingor, P. Kyynelnesteen proteominen analyysi paljastaa sairauskohtaisia ​​malleja Parkinsonin tautia sairastavilla potilailla – pilottitutkimus. Pysäköidä. Relat. Häiriö. 2019, 63, 3–9. [CrossRef]

20. Arlehamn, CSL; Garretti, F.; Sulzer, D.; Sette, A. Mukautuvan immuunijärjestelmän roolit Parkinsonin ja Alzheimerin taudeissa. Curr. Opin. Immunol. 2019, 59, 115–120. [CrossRef]

21. Sulzer, D.; Surmeier, DJ Neuronaalinen haavoittuvuus, patogeneesi ja Parkinsonin tauti. Mov. Häiriö. 2013, 28, 715–724. [CrossRef]

22. Martin, TA; Mansel, RE; Jiang, WG NK4:n antagonistinen vaikutus HGF/SF:ään aiheutti muutoksia ihmisen verisuonten endoteelisolujen transendoteliaalisessa resistenssissä (TER) ja parasellulaarisessa läpäisevyydessä. J. Cell. Physiol. 2002, 192, 268–275. [CrossRef]

23. Zlokovic, BV Veri-aivoeste terveydessä ja kroonisissa neurodegeneratiivisissa häiriöissä. Neuron 2008, 57, 178–201. [CrossRef]

24. Feng, S.; Cen, J.; Huang, Y.; Shen, H.; Yao, L.; Wang, Y.; Chen, Z. Leukeemisten solujen erittämä matriisin metalloproteinaasi-2 ja -9 lisäävät veri-aivoesteen läpäisevyyttä häiritsemällä tiukan liitoksen proteiineja. PLoS ONE 2011, 6, e20599. [CrossRef]

25. Gu, Y.; Zheng, G.-Q.; Xu, M.; Li, Y.; Chen, X.; Zhu, W.; Tong, Y.; Chung, SK; Liu, KJ; Shen, J. Caveolin-1 säätelee typpioksidivälitteisen matriksin metalloproteinaasien aktiivisuutta ja veri-aivoesteen läpäisevyyttä fokaalisen aivoiskemian ja reperfuusiovaurion yhteydessä. J. Neurochem. 2011, 120, 147–156. [CrossRef] [PubMed]

26. Yang, Y.; Estrada, EY; Thompson, JF; Liu, W.; Rosenberg, GA Matriisimetalliproteinaasi-välitteinen tiukan liitoksen proteiinien häiriintyminen aivoverisuonissa on päinvastainen synteettisellä matriisin metalloproteinaasin estäjällä rotan fokaalisen iskemian yhteydessä. J. Cereb. Blood Flow Metab. 2007, 27, 697–709. [CrossRef] [PubMed]

27. Lorenzl, S.; Albers, DS; Narr, S.; Chirichigno, J.; Beal, M. MMP-2, MMP-9 ja MMP-1 sekä niiden endogeenisten vastasäätelijöiden TIMP-1 ja TIMP-2 ilmentyminen Parkinsonin taudin kuolemanjälkeisessä aivokudoksessa Sairaus. Exp. Neurol. 2002, 178, 13–20. [CrossRef] [PubMed]

28. Kim, ST; Kim, E.-M.; Choi, JH; Poika, HJ; Ji, IJ; Joh, TH; Chung, SJ; Hwang, O. Matriisin metalloproteinaasi-3 edistää nigraalisten dopaminergisten hermosolujen haavoittuvuutta. Neurochem. Int. 2010, 56, 161–167. [CrossRef]

29. Acera, A.; Vecino, E.; Duran, JA Tear MMP-9 -tasot silmän pinnan tulehduksen merkkinä sidekalvontulehduksessa. Tutki. Opthalmol. Vis. Sci. 2013, 54, 8285–8291. [CrossRef]

30. Recalde, JI; Duran, JA; Rodriguez-Agirretxe, I.; Soria, J.; Sanchez-Tena, MA; Pereiro, X.; Suarez, T.; Acera, A. Muutokset kyynelten biomarkkeritasoissa keratoconuksessa sarveiskalvon kollageenin silloittumisen jälkeen. Mol. Vis. 2019, 25, 12–21. [PubMed]

31. Dexter, DT; Carter, CJ; Wells, FR; Javoy-Agid, F.; Agid, Y.; Lees, A.; Jenner, P.; Marsden, CD Peruslipidiperoksidaatio Substantia Nigrassa lisääntyy Parkinsonin taudissa. J. Neurochem. 1989, 52, 381-389. [CrossRef] [PubMed]

32. Huang, X.; Abbott, RD; Petrovitsh, H.; Mailman, RB; Ross, GW Matala LDL-kolesteroli ja lisääntynyt Parkinsonin taudin riski: Mahdolliset tulokset Honolulu-Asia Aging Study -tutkimuksesta. Mov. Häiriö. 2008, 23, 1013–1018. [CrossRef] [PubMed]

33. Huang, X.; Alonso, A.; Guo, X.; Umbach, DM; Liechtenstein, ML; Ballantyne, CM; Mailman, R.; Mosley, TH; Chen, H. Statiinit, plasman kolesteroli ja Parkinsonin taudin riski: Prospektiivinen tutkimus. Mov. Häiriö. 2015, 30, 552–559. [CrossRef]

34. Ma, VR; Gurevich, T.; Giladi, N.; El-Ad, B.; Tsamir, J.; Hemo, B.; Peretz, C. Korkeampi seerumin kolesteroli ja vähentynyt Parkinsonin taudin riski: statiiniton kohorttitutkimus. Mov. Häiriö. 2018, 33, 1298–1305.

35. Zhang, L.; Wang, X.; Wang, M.; Sterling, NW; Du, G.; Lewis, MM; Yao, T.; Mailman, RB; Li, R.; Huang, X. Verenkierron kolesterolitasot voivat liittyä Parkinsonin riskiin vaikuttaviin tekijöihin. Edessä. Neurol. 2017, 8, 501. [CrossRef]

36. Tamam, Y.; Tasdemir, N.; Yalman, M.; Tamam, B. Apolipoproteiini E -genotyyppien yhdistäminen multippeliskleroosin ennusteen kanssa. euroa Rev. Med. Pharmacol. Sci. 2011, 15, 1122–1130.

37. Ponsford, J.; McLaren, A.; Schönberger, M.; Burke, R.; Rudzki, D.; Olver, J.; Ponsford, M. Apolipoproteiini E:n ja traumaattisen aivovaurion vakavuuden ja toiminnallisen tuloksen välinen yhteys kuntoutusnäytteessä. J. Neurotrauma 2011, 28, 1683–1692. [CrossRef]

38. Amouyel, P.; Ranskan tutkimusryhmä ihmisen spongiformisten enkefalopatioiden epidemiologiasta; Vidal, O.; Laplanche, J.-L.; Launay, J. Apolipoproteiini E -alleelit tärkeimpinä herkkyystekijöinä Creutzfeldt-Jakobin taudille. Lancet 1994, 344, 1315–1318. [CrossRef]

39. Koob, AO; Ubhi, K.; Paulsson, JF; Kelly, J.; Rockenstein, E.; Mante, M.; Adame, A.; Masliah, E. Lovastatiini parantaa synucleiinin kertymistä ja hapettumista siirtogeenisissä hiirimalleissa -synukleinopatioiden. Exp. Neurol. 2010, 221, 267–274. [CrossRef]

40. Hayashi, H.; Campenot, RB; Vance, DE; Vance, JE Apolipoproteiini E:tä sisältävät lipoproteiinit suojaavat neuroneja apoptoosilta signaalireitin kautta, johon liittyy matalatiheyksinen lipoproteiinireseptoriin liittyvä proteiini-1. J. Neurosci. 2007, 27, 1933–1941. [CrossRef]

41. Navarro, A.; Mendez, E.; Diaz, C.; del Valle, E.; Martinez-Pinilla, E.; Ordonez, C.; Tolivia, J. Apolipoproteiini D:n elinikäinen ilmentyminen ihmisen aivorungossa: Korrelaatio vähentyneen ikääntymiseen liittyvän neurodegeneraation kanssa. PLoS ONE 2013, 8, e77852. [CrossRef] [PubMed]

42. Elliott, DA; Weickert, CS; Garner, B. Apolipoproteiinit aivoissa: vaikutukset neurologisiin ja psykiatrisiin häiriöihin. Clin. Lipidol. 2010, 5, 555–573. [CrossRef] [PubMed]

43. Leroy, E.; Anastasopoulos, D.; Konitsiotis, S.; Lavedan, C.; Polymeropoulos, MH Parkin-geenin deleetiot ja geneettinen heterogeenisyys kreikkalaisessa perheessä, jossa Parkinsonin tauti on alkanut varhain. Hyräillä. Genet. 1998, 103, 424–427. [CrossRef] [PubMed]

44. Shin, Y.; Klucken, J.; Patterson, C.; Hyman, BT; McLean, PJ Hsp70--vuorovaikutteisen proteiinin (CHIP) yhteischaperonikarboksyylipää välittää alfa-synukleiinin hajoamispäätöksiä proteasomaalisten ja lysosomaalisten reittien välillä. J. Biol. Chem. 2005, 280, 23727–23734. [CrossRef] [PubMed]

45. Webb, JL; Ravikumar, B.; Atkins, J.; Skepper, JN; Rubinsztein, DC Alfa-synukleiinia hajottaa sekä autofagia että proteasomi. J. Biol. Chem. 2003, 278, 25009–25013. [CrossRef]

46. ​​Dehay, B.; Bourdenx, M.; Gorry, P.; Przedborski, S.; Vila, M.; Hunot, S.; Singleton, A.; Olanow, CW; Kauppias, KM; Bezard, E.; et ai. Alfa-synukleiinin kohdistaminen Parkinsonin taudin hoitoon: mekaaniset ja terapeuttiset näkökohdat. Lancet Neurol. 2015, 14, 855–866. [CrossRef] 47. Bengoa-Vergniory, N.; Roberts, RF; Wade-Martins, R.; Alegre-Abarrategui, J. Alfa-synukleiinioligomeerit: Uusi toivo. Acta Neuropathol. 2017, 134, 819–838. [CrossRef]

48. Rockenstein, E.; Nuber, S.; Overk, CR; Ubhi, K.; Mante, M.; Patrick, C.; Adame, A.; Trejo-Morales, M.; Gerez, J.; Picotti, P.; et ai. Oligomeerialttiisen alfa-synukleiinin kertyminen pahentaa synaptista ja hermosolujen rappeutumista in vivo. Brain 2014, 137, 1496–1513. [CrossRef]

49. Datta, I.; Ganapathy, K.; Razdan, R.; Bhonde, R. Astrosyyttien sijainti ja lukumäärä määrittävät dopaminergisten neuronien eloonjäämisen ja toiminnan 6-OHDA-stressin välittämän differentiaalisen BDNF-vapautuksen alaisina. Mol. Neurobiol. 2017, 55, 5505–5525. [CrossRef]

50. Partanen, S.; Haapanen, A.; Kielar, C.; Pontikis, C.; Alexander, N.; Inkinen, T.; Saftig, P.; Gillingwater, TH; Cooper, JD; Tyynela, J. Synaptiset muutokset katepsiini-D-puutteisten hiirten talamokortikaalisessa järjestelmässä: Ihmisen synnynnäisen hermosolujen seroidi-lipofuskinoosin malli. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 2008, 67, 16–29. [CrossRef]

51. Siintola, E.; Partanen, S.; Stromme, P.; Haapanen, A.; Haltia, M.; Maehlen, J.; Lehesjoki, AE; Tyynela, J. Katepsiini D:n puutos on synnynnäisen ihmisen hermosolujen seroidilipofuskinoosin taustalla. Brain 2006, 129, 1438–1445. [CrossRef] [PubMed]

52. Cullen, V.; Lindfors, M.; Ng, J.; Paetau, A.; Swinton, E.; Kolodziej, P.; Boston, H.; Saftig, P.; Woulfe, J.; Feany, MB; et ai. Katepsiini D:n ilmentymistaso vaikuttaa alfa-synukleiinin prosessointiin, aggregaatioon ja toksisuuteen in vivo. Mol. Brain 2009, 2, 5. [CrossRef] [PubMed]

53. Chu, J.; Thomas, LM; Watkins, SC; Franchi, L.; Nunez, G.; Salter, RD Kolesteroliriippuvaiset sytolysiinit indusoivat kypsän IL-1beetan nopean vapautumisen hiiren makrofageista NLRP3-tulehdus- ja katepsiini B -riippuvaisella tavalla. J. Leukoc. Biol. 2009, 86, 1227–1238. [CrossRef]

54. Padiath, QS; Fu, YH Laminin B1 päällekkäisyyksien aiheuttama autosomaalinen dominantinen leukodystrofia kliininen ja molekyylitapaustutkimus muuttuneesta ydintoiminnasta ja taudista. Menetelmät Cell Biol. 2010, 98, 337–357.

lisätietoja:ali.ma@wecistanche.com