Fytokemiallinen analyysi, in vitro antiproliferatiivinen, antioksidantti, osa 2

Ota yhteyttäoscar.xiao@wecistanche.comLisätietoja

a-glukosidaasia estävä määritys

Fraktioista tehtiin laimennussarja, jolloin saatiin pitoisuudet 100, 200, 300, 400 ja 500 mg/ml. Reaktioseokset sisälsivät 0,1 ml 1 U/ml -glukosidaasiliuosta sekoitettuna 0,2 ml:aan uutelaimennosta ja 0,5 ml:aan 100 mM fosfaattipuskuria, pH 6,8. Seoksia inkuboitiin 37 asteessa 15 minuuttia. Sitten 0,2 ml 5 mM p-nitrofenyyliä-D-galaktopyranosidiPNPG:tä lisättiin reaktioseokseen, ja inkubaatiota jatkettiin vielä 2 0 min 37 asteessa. Reaktio lopetettiin lisäämällä 0,1 M NazC03:a. Absorbanssi rekisteröitiin aallonpituudella 405 nm kaikille näytteille. Akarboosia käytettiin positiivisena kontrollina samoissa pitoisuuksissa kuin kasviuutteita. Tulokset ilmaistiin eston prosentteina seuraavan yhtälön mukaisesti:

missä Ag on absorbanssi ilman entsyymi-inhibiittoria ja As on absorbanssi entsyymi-inhibiittorin läsnä ollessa [26].

Solulinjat ja MTS-määritys

HeLa- ja MCF7-syöpäsolulinjat saatiin ATCC:ltä, soluja viljeltiin RPMI-1640-elatusaineessa, johon oli lisätty 10 prosenttia naudan sikiön seerumia, 1 prosenttia penisilliini/streptomysiini-antibiootteja ja 1 prosenttia L-glutamiinia. Soluja kasvatettiin kostutetussa ilmakehässä 5 prosentin CO2:lla 37 asteessa. Solut kylvettiin 2,6 x 10* solua/kuoppa 96-kuoppalevylle. 48 tunnin kuluttua solut olivat konfluentteja, väliaine vaihdettiin. Sitten soluja inkuboitiin eri lehtifraktiopitoisuuksilla välillä 0.25-10 mg/ml R. rothschildianus -bakteeria 24 tuntia. Solujen elinkelpoisuus arvioitiin

CellTilter 96° Aqueous One Solution Cell Proliferation (MTS) -määrityksellä valmistajan ohjeiden mukaisesti (Promega Corporation, Madison, WI). Lyhyesti, käsittelyn lopussa kuhunkin kuoppaan lisättiin 20 ul MTS-liuosta 100 ul:aa elatusainetta kohti ja inkuboitiin 37 asteessa 2 tuntia. Absorbanssit mitattiin 490 nm:ssä [27,28].

Napsauta tätä saadaksesi lisätietoja

Tilastollinen analyysi

Kaikki neljän tutkitun kasvifraktion saadut tulokset (antioksidantti, antilipaasi,anti-amylaasi, antiglykosidaasi, jasytotoksisuusaktiivisuudet) ilmaistiin keskiarvona ± SD standardipoikkeama; tulosta pidettiin merkitsevänä, kun p-arvo oli<0.05. data="" were="" compared="" using="" unpaired="">

Tulokset

Fytokemiallinen seulonta

R. rothschildianus -bakteerin vesipitoisten fraktioiden alustavien fytokemiallisten testien tulokset osoittivat saponiinin, fenolien, proteiinin, tärkkelyksen ja flavonoidien läsnäolon. Metanoliuutteessa havaittiin monimutkaisia ​​polysakkarideja, fenoleja, proteiineja ja flavonoideja, kun taas asetonifraktiossa havaittiin fenoleja, tanniineja ja flavonoideja ja heksaanifraktiossa fenoleja, tanniineja ja flavonoideja, glykosideja, terpenoideja ja steroideja. Kuten on esitetty taulukossa 1. Uuttoprosessissa metanoli osoitti kuitenkin suurinta saantoa 29,4 prosentilla, jota seurasi asetonifraktio 16,5 prosentilla. Vesiuutto tuotti 10,6 prosenttia, kun taas pienin saanto (7,3 prosenttia) oli heksaanifraktiolla (taulukko 2).

TPC:n, TFC:n ja TTC:n kvantitatiivinen analyysi TPC:n, TFC:n ja TTC:n arviointia varten saatiin useiden gallushapon, rutiinihapon ja katekiinistandardien (STD:n) pitoisuuksien absorptioarvot (Abs) ja näiden kohtien osalta. , saatiin kolme yhtälöä kullekin STD:lle verrattuna sen pitoisuuksiin heksaanin, asetonin, metanolin ja vesipitoisen R:n kokonaisfenoli-, flavonoidi- ja tanniinipitoisuuksien laskemiseksi. Rothschild-diagnoosin fraktiot on esitetty taulukossa 3.

Cistanche voi parantaa immuniteettia

Antioksidanttiaktiivisuus

R. rothschildianus -lehdistä peräisin olevan neljän fraktion vapaiden radikaalien sieppausaktiivisuuden arvioinnin tulokset käyttäen Troloxia tehokkaana antioksidanttistandardin vertailuaineena ilmaistiin prosentuaalisena DPPH-inhibitioina (kuvio 1 ja taulukko 4). Siksi R. rothschildianus -lehtiä voidaan pitää antioksidanttien ja asetonifraktion kasviperäisenä lähteenä, jonka ICso-arvo oli 6,3±0,4 ug/ml. Samanlaiset tulokset saatiin myös heksaanifraktiolle, jonka ICso-arvo oli 7,9 ± 1,3 ug/ml (taulukko 4). Tuloksia verrattiin Troloxiin, joka on voimakas antioksidanttiyhdiste, jonka arvo on myös 3,1±0,9 ug/ml. Sitä vastoin vesifraktiolla oli vain kohtalaista antioksidanttiaktiivisuutta, korkeamman ICso-arvon ollessa 19,9±0,7 ug/ml, kun taas metanoliuute oli inaktiivinen tässä määrityksessä.

Lipaasia estävä aktiivisuus

Tässä määrityksessä verrattiin R. rothschildianus -lehtiuutteen fraktioiden liikalihavuuden vastaista aktiivisuutta

orlistaatti, voimakas lipaasia estävä aine (kuvio 2 ja taulukko 4).R. rothschildianus-lehdet olivat erinomainen vaihtoehtoinen luonnollinen lipaasia estävien aineiden lähde. Asetonifraktion ICso-arvo oli 26,3±0,6 ug/ml, mikä oli hyvin lähellä vertailuyhdisteen orlistaatin arvoa (12,3±0,3 ug/ml). Heksaani- ja metanolifraktiot kirjasivat vain kohtalaisia ​​ICso-arvoja, jotka olivat 39,8±0,3 ug/ml ja 60,3±0,4 ug/ml; kun vesifraktio oli inaktiivinen.

a-amylaasia estävä aktiivisuus

Tässä määrityksessä verrattiin R. rothschildianus -lehtiuutteen fraktioiden anti-amylaasiaktiivisuutta akarboosin, tehokkaan a-amylaasia estävän aineen, aktiivisuuteen (kuvio 3). Asetonifraktio oli tehokkain -amylaasin estäjä, jonka ICso oli 190±0,7 ug/ml, verrattuna vertailuyhdisteen akarboosin 28,8 ± 1,2 ug/ml:aan. Tämä viittasi siihen, että R. rothschildianus voisi olla tehokas kasviperäinen lääke diabetekseen. Vesipitoinen fraktio osoitti vain kohtalaista aktiivisuutta tässä määrityksessä ICso-arvon ollessa 45,7±0,3 ug/ml, kun taas heksaanin ICso-arvo oli 354,8±1,2 ug/ml. Metanolifraktio oli inaktiivinen -amylaasientsyymiä vastaan. myös arvot laskettiin neljälle fraktiolle (taulukko 4).

a-glukosidaasia estävä aktiivisuus

Tuloksia a-glukosidaasille verrattiin akarboosin, voimakkaan entsyymejä estävän aineen, tuloksiin, ja myös arvot laskettiin neljälle fraktiolle (taulukko 4 ja kuvio 4). Asetonifraktiolla oli suurin estävä vaikutus -glukosidaasia ICso-arvolla 54,9±0,3 ug/ml verrattuna vertailuyhdisteen akarboosin vastaavaan arvoon 37,1±{{10}. },3 ug/ml. Sitä vastoin metanoliuutefraktio osoitti vain kohtalaista -glukosidaasin inhibitiota ICso:lla 251,2 ± 0,4 ug/ml, kun taas heksaani- ja vesifraktiot olivat inaktiivisia tässä määrityksessä.

Antiproliferatiivinen aktiivisuus

HeLa- ja MCF7-syöpäsolujen käsittelyn tulokset viidellä eri pitoisuudella mg/ml eri uutteilla osoittivat, että aktiivisuus HeLa-syöpäsolulinjaa vastaan ​​oli parempi kuin MCF7-syöpäsolulinjaa vastaan. Heksaaniuute oli kuitenkin tehokkain

uute pitoisuudella 4 mg/ml estoprosentilla 98,9 ja 97,4 prosenttia HeLa- ja MCF7-syöpäsolulinjoja vastaan, vastaavasti, kun taas metanoliuute samassa pitoisuudessa osoitti voimakasta aktiivisuutta HeLa- ja MCF7-syöpäsolulinjoja vastaan ​​97,2- ja 95,6-prosenttisilla estoprosentteilla. HeLa-soluprosentin esto R. rothschildianus -lehdistä peräisin oleville fraktioille altistuessa dokumentoitiin verrattuna positiiviseen kontrolliin doksorubisiiniin (kuvio 5a). MCF7-solujen prosentuaalinen inhibitio määritettiin samalla tavalla neljälle fraktiolle R. rothschildianus -lehdistä verrattuna kontrolliin (kuvio 5b).

Keskustelu

DPPH-radikaalinpoistomääritys tunnetaan hyvin yksinkertaisena menetelmänä yhdisteiden antioksidanttikapasiteetin havaitsemiseksi. DPPH on vakaa vapaa radikaali, joka antaa alkoholiliuoksille purppuranvärisen värin ja muuttaa liuoksen värittömäksi vetyä luovuttavien antioksidanttien läsnä ollessa pelkistyessään [29]. Siksi R. rothschildianus -lehtiä voidaan pitää luonnollisena antioksidanttien lähteenä, erityisesti asetonifraktiolle, jonka ICso-arvo oli 6,3±0,4 ug/ml. Samanlaiset tulokset saatiin myös heksaanifraktiolle, jonka ICso-arvo oli 7,9 ± 1,3 ug/ml (taulukko 4). Tuloksia verrattiin Troloxiin, joka on voimakas antioksidanttiyhdiste, jonka arvo on myös 3,1±0,9 ug/ml. Sitä vastoin vesifraktiolla oli vain kohtalaista antioksidanttiaktiivisuutta korkeamman ICso-arvon ollessa 19,9±0,7 ug/ml, kun taas metanoliuute oli inaktiivinen tässä määrityksessä. Nämä tulokset olivat yhdenmukaisia ​​fenolien ja flavonoidien läsnäolon kanssa kasveissa, jotka ovat voimakas vapaiden radikaalien lähde, kuten tässä tutkimuksessa DPPH osoittaa. Nämä tulokset olivat sopusoinnussa kasveissa olevien fenoliyhdisteiden, yksinkertaisten fenolien, kuten gallushapon, ja kehittyneempien fenolihappojen, kuten antosyaanien, hydroksyylikanelihappojohdannaisten ja flavonoidien, kanssa. Kaikki nämä yhdisteluokat ovat saaneet laajaa huomiota monien fysiologisten toimintojensa vuoksi, erityisesti vapaita radikaaleja poistavan, mutageenisen, anti-inflammatorisen ja karsinogeenisen toiminnan vuoksi [30]. Kuten taulukossa 3 on lueteltu, asetoniuute kirjasi korkeimman pitoisuuden sekä fenoliyhdisteitä että flavonoideja, 28,2 ± 0,8 mg GAE/g ja 107,3 ​​± 4,6 mg RU/g, vastaavasti. Joitakin Rumex-lajeja koskevassa aikaisemmassa raportissa Rumex vicarious L.:n lehtien etanoliuutteesta löytyi fenoliyhdisteitä, jotka mahdollisesti osallistuivat vapaiden radikaalien reaktioihin, jolloin stabiili käytetty DPPH-radikaali muuttui kellertäväksi difenyylipikryylihydratsiinijohdannaiseksi alkuperäisestä violetista. väri [31].

R. rothschildianus leaves were an excellent alternative natural source of lipase inhibitory agents. The acetone fraction showed an ICso value of 26.3±0.6μg/ml, which was very close to that of the reference compound orlistat （12.3±0.3μg/ml）. Hexane and methanol fractions only re-corded moderate ICso values, equal to 39.8±0.3 μg/ml and 60.3±0.4μg/ml, respectively; while the aqueous fraction was inactive. Pancreatic lipase is a major enzyme involved in enterocyte triglyceride absorption. Therefore, its inhibition represents an important strategy in the management of obesity [32]. Plants rich in phenolic compounds have been screened in several reports for anti-lipase activity. Lipase inhibitory activity ranging from 40 to >70 prosenttia on löydetty in vitro -testeillä monissa eri perheissä, mukaan lukien Solanaceae (Solanum tuberosum), Brassicaceae (Brassica nigra ja Raphanus sativus), Rosaceae (Malus Domestica Borkh. ja Filipendula ulmaria (L.) Maxim.),

(Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng. ja Ericaceae Vaccinium myrtillus L.) ja Fabaceae (Pisum sativum L. ja Phaseolus vulgaris L.)[33].

Asetonifraktio oli tehokkain -amylaasin estäjä, jonka ICso oli 190±0,7 ug/ml, verrattuna vertailuyhdisteen akarboosin 28,8 ± 1,2 ug/ml:aan. Tämä viittasi siihen, että R. rothschildianus voisi olla tehokas kasviperäinen lääke diabetekseen. Vesipitoinen fraktio osoitti vain kohtalaista aktiivisuutta tässä määrityksessä ICso-arvon ollessa 45,7±0,3 ug/ml, kun taas heksaanin ICso-arvo oli 354,8±1,2 ug/ml. Metanolifraktio oli inaktiivinen -amylaasia vastaan. Mahdollinen selitys sille, että vesipitoinen fraktio on hyvä entsyymi-inhibiittori, oli saponiinien läsnäolo. Aiemmat tieteelliset tutkimukset ovat osoittaneet, että saponiinit olivat bioaktiivisia diabetesta vastaan ​​[34]. Asetoniuutefraktion voimakas vaikutus amylaasia vastaan ​​saattaa johtua sekä fenoliyhdisteiden että flavonoidien korkeasta pitoisuudesta. Corchorus olitorius -asiantuntijat -amylaasia ja -glukosidaasia estävät vaikutukset johtuvat aineosista, erityisesti fenoliyhdisteistä, kuten kahvihaposta [35].

Asetonifraktiolla oli suurin estävä vaikutus a-glukosidaasia ICso:lla 54,9±0,3 ug/ml verrattuna akarboosin, vertailuyhdisteen, 37,1±0,3 ug/ml. . Sitä vastoin metanolin uutefraktio osoitti vain kohtalaista a-glukosidaasin inhibitiota ICso:lla 251,2±0,4 ug/ml, kun taas heksaani- ja vesifraktiot olivat inaktiivisia tässä määrityksessä. Kolmanteen oraalisten hypoglykeemisten aineiden luokkaan kuuluvat -glukosidaasi-inhibiittorit. On olemassa erilaisia ​​-glukosidaasin estäjiä, kuten akarboosi ja vogliboosi, joita yleensä löytyy kasvilähteistä. Ne osoittavat arvokasta verensokeritasojen stabilointia aterian jälkeen, ja niitä on käytetty kliinisesti diabetes mellituksen hoidossa [36, 37].

Molempien syöpäsolujen (HeLa ja MCF7) käsittelyn tulokset eri pitoisuuksilla mg/ml eri uutteille osoittivat, että yleinen aktiivisuus HeLa-syöpäsolulinjaa vastaan ​​oli parempi kuin MCF7-syöpäsolulinjan. Heksaaniuute osoitti voimakasta syövänvastaista aktiivisuutta 4 mg/ml:n pitoisuudella ja estoprosentit 98,9 ja 97,4 prosenttia HeLa- ja MCF7-syöpäsolulinjoja vastaan, vastaavasti, kun taas metanoliuute samassa pitoisuudessa osoitti voimakasta aktiivisuutta HeLa- ja MCF7-syöpäsolulinjoja vastaan ​​97,2:lla. ja 95,6 prosentin estoprosentti. Edellisistä tuloksista heksaanifraktiolla oli merkittävä sytotoksinen vaikutus sekä HeLa- että MCF7-soluihin, ja estoprosentit saavuttivat 99 ja 92,4 prosenttia 4 mg/ml heksaanifraktiokonsentraatiolla, vastaavasti. Tämä oli yhdenmukainen sekä terpenoidien että steroidien sytotoksisten vaikutusten kanssa, joita löydettiin heksaanifraktiosta. Diosgeniini, luonnossa esiintyvä steroidi ja triterpenoidi, jota löytyy joistakin kasveista, on osoitettu estävän rintasyöpää [38, 39].

Johtopäätös

Tämän R. rothschildianus -lehdillä tehdyn tutkimuksen tulokset osoittivat, että asetoniuutefraktiolla oli merkittävää potentiaalia tarjota fytoterapiaa diabetekselle ja liikalihavuudelle, mikä perustuu sen tehokkaaseen lipaasin, a-amylaasin ja a-glukosidaasin estoon. Lisäksi asetonifraktiolla oli myös merkittävää vapaita radikaaleja poistavaa aktiivisuutta. Toisaalta heksaanifraktio osoitti merkittävää sekä HeLa- että MCF7-solulinjojen estoa, mikä saattaa liittyä sen korkeaan terpeeni- ja steroidipitoisuuteen. Nämä havainnot tässä tutkimuksessa saattavat johtaa lisätutkimuksiin in vivo uusien luonnollisten farmaseuttisten formulaatioiden kehittämiseksi, jotka ovat tehokkaita liikalihavuuden, diabeteksen ja joidenkin syöpien hoidossa.

Tämä artikkeli on poimittu julkaisusta Jaradat et ai. BMC Complementary Medicine and Therapies (2021) 21:107