Floretiini estää neurotulehdusta autofagiavälitteisellä Nrf2-aktivaatiolla makrofageissa

Ottaa yhteyttä:tina.xiang@wecistanche.com

Abstrakti

Tausta: Makrofageilla on kaksinkertainen rooli hermotulehdussairauksissa, kuten multippeliskleroosissa (MS). Ne osallistuvat leesion alkamiseen ja etenemiseen, mutta voivat myös edistää vaurion paranemistatulehdusja vaurioituneen kudoksen korjaaminen. Tässä tutkimuksessa tutkimme, jos ja mitenfloretiiniflavonoidi, jota on runsaasti omenoissa ja mansikoissa, alentaa makrofagien tulehduksellista fenotyyppiä ja estäähermoston tulehdus.

menetelmät: Transkription muutokset hiiren luuytimestä peräisin olevissa makrofageissa floretiinille altistumisen yhteydessä arvioitiin bulkki-RNA-sekvensoinnilla. Taustalla olevat tulehdukseen, oksidatiiviseen stressivasteeseen ja autofagiaan liittyvät reitit validoitiin kvantitatiivisella PCR-, fluoresenssi- ja absorbanssimäärityksillä, ydintekijän erytroidiin 2- liittyvällä tekijä 2:lla (Nrf2) knockout-hiirillä, Western blotilla ja immunofluoresenssilla. Kokeellista autoimmuunisen enkefalomyeliitti (EAE) -mallia käytettiin tutkimaan floretiinin vaikutusta hermotulehdukseen in vivo ja vahvistamaan taustalla olevat mekanismit.

Tulokset: Osoitamme, että floretiini vähentää makrofagien tulehduksellista fenotyyppiä ja vähentää merkittävästi hermotulehdusta EAE:ssä. Floretiini välittää vaikutustaan ​​aktivoimalla Nr2-signalointireitin. Nrf2-aktivaation katsottiin johtuvan 5'AMP-aktivoidusta proteiinikinaasista (AMPK) riippuvaisesta autofagian aktivoinnista ja sitä seuranneesta kelch-kaltaisesta ECH:hen liittyvästä proteiini 1:n (Keap1) hajoamisesta.

Johtopäätökset: Tämä tutkimus avaa tulevaisuuden näkymiä floretiinille terapeuttisena strategiana hermoston tulehdussairauksissa, kuten MS-taudissa.

Kokeilun rekisteröinti: Ei sovellettavissa.

Avainsanat: Floretiini, makrofagit, neurotulehdus, MS-tauti, autoimmuniteetti

Napsauta tätä saadaksesi lisätietoja

Tausta

Aktiivisille multippeliskleroosin (MS) vaurioille on tunnusomaista useiden vaurioiden esiintyminenmakrofagit[1-5]. Varhaiset tutkimukset osoittivat, että makrofagit omaksuvat tulehdusta edistävän fenotyypin MS-leesioissa, mikä edistäähermoston tulehdus, demyelinaatio ja hermoston rappeuma. Tautia edistäviin efektoritoimintoihin kuuluvat keskushermostoperäisten antigeenien esittely autoreaktiivisille T-soluille ja tulehdusvälittäjien, kuten tulehdusta edistävien sytokiinien, reaktiivisten happiyhdisteiden (ROS) ja typpioksidin (NO) tuotanto. 6,7]. Äskettäin havaittiin, että makrofageilla on myös hyödyllisiä toimintoja MS-leesioissa, koska ne voivat muuttaa fenotyyppinsä sellaiseksi, joka tyypillisesti liittyy immunosuppressioon ja keskushermoston korjaukseen. Tälle suojaavalle fenotyypille on ominaista tulehdusta edistävien välittäjien tuotannon väheneminen, anti-inflammatoristen välittäjien ja kasvutekijöiden tuotanto sekä antioksidanttireittien, kuten ydintekijän erytroidin 2- liittyvän tekijä 2 (Nrf2) -reitin, aktivoituminen. [8-14]. Koska makrofagien tulehdustila on yhdistetty MS-taudin etenemiseen ja kroonisten aktiivisten leesioiden kehittymiseen, makrofagien ohjaamista hyödylliseen fenotyyppiin pidetään lupaavana strategiana MS-taudin etenemisen rajoittamiseksi [15].

Ruokavalion komponentit edistävät makrofagien toimintaa ja hermoston tulehdusta [16]. Erityisesti flavonoidiperheen tunnustetaan yhä enemmän sisältävän lupaavia yhdisteitä, jotka vaikuttavat patogeenisiin reitteihin ja moduloivat immuunisolujen, kuten makrofagien, fenotyyppiä[17,18]. Flavonoidit muodostavat yhden suurimmista kasviravinneperheistä, jotka sisältävät yli 8000 fenoliyhdistettä, joilla on monipuolinen bioaktiivisuus. Useilla flavonoidiperheen jäsenillä on anti-inflammatorisia ja antioksidanttisia vaikutuksia makrofageihin [19-21]. Flavonoidi floretiini on dihydrokalkonien jäsen ja sitä esiintyy yleisesti kulutetuissa hedelmissä, kuten omenoissa ja mansikoissa. Floretiinilla tiedetään olevan immunomodulatorisia ominaisuuksia, ja sitä käytetään laajalti ihonhoidossa sen antioksidanttisten ominaisuuksien vuoksi [22-24]. Lisäksi floretiini on glukoosinkuljettajan (GLUT) estäjä, ominaisuus, joka vaikuttaa makrofagien fenotyyppiin, koska GLUT ruokkii makrofagien aktivaatiota [25, 26]. Kaiken kaikkiaan nämä ominaisuudet tekevät floretiinista lupaavan yhdisteen moduloimaan makrofagien fenotyyppiä ja hermotulehdusta. Tässä tutkimuksessa osoitamme, että floretiini ajaa makrofageja kohti vähemmän tulehduksellista fenotyyppiä ja lievittää hermotulehdusta kokeellisessa autoimmuunienkefalomyeliitti (EAE) -mallissa. RNA-sekvensointi ja toiminnalliset kokeet tunnistivat Nrf2-reitin tämän floretiinin indusoiman suojaavan makrofagifenotyypin keskipisteeksi ja kuljettajaksi. Autofagiakoneiston AMPK-riippuvaisen aktivoitumisen ja sitä seuranneen SQSTMl/p62--välitteisen (jäljempänä p62) Keaplin, proteasomaalista Nrf2-degradaatiota helpottavan adapterin, hajoamisen havaittiin olevan Nrf2-aktivaation taustalla makrofageissa. Nämä havainnot osoittavat, että floretiinilla on potentiaalia käyttää hermotulehdussairauksien hoitostrategioissa.

menetelmät

Vasta-aineet ja kemialliset reagenssit

Floretiini(Sigma Aldrich) liuotettiin 50 mM KOH:iin 15 mM varastoliuokseksi ja säilytettiin -20 asteessa. Lisälaimennoksia tehtiin RPMI1640 (Gibco) -elatusaineeseen. In vivo -käsittelyä varten floretiini liuotettiin 1 N NaOH:iin, minkä jälkeen pH säädettiin uudelleen arvoon 7,2 1 N HCl:lla, ja liuosta laimennettiin edelleen fysiologiseen veteen, jotta saatiin pitoisuus 50 mg/kg. BML-275 (1 μM, Santa Cruz Biotechnology) lisättiin 1 tunti ennen floretiinikäsittelyä AMPK:n aktivoitumisen estämiseksi. Bafilomysiini A1 (BAF, 0,1 µM, InvivoGen) lisättiin 2 tuntia ennen keräämistä estämään autofagosomien ja lysosomien fuusio. Lipopolysakkaridia (LPS, 100 ng/ml, Sigma-Aldrich) käytettiin stimuloimaan soluja tulehduksellista fenotyyppiä varten. ROS-tuotannon indusoimiseen käytettiin forbol-12-myristaatti-13--asetaattia (PMA, 100 ng/ml, Sigma-Aldrich). Seuraavia vasta-aineita käytettiin Western blot -testissä: hiiren anti- -aktiini (1:10,000;sc-47778, Santa Cruz Biotechnology), hiiren anti-GAPDH (1:{{29) }};AB_2537659, Invitrogen), kanin anti-AMPK (1:1000;5831S, Cell Signaling Technology), kanin anti-fosforyloitu AMPK (1:1000; 2535S, Cell Signaling Technology), kanin anti-LC3 (1:1000;L7543, Sigma-Aldrich), kanin anti-p62 (1:1000; 23214, Cell Signaling Technology). Seuraavia vasta-aineita käytettiin immunofluoresenssiin: rotan anti-CD3 (1:150; MCA500G, Bio-Rad), rotan anti-F4/80 (1:100; MCA497G, Bio-Rad), kanin anti-LC3 (1:1000) ;L7543, Sigma-Aldrich), kanin anti-p62 (1:500;23214, Cell Signaling Technology), kanin anti-Keap1 (1:500;60027-1-Ig, Proteintech Europa), kanin anti-TMEM119(1) :100, ab209064, Abcam). Sopivat sekundaariset vasta-aineet ostettiin Invitrogenilta.

Hiiret

Villityypin (WT) C57BL/6JOlaHsd-hiiret ostettiin Envigolta. Eläimiä ruokittiin säännöllisellä ruokavaliolla ja pidettiin Hasseltin yliopiston biolääketieteellisen tutkimuslaitoksen eläintilassa. Kaikki kokeet suoritettiin instituutioiden ohjeiden mukaisesti, ja Hasseltin yliopiston eläinkokeiden eettinen komitea hyväksyi ne.

Soluviljely

Luuytimestä johdettumakrofagit(BMDM:t) eristettiin WT- ja Nrf2 knockout (KO) C57BL/6JOlaHsd-hiiristä, ostettiin Envigolta ja toimitettiin RIEN BRC:ltä MTA:n mukaisesti professori S. Kerdine-Römerille, vastaavasti [27,28]. BMDM:t saatiin kuten aiemmin on kuvattu [29]. Lyhyesti sanottuna 12-viikon ikäisten WT- ja Nrf2 KO C57BL/6JOlaHsd -hiirten sääriluun ja reisiluun luuydinsoluja viljeltiin 10-cm Petri-maljoilla pitoisuudella 10×106 solua/ levy, RPMI1640-elatusaineessa, jota on täydennetty 10 prosentilla vasikan sikiön seerumilla (FCS, Gibco), 50 U/ml penisilliinillä (Invitro-gen), 50 U/ml streptomysiinillä (Invitrogen) ja 15 prosentilla L929-käsitellyllä alustalla (LCM) ). Erilaistumisen jälkeen BMDM:t irrotettiin 37 asteessa 10 mM EDTA:lla PBS:ssä (Gibco) ja viljeltiin (0,5 x 10 asteen soluja/ml) RPM1640:ssä, jota oli täydennetty 10 prosentilla FCS:llä, 50 U/ml penisilliinillä, 50 U/ml streptomysiinillä ja 5 prosentilla LCM:llä ( 37 astetta C, 5 % CO2). Mikrogliaviljelmät eristettiin postnataalisten P1-3 C57BL/6/OlaHsd-pentujen aivoista. Sen jälkeen, kun aivorunko, suonikalvon plexus ja aivokalvot oli poistettu, aivot dissosioitiin mekaanisesti ja pilkottiin entsymaattisesti 15 minuutin ajan 1 x trypsiinillä (Gibco) 37 asteessa. Myöhemmin solususpensio ympättiin DMEM:ään korkeaglukoosipitoiseen elatusaineeseen (Sigma), jota oli täydennetty 30 prosentilla LCM:llä, 10 prosentilla FCS:llä, 50 U/ml penisilliinillä ja 50 U/ml streptomysiinillä T75-viljelypulloihin. Kaksi tai kolme päivää myöhemmin suoritettiin täydellinen alustan vaihto. Sekoitettuja gliaviljelmiä ravisteltiin (230 rpm, 3 h, 37 astetta) 6-7 päivän kuluttua puhtaiden mikrogliaviljelmien saamiseksi.

RNA-sekvensointi

Soluja esikäsiteltiin floretiinilla (50 µM) 20 tunnin ajan ja LPS-stimuloidulla (100 ng/ml) 6 tunnin ajan. Solujen lyysi suoritettiin käyttämällä Qiazol Lysis -reagenssia (Qiagen). RNA uutettiin soluista käyttämällä RNeasy-minisarjaa (Qiagen). Sitten Genomics Core Leuven (Belgia) käsitteli näytteet. Kirjaston valmistelu suoritettiin Lexogenin QuantSeq-sarjalla Illumina-yhteensopivien kirjastojen luomiseksi. Kirjastot sekvensoitiin Illumina HiSeq4000 -sekvensointijärjestelmällä. Splice-aware kohdistus suoritettiin STAR v2.6.1b:llä[30]. Lukujen kvantifiointi geeniä kohti suoritettiin HT-seq Count v2.7.14:llä. Laskuriin perustuva differentiaaliekspressioanalyysi tehtiin R-pohjaisella (The R Foundation for Statistical Computing, Wien, Itävalta) Bioconductor-paketilla DESeq2. Luettelo eri tavalla ilmennetyistä geeneistä valittiin osoitteessa ap<0.05 and="" used="" as="" an="" input="" for="" the="" core="" analysis="" by="" qiagen's="" ingenuity="" pathway="" analysis="" (ipa).="" all="" rna="" sequencing="" (rna-seq)="" data="" discussed="" in="" this="" publication="" have="" been="" deposited="" in="" ncbi's="" gene="" expression="" omnibus(edgar="" et="" al,="" 2002)="" and="" are="" accessible="" through="" geo="" series="" accession="" number="">

Kvantitatiivinen käänteistranskriptio-PCR

Soluja esikäsiteltiin floretiinilla (50 μM) 20 tuntia ja LPS-stimulaatiolla (100 ng/ml) 6 tuntia. Hajotus suoritettiin käyttämällä Qiazol Lysis -reagenssia (Qiagen). RNA uutettiin käyttämällä RNeasy-minisarjaa (Qiagen). RNA:n konsentraatio ja laatu määritettiin Nano-drop-spektrofotometrillä (Isogen Life Science). cDNA-synteesi suoritettiin käyttämällä Quanta qScript cDNA SuperMixiä (Quanta Biosciences) valmistajan ohjeiden mukaisesti. qPCR suoritettiin StepOne-Plus" Real-Time PCR -järjestelmällä (Applied Biosystems) käyttämällä SYBR vihreää seosta, joka sisälsi 1 × SYBR green (Applied Biosystems), 0,3 μM alukkeita (Integrated DNA Technologies), 12,5 ng cDNA-vapaata vettä ja nukleaasia. Geeniekspression kvantifiointiin käytettiin vertailevaa Ct-menetelmää.Tiedot normalisoitiin stabiileimpiin vertailugeeneihin sykliini A ja hypoksantiinifosforibosyylitransferaasi 1. Alukesekvenssit ovat saatavilla pyynnöstä.

Reaktiivisten happilajien määritys

Soluja esikäsiteltiin floretiinilla (50 uM) 2 tunnin ajan. Sen jälkeen soluja stimuloitiin PMA:lla (15 min, 100 ng/ml) ja ROS-tuotanto mitattiin käyttämällä fluoresoivaa koetinta 2',7'-diklooridihydrofluoreseiinidiasetaattia pitoisuudella 10 µM PBS:ssä 30 minuutin ajan. Fluoresenssi mitattiin käyttämällä fluoresenssia FLUOstar optima -mikrolevylukijaa (BMG Labtech, Ortenberg, Saksa) (viritys: 495 nm, emissio: 529 nm).

Typpioksidin mittaukset

Soluja esikäsiteltiin floretiinilla (50 µM) 2 tunnin ajan. Sen jälkeen soluja stimuloitiin LPS:llä (24 h, 100 ng/ml). NO:ta tarkkailtiin epäsuorasti käyttämällä Griess-reagenssinitriittimittaussarjaa (Abcam). Lyhyesti sanottuna nitraatti reagoi sulfanilamidin ja N-(1-naftyyli)etyleenidiamiinidihydrokloridin kanssa, jolloin muodostuu vaaleanpunainen atsoväri. Tämän atsojohdannaisen absorbanssi mitattiin sitten 540 nm:ssä käyttämällä mikrolevylukijaa (iMark, Bio-Rad).

Western blot

Soluja käsiteltiin floretiinilla (5{{10}} μM) ja LPS:llä (100 ng/ml) 1 tunnin tai 24 tunnin ajan AMPK-aktivaation tai vastaavasti p62-, LC3- ja Keapl-proteiinitasojen määrittämiseksi. Solut hajotettiin käyttämällä RIPA-puskuria (150 mM NaCl, 1 % Triton X-100, 0,5 % natriumdeoksikolaattia, 1 % SDS, 50 mM Tris) ja erotettiin natriumdodekyylisulfaattipolyakryyliamidigeelielektroforeesilla. Geelit siirrettiin PVDF-kalvolle (VWR) ja blotit blokattiin 1 tunnin ajan 5-prosenttisessa naudan seerumin albumiinissa Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa, joka sisälsi 0,1 prosenttia Tween{20}}(TBS-T). Kalvoja tutkittiin primaarisilla vasta-aineilla yön yli 4 °C:ssa, pestiin TBS-T:llä ja inkuboitiin vastaavan sekundaarisen piparjuuriperoksidaasilla leimatun vasta-aineen kanssa 1 h huoneenlämpötilassa (RT). Immunoreaktiiviset signaalit havaittiin tehostetulla kemiluminesenssilla (ECL Plus, Thermo Fisher) käyttäen Amersham Imager 680 (GE Healthcare Life Sciences) -laitetta. Juovien tiheydet määritettiin käyttämällä ImageJ:tä.

Immunofluoresenssi

Selkäytimen kryosektiot ilmakuivattiin ja kiinnitettiin jääkylmään asetoniin 10 minuutin ajan - 20 asteessa. Hiiren BMDM:itä viljeltiin lasilevyillä ja kiinnitettiin jääkylmään metanoliin 10 minuutin ajan -20 asteessa. Leikkeet ja BMDM:t estettiin 30 minuutin ajan käyttämällä Dako-proteiiniblokkia (Agi-lent). Sen jälkeen niitä inkuboitiin yön yli 4"C:ssa primaaristen vasta-aineiden kanssa, pestiin ja inkuboitiin asianmukaisten sekundaaristen vasta-aineiden kanssa 1 h ajan huoneenlämpötilassa. Selkäydinkudoksesta otettiin kuvia Nikon Eclipse 80i -mikroskoopilla (10x objektiivi) ja NIS:llä. Elements BR 3.10 -ohjelmisto (Nikon). Kuvat p62:lle, LC3:lle ja Keaplille värjätyistä BMDM:istä otettiin Zeiss LSM 880 konfokaalimikroskoopilla, ja ne on Airyscan-korjattu (63× objektiivi).P62-ja LC3- positiiviset pisteet määritettiin puoliautomaattisella puncta-analyysikuvalla J. Lyhyesti sanottuna, kun kuva oli tehty binaariseksi ja solut valittiin käsin, puncta analysoitiin solua kohden. P62- ja Keapl-kolokalisaatio suoritettiin käyttämällä CellProfiler-ohjelmiston kolokalisointiputkia [31 Kuvissa näkyvät kuvat ovat digitaalisesti parannettuja.

Experimental autoimmune encephalomyelitis model Eleven-week-old C57BL/6JOlaHsd mice were immunized subcutaneously with 200 ng of myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide(MOG35-55)emulsified in 100 ul complete Freund's supplemented with 4 mg/ml of Mycobacterium tuberculosis(EK2110, Hooke Laboratories). Im-mediately after MOG immunization and after 24 h, mice were intraperitoneally injected with 50 ng pertussis toxin (EK2110 kit, Hooke Laboratories) to induce EAE.EAE animals were treated daily with phloretin or vehicle(50 mg/kg, intraperitoneal (ip)) after 6 days of immunization (prophylactic setup)or after disease onset(clinical score>1, terapeuttinen asetus). Hiiret punnittiin ja pisteytettiin päivittäin taudin neurologisten merkkien varalta valmistajan hiiren EAE-pisteytysoppaan mukaisesti:0:ei kliinisiä oireita,0.5:hännän kärki on veltto, 1:halla häntä , 1,5: ontuva häntä ja takajalkojen esto 2: ontuva häntä ja takajalkojen heikkous, 2,5: ontuva häntä ja takajalkojen raahaaminen, 3: ontuva häntä ja täydellinen takajalkojen halvaus, 3,5: ontuva häntä ja täydellinen takajalkojen halvaus jalat ja hiiri eivät pysty oikaisemaan itseään kyljelleen asetettuna, 4: pallean halvaantuminen, 5: EAE:n aiheuttama kuolema.

Tilastollinen analyysi

Datan tilastolliseen analysointiin käytettiin GraphPad Prismia, jotka on esitetty keskiarvoina ±sem. D'Agostino ja Pear-sonin omnibus-normaliteettitestiä käytettiin normaalijakauman testaamiseen. Kaksisuuntaista paritonta Studentin t-testiä (tarvittaessa Welchin korjauksella) käytettiin normaalijakautuneelle datalle. Mann-Whitney-analyysiä käytettiin tiedoille, jotka eivät läpäisseet normaaliteettitestiä.p-arvoja<0.05 were="" considered="" to="" demonstrate="" significant=""><><0.01,><0.001 and="" *p=""><>

Tulokset

Makrofagien floretiinihoitoon liittyvät transkription muutokset

Mahdollisten anti-inflammatoristen vaikutusten selvittämiseksi ja makrofagien floretiinihoidon taustalla olevien mekanismien tunnistamiseksi suoritimme massa-RNA-sekvensoinnin (täydentävä kuva 1). Floretiinilla käsiteltyjen aktivoitujen makrofagien reittianalyysi osoitti, että eri tavalla ilmentyvät geenit olivat yliedustettuina kanonisissa reiteissä, jotka liittyvättulehdus, kuten iNOS(z-score:-2.449), maksun kaltainen reseptori (z-score:-2.236), interferonisignalointi (z-pistemäärä:- 2), ja akuutin vaiheen vastereitti (z-pisteet:- 1.633)(Kuvat 1A, B). Kanonisen reittianalyysin tavoin RNA-seq-tietojen ylävirran analyysi ennusti, että floretiini vähensi keskeisten tulehdusta edistävien transkription säätelijöiden, kuten IRF7:n (z-pistemäärä: 2,229), IRF1:n (z-pistemäärä: -2), aktivaatiota. 025)ja STAT1(z-pisteet:-2.022)(Kuva 1D). Floretiinilla käsiteltyjen makrofagien RNA-seq-analyysi osoitti makrofagien pro-inflammatoristen reittien vähentämisen lisäksi, että muiden reittien ohella floretiini aktivoi tehokkaasti Nrf2-reittiä (z-pistemäärä: 1,897), mikä on osoituksena Nrf{35}}assosioituneen reaktion lisääntymisestä. geenit, kuten mafG ja proxy (kuvio 1A, C). Lisäksi Nrf2(NFE2L2) tunnistettiin eniten aktivoituneeksi ylävirran transkription säätelijäksi (z-pistemäärä: 2,801), ja ROS-tasojen säätely tunnistettiin yhdeksi eniten säädellyistä biologisista toiminnoista floretiinilla käsitellyissä BMDM:issä (z-pistemäärä: 2,008). )(Kuva 1D, E). Yhteenvetona havainnot osoittavat, että floretiini aktivoi Nrf2:n ja suppressoi makrofagien tulehduksellista fenotyyppiä.

Nrf2-reitti säätelee floretiinilla käsiteltyjen makrofagien fenotyyppiä

Seuraavaksi validoimme floretiinin anti-inflammatorisen vaikutuksen ja määritimme, moduloiko se makrofagien tulehduksellista fenotyyppiä vaikuttamalla Nrf2:een. Alentuneita ROS-tasoja havaittiin floretiinilla käsitellyissä WT BMDM:issä, joita oli stimuloitu PMA:lla (kuvio 2A). Lisäksi havaittiin tulehdusta edistävien geenien NOS2, I-6, COX2 ja I-12 vähentynyt NO-tuotanto ja mRNA-tasot floretiinilla käsitellyissä WT BMDM:issä, joita oli stimuloitu LPS:llä (kuvio 2B, C). suhteessa Nrf2:n ratkaisevaan rooliin vähemmän tulehduksellisen fenotyypin indusoinnissa tietomme osoittavat, että floretiini aktivoi Nrf2--vastegeenit HO1 ja NQO1 WT:ssä, mutta ei Nrf2 KO BMDM:itä, jotka on stimuloitu LPS:llä (kuva 2D). Lisäksi floretiinikäsittely vähensi ROS-tuotantoa WT:ssä, mutta ei Nrf2 KO BMDM:issä (kuva 2E). Sen lisäksi, että se kontrolloi antioksidatiivisia vasteita, Nrf2:n on raportoitu tukahduttavan makrofagien tulehduksellista fenotyyppiä [12]. Jälkimmäisen tueksi floretiini ei kyennyt vähentämään tulehdusta edistävien geenien NOS2, IL-6, COX2 ilmentymistä. , ja IL-12 aktivoiduissa Nrf2-puutteellisissa BMDM:issä (kuva 2F). Kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittavat, että Nrf2 ohjaa makrofagien floretiinivälitteistä tulehduksellista fenotyyppimuutosta.

Floretiini edistää AMPK:n aktivoitumista

Floretiini on hyvin määritelty GLUT-estäjä, ja viimeaikaiset tutkimukset korostavat GLUT-välitteisen glukoosinoton tärkeyttä makrofagien aktivaatiossa [26,32]. Siksi määritimme, voisiko floretiini aktivoida energiaanturin AMPK, joka aktivoituu alhaisilla energia-/glukoositasoilla. Tuloksemme osoittavat, että floretiinihoito johtaa AMPK:n fosforylaatioon ja aktivaatioon (kuvat 3A, B). Lisäksi AMPK-estäjän BML-275 lisääminen estää suurelta osin AMPK:n aktivoitumisen floretiinilla käsitellyissä BMDM:issä (kuvat 3A, B). Vielä enemmän, löydömme osoittavat, että AMPK:n aktivaatio on välttämätöntä floretiinille ROS-tuotannon tukahduttamisessa, kuten korkeammat ROS-tasot osoittavat sekä floretiinilla että AMPK-estäjillä hoidetuissa BMDM:issä verrattuna pelkällä floretiinilla käsiteltyihin BMDM-soluihin (kuvio 3C). Kaiken kaikkiaan tietomme viittaavat siihen, että floretiinin aiheuttama AMPK-aktivaatio on ratkaisevan tärkeää makrofagien ohjaamiseksi kohti vähemmän tulehduksellista fenotyyppiä.

Floretiini stimuloi autofagiaa AMPK-riippuvaisella tavalla

Koska AMPK-aktivaatio liittyy katabolisten prosessien aktivoitumiseen vasteena ravinteiden puutteelle [33], tutkimme seuraavaksi, voiko floretiini aktivoida autofagiaa. Autofagia on konservoitunut katabolinen prosessi, joka indusoituu nälänhädän ja muiden stressireaktioiden seurauksena, mikä edistää rakkuloihin, joita kutsutaan autofagosomeiksi, lysosomaalista hajoamista. RNA-seq-analyysi ennusti autofagian yhdeksi alavirran biologisista prosesseista, joka osoitti lisääntynyttä aktiivisuutta floretiinilla käsitellyissä BMDM:issä (z-pistemäärä: 0.779) (kuvio 4A). Lisäksi floretiinilla ja autofagian estäjä bafilomysiini Al:lla käsiteltyjen BMDM-solujen immunosytokemiallinen analyysi osoitti autofagiamarkkerien MAP1LC3/LC3 (mikrotubuluksiin liittyvä proteiini 1 kevytketju 3) ja p62:n lisääntynyttä kertymistä verrattuna bafilomysiini A{14}}-käsiteltyihin BMDM:iin. 4B-D), mikä osoittaa lisääntynyttä autofagista virtaa floretiinihoidon aikana [34]. Autofagian indusoituessa LC3 muuttuu LC3I-muodosta lipidoituneeksi LC3I-muodoksi, mikä korreloi autofagosomien lukumäärän kanssa. Tämän mukaisesti korkeammat LC3II:n ja p62:n proteiinitasot määritettiin floretiinilla stimuloiduissa BMDM:issä Western blot -menetelmällä (kuvio 4E, F). Mielenkiintoista on, että tämä floretiinin aiheuttama p62:n ja LC3II:n lisääntyminen estettiin käsittelemällä BMDM:itä AMPK:n estäjällä BML-275 (kuvat 4E-F). Yhdessä tietomme osoittavat, että floretiini stimuloi autofagiaa AMPK-riippuvaisella tavalla.

Floretiini aktivoi Nrf2-reitin autofagiavälitteisen Keap1-hajoamisen kautta

Tietomme osoittavat, että floretiini aktivoi Nrf2:n ja stimuloi autofagiaa makrofageissa. Mielenkiintoista on, että autofagiareseptori p62 voi kilpailla Nrf2:n kanssa sitoutumisesta Keapliin, adapteriin, joka helpottaa Nrf2:n ubikvitinaatiota ja hajoamista normaaleissa olosuhteissa. Tämä Keap1/Nrf2:n p62-välitteinen dissosiaatio estää siten Nrf2:n hajoamisen ja johtaa lopulta Nrf2:n aktivaatioon [35]. Tästä syystä määritimme, edistääkö floretiini p62/Keapl-vuorovaikutusta, mikä aktivoi Nrf2-reittiä. Tässä näytämme, että floretiini aktivoi Nrf2-reitin p62-välitteisen Keapl-hajoamisen kautta makrofageissa. Käyttämällä korkearesoluutioista Airyscan-kon-fokaalimikroskopiaa yhdistettynä kolokalisaatioanalyysiin, osoitamme, että floretiini stimuloi p62:n ja Keaplin vuorovaikutusta, minkä osoittaa kolokalisaatioparametrin (Pearsonin kerroin) kohonnut arvo floretiinilla käsitellyissä BMDM:issä (kuva 5A). , B). Lisäksi löydömme osoittavat, että floretiinilla käsitellyissä BMDM:issä on alhaisempia Keaplin proteiinitasoja, mikä vahvistaa Keaplin hajoamisen (kuva 5C). Vahvistaaksemme, että hajoaminen on autofagiasta riippuvaista, lisäsimme floretiinilla käsiteltyyn autofagia-inhibiittorin bafilomysiini A1:n. BMDM:t. Mielenkiintoista on, että tämä Keaplin väheneminen kumosi bafilomysiini Al -käsittelyllä (kuvio 5C). Nämä tulokset vahvistettiin Western blotilla, joka osoitti Keapl-proteiinitasojen alenemisen floretiinilla käsitellyissä BMDM:issä, minkä esti bafilomysiini A1 (kuvio 5D, E).

Phloretin reduces neuroinflammation in the EAE model To validate our findings in vivo, we investigated the impact of phloretin on the EAE model, the most commonly used animal model of MS, that is characterized by a pronounced macrophage-mediated inflammatory response in the CNS 5]. EAE animals treated with phloretin before disease onset showed reduced clinical scores compared to vehicle-treated animals (Fig. 6A). Importantly, even in a therapeutic setup, in which phloretin treatment was started after disease onset (clinical score>1), floretiini vähensi taudin vakavuutta (kuvio 6B). Taudin vaikeusaste floretiinilla hoidetuilla eläimillä oli rinnakkain tulehdusgeenien MHCI:n vähentyneen ilmentymisen kanssa,

CD86,Nos2,TNFa,IL-6,CCL4, CCL5 ja CXCL2 selkäytimessä (kuva 6C). Lisäksi floretiinilla käsiteltyjen eläinten selkäytimestä löydettiin pienempi määrä F4/80t-soluja (kuvio 6E, F). Koska sekä F4/80*mikroglia että F4/80* makrofagit edistävät hermoston tulehdusta, syvemmälle tehty analyysi osoitti, että floretiini vähensi huomattavasti F480:n ja TMEMl:n määrää19-

makrofagit EAE-hiirissä (täydentävä kuva 2 DF), kun taas ei-merkittävä suuntaus havaittiin F480:n plus TMEMl19:n plus mikroglian vähentymiseen. Tämän havainnon mukaisesti floretiini tukahdutti tulehdusvälittäjien tuotantoa mikrogliassa, mutta tämä suppressio oli vähemmän voimakasta verrattuna makrofageihin (täydentävä kuva 2 AC). Nämä havainnot viittaavat siihen, että EAE:n paraneminen floretiinilla on pääasiassa makrofagien ohjaamaa. Tulehdusgeenien ilmentymisen vähentämisen lisäksi floretiini lisäsi anti-inflammatoristen ja neurotrofisten tekijöiden, kuten IL-4, CNTF ja IGF-1, ilmentymistä EAE-eläinten selkäytimessä (kuva 6D). ). Nämä havainnot viittaavat vahvasti siihen, että floretiini vähentää EAE-taudin vakavuutta ohjaamalla makrofageja kohti taudin ratkaisevaa fenotyyppiä. Aiempien in vitro -löydöstemme mukaisesti havaitsimme myös kohonnutta Nrf2-signaalia floretiinilla käsiteltyjen EAE-eläinten keskushermostossa, mikä osoitti Nrf2:n lisääntyneen mRNA-ilmentymisen ja sen alavirran kohteiden NQO1 ja GPX1 (kuva 6G). Kaiken kaikkiaan nämä tiedot osoittavat, että floretiini estää hermoston tulehdusta sekä profylaktisessa että terapeuttisessa ympäristössä. Lisäksi löydömme osoittavat, että floretiini voi vähentää hermoston tulehdusta tukahduttamalla makrofagien tulehduksellisia piirteitä Nrf2-aktivaation kautta.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa osoitamme, että floretiini ohjaa makrofageja kohti vähemmän tulehduksellista fenotyyppiä Nrf{1}}riippuvaisella tavalla. AMPK-riippuvaisen autofagian aktivoitumisen ja sitä seuranneen Keaplin hajoamisen havaittiin olevan floretiinin aiheuttaman Nrf2-aktivaation taustalla. Lisäksi vahvistamme floretiinin anti-inflammatoriset vaikutukset EAE-mallissa, jossa se vähentää taudin vakavuutta ja lievittää makrofagiriippuvaisuuttahermoston tulehdus.

Osoitamme, että floretiini suppressoi makrofagien tulehduksellista fenotyyppiä. Tämä on linjassa Wei-Tien Changin et al. joka osoitti, että floretiinilla on anti-inflammatorisia ominaisuuksia makrofagisolulinjassa [36]. Osoitamme, että tämän fenotyyppisiirtymän induktio riippuu Nrf2:sta. Nrf2 on antioksidanttivasteiden pääsäätelijä, ja sen aktivaation tiedetään ohjaavan makrofageja kohti anti-inflammatorista fenotyyppiä [1l, 12, 37]. Lisäksi useat tutkimukset määrittelivät, että Nrf2-aktivaatio vaimentaa hermoston tulehdusta ja hermoston rappeutumista keskushermoston häiriöissä [{{10] }}]. Vaikka havaintomme osoittavat, että Nrf2 on floretiinilla käsiteltyjen makrofagien fenotyyppisiirtymän taustalla, RNA-sekvensointitiedot osoittivat, että Nrf2-aktivaation joukossa muita polkuja säädeltiin. Erityisesti PPAR-reitin voimistuminen on kiinnostavaa sen anti-inflammatoristen ominaisuuksien ja ristikeskustelun vuoksi Nrf2:n kanssa [41-45]. Lisäksi, koska floretiini on hyvin määritelty GLUT-estäjä ja siirtyminen glykolyysiin on ratkaiseva aineenvaihduntatapahtuma makrofagien aktivaatiolle, fenotyyppimuutokset voivat myös osittain johtua floretiinin suorista metabolisista vaikutuksista näihin glukoosinkuljettajiin [46,47]. Lisää tutkimusta tarvitaan PPAR:n merkityksen määrittämiseksi floretiinin aiheuttamassa Nrf2-aktivaatiossa ja missä määrin suorat metaboliset muutokset vaikuttavat floretiinin aiheuttamaan immunomodulaatioon. Kaiken kaikkiaan havaintomme osoittavat selvästi, että Nrf2-aktivaatiolla on olennainen rooli floretiinivälitteisessä fenotyypin vaihdossa.

Tuloksemme osoittavat, että floretiinin aiheuttama Nrf2-aktivaatio välittyy AMPK-aktivaatiosta. AMPK:lla on ratkaiseva rooli solujen energian homeostaasin palauttamisessa stressitilanteissa, jotka heikentävät ATP:tä, mikä johtaa lisääntyneeseen ADP:ATP-suhteeseen, jolloin se kytkee päälle vaihtoehtoisia katabolisia reittejä, jotka tuottavat ATP:tä, ja sammuttaa ATP:tä kuluttavat anaboliset reitit [48]. Vastaavasti floretiini on vakiintunut GLUT-estäjä ja alentaa solujen glukoositasoja [49-51]. Useat tutkimukset osoittivat, että AMPK-aktivaatio makrofageissa indusoi immunosuppressiivisen fenotyypin, mikä vahvistaa tuloksiamme, jotka osoittavat, että AMPK:n aktivaatio on välttämätöntä floretiinille tulehduksen vähentämiseksi [52,53]. Tietomme ovat myös yhdenmukaisia ​​aiempien tutkimusten kanssa, joissa floretiinin on osoitettu aktivoivan AMPK:ta muissa solutyypeissä, mukaan lukien rasvasolut ja endoteelisolut [50, 54-56]. Floretiini voi aktivoida AMPK:ta epäsuorasti lisäämällä AMP:ta ja alentamalla ATP-tasoja, koska AMP ja ATP stimuloivat tai estävät allosteerisesti AMPK:n aktivaatiota, vastaavasti [48, 57]. Siitä huolimatta CaMKK, joka on AMPK:sta ylävirtaan oleva kinaasi, voi edistää AMPK:n aktivaatiota vasteena lisääntyneille solujen Ca2 plus -tasoille muuttamatta AMP/ATP-tasoja [58]. Lisäksi, koska AMPK:n ja ylä- ja alavirtareittien välinen vuorovaikutus on laaja, lisätutkimusta tarvitaan floretiinin aiheuttaman AMPK-aktivaation taustalla olevan mekanismin selvittämiseksi.

Tietomme viittaavat siihen, että floretiinin välittämä AMPK-aktivaatio stimuloi autofagiaa makrofageissa. Kuten edellä mainittiin, AMPK-aktivointi on itsesuojaava prosessi, jonka tavoitteena on palauttaa solun energiatasapaino [48]. Vaikka mikään tutkimus ei ole koskaan osoittanut, että floretiini kykenisi stimuloimaan makrofagien fenotyyppiä edistämällä autofagiaa, jotkut tutkimukset ovat kuitenkin osoittaneet floretiinin vaikutuksen autofagian reitteihin syöpäsoluissa ja hepatosyyteissä [59-61]. Lisäksi useat tutkimukset osoittavat, että AMPK:n aktivaation alavirran kataboliset prosessit voivat aktivoida autofagian [60, 62, 63]. Mielenkiintoista on, että vastauksena glukoosin nälkään, AMPK-välitteinen autofagia indusoituu tärkeän autofagian initiaattorin unc-51, kuten autofagiaa aktivoivan kinaasin, fosforylaatiolla [64,65]. Tämän suhteen arvelemme, että AMPK stimuloi autofagiaa palauttamaan ATP:tä solukomponenteista vasteena floretiinin aiheuttamaan glukoosivajeeseen. Glukoosinälkä voi kuitenkin myös aktivoida autofagian AMPK:sta riippumattomalla tavalla [66-68]. Siksi tarvitaan lisää tutkimusta sen määrittämiseksi, tapahtuuko floretiinin aiheuttama autofagian aktivaatio myös osittain AMPK:sta riippumatta.

Viimeaikaiset tutkimukset osoittivat autofagian merkityksen toiminnallisen makrofagifenotyypin ohjaamisessa. Tässä yhteydessä makrofagien autofagian häiriöt on yhdistetty erityisesti ateroskleroosin ja neurologisten sairauksien puhkeamiseen [69-72]. Tässä tarjoamme linkin floretiinihoidon, autofagian induktion ja Nrf2-aktivaation välillä osoittamalla, että floretiini edistää Nrf2-aktivaatiota Keap1:n p62-välitteisen hajoamisen kautta. Viime aikoihin asti p62 punctan lisääntymistä pidettiin merkkinä vähentyneestä autofagiasta, koska p62 hajoaa autofagosomeissa autofagian aktivoituessa [34]. Tähän liittyen p62:n kertyminen on yhdistetty autofagian toimintahäiriöön ateroskleroottisissa leesioissa [73]. Tämä käsitys on kuitenkin kyseenalaistettu viime vuosina, ja nyt ajatellaan, että p62 on välttämätön autofagosomien muodostumiselle ja että p62-tasojen nousu samanaikaisesti LC3Il-pisteen lisääntymisen kanssa voi olla merkki autofagian induktiosta [74]. Siksi yhdessä floretiinin kyvyn aktivoida AMPK:n ja sen tunnetun roolin autofagian aktivoinnissa, tuloksemme viittaavat siihen, että P62:n ja LC3:n kertyminen bafilomysiini A1 -hoidon yhteydessä floretiinilla stimuloiduissa makrofageissa johtuu lisääntyneestä autofagista, ei heikentyneestä autofagia. Mielenkiintoista on, että Lee Y et ai. osoitti äskettäin, että Nrf2:n aktivoimisen lisäksi p62:n sitoutuminen Keapliin osallistuu myös autofagosomien muodostumiseen, mikä viittaa siihen, että floretiinin välittämä autofagian aktivaatio on suoraan yhteydessä lisääntyneeseen p62-aktiivisuuteen, mutta toisaalta myös Keapl-p62-vuorovaikutukseen. 75]. Keapl on Cullin{27}}pohjaisen ubikvitiiniligaasin adapteri, joka muodostaa homodimeerin Nrf2:n kanssa homeostaattisissa olosuhteissa ja edistää siten Nrf2:n ubikvitinaatiota ja proteasomaalista hajoamista [76]. Keapl-Nrf2-kompleksin hajoaminen johtaa Nrf2:n stabiloitumiseen ja siirtymiseen ytimeen [77, 78]. On hyvin dokumentoitu, että tämän kompleksin hajoaminen tapahtuu joko Keapl-kysteiinitähteiden modifioinnilla elektrofiilisillä molekyyleillä, pienten molekyylien suoralla vuorovaikutuksella Keaplin kanssa tai p62-välitteisellä Keaplin hajoamisella [35]. Ying Y ym. ehdottavat floretiinin ja Keaplin suoraa vuorovaikutusta in silico -kokeiden perusteella, mikä sitten johtaa Nrf2-reitin aktivaatioon kardiomyosyyttisolulinjassa [79]. Täällä loimme lisäautofagiaan liittyvän mekanismin, jolla floretiini aktivoi Nrf2:n.

EAE-mallia käyttämällä totesimme, että floretiini lievittää hermoston tulehdusta in vivo. Tietomme viittaavat vahvasti siihen, että floretiini parantaa EAE:tä estämällä makrofagien välittämää tulehdusvastetta ja aktivoimalla Nrf2-reittiä. Muissa sairausmalleissa floretiinilla on myös raportoitu hermoja suojaavia ja immuunivastetta moduloivia ominaisuuksia. Erityisesti floretiinin havaittiin aktivoivan Nrf2-reittiä aivoissa aivoiskemian yhteydessä ja vähentävän amyloidibeetan kertymistä rotan Alzheimerin taudin mallissa [80-84]. Floretiini saattaa vaikuttaa myös muihin immuunisoluihin in vivo, koska tämän yhdisteen on havaittu estävän T-solujen ja dendriittisolujen aktivaatiota in vitro [85, 86]. Ottaen huomioon, että hermotulehdus EAE-mallissa ei ole puhtaasti makrofageista riippuvainen, olisi kiinnostavaa määritellä, missä määrin hermotulehduksen väheneminen on muiden immuunisolujen välittämää. Tässä suhteessa, vaikka tietomme viittaavat siihen, että EAE:n paraneminen on pääasiassa makrofagien ohjaamaa ja vähemmän riippuvainen mikrogliamodulaatiosta, tarvitaan lisäkokeita sen selvittämiseksi, missä määrin floretiini vaikuttaa mikrogliaan hermotulehdussairauksissa. Kaiken kaikkiaan löydömme osoittavat, että floretiini vähentää hermoston tulehdusta vaikuttamalla makrofagien fenotyyppiin, mikä osoittaa floretiinin terapeuttisen potentiaalin hermotulehdussairauksissa.

Johtopäätökset

Tutkimuksemme osoittaa, että floretiini on voimakas immunomoduloiva aine, joka moduloi makrofagien tulehduksellisia ominaisuuksia hermoston tulehdussairauksissa. AMPK-riippuvaisen autofagian aktivoitumisen ja sitä seuranneen Keaplin hajoamisen välittämä Nrf2-reitin aktivaatio perustettiin ohjaamaan tätä fenotyyppimuutosta. Näin ollen floretiini on lupaava luonnossa esiintyvä aine, jota voidaan käyttää alentamaan hermotulehdussairauksien, kuten MS:n, tulehdustaakkaa.

Viitteet

1. Zeng Y, Peng Y, Tang K, Wang YQ, Zhao ZY, Wei XY, et ai. Dihydromyrisetiini parantaa vaahtosolujen muodostumista LXRalpha-ABCA1/ABCG1--riippuvaisen kolesterolin kautta makrofageissa. Biomed Pharmacother. 2018; 101:543–52. https://doi.org/10.1016/j.biopha.2018.02.124.

2. Xia M, Hou M, Zhu H, Ma J, Tang Z, Wang Q, et ai. Antosyaniinit indusoivat kolesterolin ulosvirtausta hiiren vatsakalvon makrofageista: peroksisomiproliferaattorin aktivoiman reseptorin {gamma}-maksa-X-reseptorin {alfa}-ABCA1-reitin rooli. J Biol Chem. 2005;280(44):36792–801. https://doi.org/10.{11}}/jbc.M505047200.

3. Chang YC, Lee TS, Chiang AN. Kversetiini tehostaa ABCA1:n ilmentymistä ja kolesterolin ulosvirtausta ap38-riippuvaisen reitin kautta makrofageissa. J Lipid Res. 2012;53(9):1840–50. https://doi.org/10.1194/jlr.M024471.

4. Grajchen E, Hendriks JJA, Bogie JFJ. Vaahtoisten fagosyyttien fysiologia multippeliskleroosissa. Acta Neuropathol Commun. 2018; 6(1):124. https://doi. org/10.1186/s40478-018-0628-8.

5. Bogie JF, Stinissen P, Hendriks JJ. Makrofagien alajoukot ja mikrogliat multippeliskleroosissa. Acta Neuropathol. 2014;128(2):191–213. https://doi.org/1 0.1007/s00401-014-1310-2.

6. Baecher-Allan C, Kaskow BJ, Weiner HL. Multippeliskleroosi: mekanismit ja immunoterapia. Neuroni. 2018;97(4):742–68. https://doi.org/10.1016/j. neuroni.2018.01.021.

7. Bogie JFJ, Grajchen E, Wouters E, Corrales AG, Dierckx T, Vanherle S, et ai. Stearoyyli-CoA-desaturaasi-1 heikentää aivojen makrofagien ja mikroglioiden korjaavia ominaisuuksia. J Exp Med. 2020; 217(5).

8. Bogie JF, Stinissen P, Hellings N, Hendriks JJ. Myeliinin fagosytoosiin vaikuttavat makrofagit moduloivat autoreaktiivista T-solujen lisääntymistä. J Neurotulehdus. 2011;8(1):85. https://doi.org/10.1186/1742-2094-8-85.

9. Bogie JF, Timmermans S, Huynh-Thu VA, Irrthum A, Smeets HJ, Gustafsson JA et ai. Myeliinistä peräisin olevat lipidit moduloivat makrofagien aktiivisuutta maksan X-reseptorin aktivaatiolla. PLoS One. 2012;7(9):e44998. https://doi.org/10.1371/ journal.pone.0044998.

10. Bogie JF, Jorissen W, Mailleux J, Nijland PG, Zelcer N, Vanmierlo T, et ai. Myeliini muuttaa makrofagien tulehduksellista fenotyyppiä aktivoimalla PPAR:ia. Acta Neuropathol Commun. 2013; 1(1):43. https://doi.org/10.1186/2 051-5960-1-43.