Cistanche Tubulosasta peräisin olevat fenyylietanoliglykosidit estävät maksan tähtisolujen aktivoitumisen ja estävät signaalireittien johtamisen TGF{0}}/smadissa mahdollisina maksafibroosin vastaisina aineina
Mar 05, 2022
Yhteystiedot: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Sähköposti:audrey.hu@wecistanche.com
Shu-Ping You, Long Ma, Jun Zhao, Shi-Lei Zhang ja Tao Liu
Abstrakti: Cistanche tubulosaon perinteinen kiinalainen kasviperäinen lääke, jota käytetään laajalti vastustuskyvyn säätelyyn jafenyylietanoidiglykosidit(CPhG) ovat tämän toiminnan tärkeimpiä komponentteja. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet CPhG:iden ehkäisevän ja terapeuttisen vaikutuksen naudan seerumin albumiinin (BSA) aiheuttamaan maksafibroosiin rotilla. Tutkimuksen tavoitteena oli arvioida CPhG:n ja monomeerien maksafibroosia estävää vaikutusta.ekinakosidijaakteosidiinhiboimalla maksan tähtisolujen (HSC) aktivaatiota, estämällä signalointireittien johtumisen kasvutekijä-p1 (TGF-p1)/smad transformaatiossa ja määrittämällä, että ne ovat in vitro hepatoprotektiivisia. HSC:n lisääntyminen estyi ilmeisesti CPhG:llä (100,50 ^g/ml)/ekinakosidilla (500 250 125 ^g/ml)/akteosidilla (6, 3 ^g/ml) käsittelyn jälkeen, IC50-arvoilla 119,125 520,99 ja g/6,345. ml, vastaavasti MTT-määrityksessä. Erilaiset CPhG-pitoisuudet/ekinakosidi/akteosidiei vaikuttanut solutoksisuuteen HSC:ssä laktaattidehydrogenaasin (LDH) mittausten mukaan. Erilaiset CPhG-pitoisuudet/ekinakosidi/akteosidilisäsi smad7:n mRNA-tasoa ja proteiinin ilmentymistä ja vähensi smad2:n, smad3:n mRNA-tasoja ja smad2:n, phospho-smad2:n (p-smad2), smad3:n, phospho-smad3:n (p-smad3) proteiinin ilmentymistä HSC:ssä. Yhteenvetona nämä tulokset osoittavat, että CPhGs/ekinakosidi/akteosidivoi estää TGF-p1/smad:n signalointireittien johtumisen ja estää HSC:n aktivoitumisen, mikä viittaa siihen, ettäC. tubulosavoi siten olla mahdollinen kasviperäinen lääke maksafibroosin hoitoon.
Avainsanat: Cistanche tubulosa; fenyylietanoliglykosidejaCistanche(CPHG:t);ekinakosidi; akteosidi; maksan tähtisolut (HSC); TGF-p1/smad
1. Esittely
muuttuvat proliferatiivisiksi ja fibrogeenisiksi, keräävät myöhemmin ECM:ää ja lopulta erilaistuvat fibrogeenisiksi myofibroblastin kaltaisiksi soluiksi. Transformoivaa kasvutekijää .1 (TGF-p 1) pidetään pääasiallisena profibrogeenisena välittäjänä. TGF-&1:een liittyvä signalointireitti on tärkeä maksafibroosin mekanismi, ja se sisältää pääasiassa smad-riippuvaisen ja smad-riippumattoman signaloinnin, ja smad-riippuvaisen signaalinvälitysreitin uskotaan olevan tärkeä TGF-p1-signaloinnin kanava. . Siksi TGF-p1/smad-signalointireitin salpaus voi tukahduttaa kollageenin tuotantoa ja lopulta lievittää maksafibroosia, mikä on tehnyt tästä reitistä tärkeän kohteen maksafibroosin vastaisessa lääketutkimuksessa viime vuosina.
Huolimatta maksafibroosin suuresta maailmanlaajuisesta esiintyvyydestä, yleisesti hyväksyttyä antifibrogeenistä hoitoa ei ole saatavilla [2–4]. Perinteiset kiinalaiset kasviperäiset lääkkeet (TCHM) ovat erittäin kiinnostavia maksasairauksien hoidossa, koska joitain niistä voidaan käyttää terapeuttisia lääkkeitä maksafibroosin hoidossa ja ehkäisyssä. Tällä hetkellä monet tutkimukset keskittyvät mahdollisiin antifibrogeenisiin lääkkeisiin, joita on käytetty TCHM:inä tuhansia vuosia [5].
Cistanche tubulosa W (heimon Orobanchaceae) fa loiskasvi, kasvatetaan laajalti Xinjiangin eteläisellä alueella Kiinassa [6]. Ihmiset käyttävät sitä munuaisten virkistykseen, veren ravitsemiseen, suoliston rentouttamiseen ja ikääntymisen viivyttämiseen ilman sivuvaikutuksia, ja se on virallisesti listattu Kiinan farmakopeaan [7]. C. tubulosa sisältää useita aktiivisia komponentteja, mukaan lukien fenyylietanoidiglykosideja (CPhG), iridoideja ja polysakkarideja. C. tubulousin monien aktiivisten komponenttien joukossa CPhG:t, joilla on useita biologisia aktiivisuuksia (antioksidantti, väsymys, radioresistenssi jne.), ovat tämän kasvin tärkeimmät ominaisuudet. Viime vuosina on raportoitu, että CPhG:illä on ylimääräisiä Hent-hepatoprotektiivisia vaikutuksia, ja ne voivat syrjäyttää puuradikaaleja, suojata maksan kalvoja ja osoittaa immunosäätelyvaikutuksia, apoptoosin estämistä, hepatiitti B:n pinta-antigeenin (HBs Ag) ja hepatiitti B:n ilmentymisen estämistä. antigeenin (HBeAg) ja hepatiitti B -viruksen (HBV) DNA:n replikaatioaktiivisuus jne. HBV DNA -taso on luotettavin indeksi, joka heijastaa suoraan viruksen replikaatioaktiivisuutta, joka on avaintekijä kroonisten HBV-infektioiden luontaisen historian määrittämisessä. oP-viruksenvastaisen hoidon tehokkuuden seuranta ja akuutin ja kroonisen HBV-infektion ennusteen arviointi. HBV:n serologiset havaitsemisindeksit sisältävät pääasiassa HBsAg:n, HBeAg:n jne. [8–11]. Kirjallisuudessa on kuitenkin vain vähän raportteja CPhG:iden maksafibroosin vastaisista vaikutuksista. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet CPhG:iden ehkäisevän ja terapeuttisen vaikutuksen naudan seerumin albumiinin (BSA) aiheuttamaan maksafibroosiin rotilla, mutta CPhG:n ja sen tärkeimpien monomeerien (ekinakosidi ja akteosidi, kuva 1) antifibrogeenistä aktiivisuutta ei ole koskaan arvioitu in vitro.
luomu Cistanche tubulosa
2. Tulokset
2.1. CPhG:iden kvantitatiivinen määritys
CPhG:t sisäänC. tubulosasisältävät kaksi fenyylietyylialkoholiglykosidia: ekinakosidia ja akteopuolta, ja niiden pitoisuudet CPhG:issä havaittiin HPLC-analyysillä (kuva 1) olevan 42,71 prosenttia 土 0,42 prosenttia ja 14,27 prosenttia 土 0.18 prosenttia vastaavasti.
2.2. CPhG:n, ekinakosidin ja akteosidin estovaikutus HSC-T6:lle
CPhG:t, ekinakosidi ja akteosidi (62.5-500 卩g/ml) estivät HSC:n solujen elinkelpoisuutta pitoisuudesta riippuvaisella tavalla. CPhG:t ja akteosidit osoittivat huomattavaa inhiboivaa aktiivisuutta HSC-soluihin, 50 prosentin solukasvuaktiivisuuden eston (IC50) arvot olivat 119,125 µg/ml ja 6,999 µg/ml, vastaavasti. Ekinakosidilla oli kohtalaista estävää aktiivisuutta (IC50 520,345 µ/ml; taulukko 1 ja kuvio 2).
2.3. CPhG:n, Echin acosidin ja Acteoridan solutoksisuus HSC:ssä
Laktaattidehydrogenaasi (LDH), stabiili sytoplasminen entsyymi, jota esiintyy kaikissa soluissa, vapautuu nopeasti soluviljelmän supernatanttiin plasmakalvovaurion seurauksena. Entsyymiaktiivisuus viljelmän supernatantissa korreloi lyysattujen solujen osuuden kanssa [12]. Kuten taulukosta 2 käy ilmi, kun niitä käsiteltiin erilaisilla: C PhG-, ekinakosidi- ja akteosidipitoisuuksilla, vaikka LDH-aktiivisuus osoitti lievää nousua verrattuna solujen ohjailuryhmään, ero ei ollut tilastollisesti merkitsevä (p > 0.05). ), mikä osoittaa, että useimmat solukalvot säilyttävät eheytensä ja että CPhG:iden, ekinakosidin ja akteosidin esto HSC:ssä ei johdu epäspesifisestä solutoksisuudesta.
2.4. CPhG:n, ekinakosidin ja akteosdin vaikutus TGF-^i:n aiheuttamaan HSC:n lisääntymiseen
HSC:n lisääntymistä, aktivaatiota ja erilaistumista säätelevät monet tekijät. Maksafibroosiin liittyvistä eri tekijöistä TGF{0}} pidetään tärkeimpänä, koska se voi aktivoida HSC:tä, edistää myofibroblastien erilaistumista, lisätä ECM-synteesiä ja estää ECM:n hajoamista sekä vapauttaa kemokiineja ja sytokiinit, jotka osallistuvat maksafibroosiin [13]. Tässä tutkimuksessa kontrolliryhmää lukuun ottamatta paikallaan pysyviä HSC:itä stimuloitiin TGF-P1:llä in vitro varhaisen maksafibroosin muodostumisen simuloimiseksi ja CPhG:n, ekinakosidin ja akteosidin vaikutuksen tutkimiseksi TGF-p:hen1- indusoi HSC-proliferaatio. Kuten taulukosta 3 näkyy, verrokkiryhmään verrattuna TGF-61-ryhmä edisti merkittävästi HSC:n lisääntymistä (p < 0.01).="" verrattuna="" tgf-p1-ryhmään="" tgf-p1="" plus="" cphg:t="" (tc)="" (50,100="" 卩g/ml,="" p="">< 0,05),="" tgf{{18}="" }="" plus="" ekinakosidi="" (te)="" (125,="" 250,="" 500="" 卩g/ml,="" p="">< 0,05),="" tgf-p1="" plus="" akteosidi="" (ta)="" (3,0,="" 6,0="" 卩g/ml,="" p="">< 0,05)="" kaikki="" estävät="" merkittävästi="" proliferaatiota="" tgf-|3="" 1="" eriasteisesti="" indusoimat="">
2.5. smad2)smad3- ja smad7-mRNA:n ilmentyminen CPhG:iden, okmakosidin ja akteasidin interventioiden jälkeen HSC:issä
Smad3 ja smad2 ovat TTGF-p-signalointireitin tärkeimpiä alavirran efektoreita [14,15], ja smad7 on smad-signaloinnin estäjä. Teoreettisesti smad7:n lisääntynyt ilmentyminen tai smad2/smad3:n vähentynyt ilmentyminen voi estää signalointireittien johtumisen TGF-p1/smad:ssa. Kuten kuvassa 3 esitetään, reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR-analyysi osoitti, että smad2:n ja smad3:n mRNA:n ilmentyminen osoitti alhaisempaa tasoa, kun taas smad7 osoitti korkeampia tasoja kontrolliryhmässä verrattuna TGF-|31-ryhmään. TC-ryhmässä (25, 50, 75,100 |dg/mL) smad2:n mRNA-taso (p < 0).{37="" }}5)="" ja="" smad3="" (p="">< 0,01)="" vähenivät="" merkittävästi="" verrattuna="" tgf-pf-ryhmään="" ja="" olivat="" jopa="" samanlaisia="" kuin="" kontrolliryhmä;="" sillä="" välin="" smad7:n="" mrna-taso="" nousi="" merkittävästi="" tc-ryhmässä="" (50,="" 75="" 100="" 卩g/ml)="" (p="">< 0,05,="" p="">< 0,05,="" p="">< 0,01).="" kuitenkin;="" smad7-ekspressio="" osoitti="" nousevaa="" suuntausta="" tc="" 25="" µg/ml="" -ryhmässä="" verrattuna="" tgf-p1-ryhmään="" (kuvio="">
Sillä välin, verrattuna TGF-p1-ryhmään, smad2- ja smad3-mRNA:n ilmentyminen väheni merkittävästi TE:ssä (62,5, 125, 250, 500 卩g /mL) ryhmässä (p < 0.01),="" ja="" smad7-mrna:n="" ilmentyminen="" lisääntyi="" merkittävästi="" te-ryhmässä="" (125,="" 250="" 500="" 昭/ml)="" (p="">< 0,01)="" (kuva="" 4)="" .="" samalla="" tavalla="" ta="" (0,75,="" 1,5,="" 3,0,="" 6,0="" ug/ml)="" ryhmä="" osoitti="" myös="" saman="" suuntauksen="" (kuvio="">
2.6. CPhG:n, ekinakosidin ja Ac)eosidien vaikutus T GF-^i/smad-signalointireitille HSC:ssä
TGF-p 1/smad-signalointireitti riippuu seuraavista: smad2, smad3, phospho-smad2 (p-smad2), phospho-smad3 (p-smad3) ja smad7, missä p-smad2, p-smad3 ovat smad2:n ja p-smad3:n aktivoituja muotoja. smad3. Tässä tutkimuksessa analysoitiin omad2-, smad3-, p-smad2-, p-smsd3- ja smad7-proteiinitasot. Western blot -analyysi havaitsi Smad2-, smad3-, p-smad2-, p-smad3-tasojen kohoamisen TGF-p1:llä ja näiden nousujen eston CPhG:illä, ec-hinakosidilla ja akteosidilla; sillä välin wesiern blot -analyysi paljasti CPhG:iden, ekinakosidin ja akteosidin säätelevät smad7-tasot. (Kuvat 6-8).
Kuten kuvasta 6 näkyy, c on2rol-ryhmään verrattuna (smad2:n, smad3:n, p-smad2:n, p-smad3:n proteiiniekspressiot lisääntyivät merkittävästi ja smad7-proteiinin ilmentyminen väheni TGF-p1-ryhmässä. TC:ssä (25) , 50, 75, 100 昭/ml) lääkeryhmää, smad/ (kuva 6A), p-smad2 (kuva 6B), smad 3 (kuva 6C), p -smad3 (Kuva 6D) ilmentymät olivat merkittävästi alhaisempia kuin TGF-p1-ryhmässä (卩 < 0,01), ja smad7 (kuvio 6E) -proteiinin ilmentyminen oli korkeampi kuin TGF-S1-ryhmän (p < 0,01) (kuvio 6).
Samaan aikaan ekspressiot ot smad 2, smad3, p-smad2, p-smad3 ja smad7 mitattiin ekinakosidi- ja akteosidiinterventioiden jälkeen HSC:ssä. Kuten kuvista 7 ja 8 näkyy, smad2-, smad3-, p-smad2- ja p-smad3-proteiinien ilmentymistasot estyivät merkittävästi (p < 0.05="" tai="" p="">< 0.01="" ),="" smad7-proteiinin="" ilmentymistaso="" oli="" kohonnut="" (p="">< 0,01)="" verrattuna="" tgf-p1-ryhmään="" (kuviot="" 7="" ja="">
3. Keskustelu
Maksafibroosi on yksi johtavista sairastuvuuden ja kuolleisuuden syistä maailmanlaajuisesti, mutta tähän sairauteen on tällä hetkellä saatavilla hyvin rajallisia hoitovaihtoehtoja, joten on erittäin tärkeää, että etsimme mahdollisia kohteita terapeuttiselle interventiolle )maksafibroosin kehittymisen estämiseksi. 16]. Äskettäin tutkijat ovat havainneet, että useilla kasviperäisillä lääkkeillä on hepatosuojaavia antifibroottisia vaikutuksia. Monia TCHM-lääkkeitä, kuten Fufang Biejia Ruangan -pillereitä [17] ja Xiao-chai-hu -keittoa (shosaiko to Japanissa) [18,19], on käytetty laajalti maksafibroosin hoitoon Kiinassa, Koreassa ja Japanissa tuhansien vuosien ajan. C. tubulosa sisältää useita aktiivisia komponentteja, mukaan lukien CPhG:t, iridoidit ja polysakkaridit. Yhtenä C. tubulosan tehokkaista materiaaliperusaineista CPhG:illä on erinomainen hepatoprotektiivinen aktiivisuus, mutta GPhC:iden ja siihen liittyvien yhdisteiden antifibroottisista vaikutuksista on vain vähän tietoa. Tässä tutkimuksessa tutkimme, kuinka CPhG:t, ekinakosidi ja akteosidi suppressoivat HSC:n aktivaatiota ja estävät signaalinvälityksen TGF-p1/snaadissa mahdollisina hepticfibroosin vastaisina aineina in vitro.
Minkä tahansa etiologian maksavaurio johtaa viime kädessä HSC:iden aktivoitumiseen, jotka läpikäyvät transdifferentioitumisen fibrogeenisiksi myofibroblastin kaltaisiksi soluiksi [20]. Eli myofibroblastit
ovat peräisin HSCss:n aktivaatiosta ja lisääntymisestä [21], ja sitä pidetään maksafibroosin muodostumisen välittäjänä. Tästä syystä suoritimme in vitro -tutkimuksia vertaillaksemme CPhG:ille, ekinakosidille ja akteosidille altistuneiden HSC:iden solujen elinkelpoisuutta. Tulokset osoittivat, että akteosidin HSC:tä estävä vaikutus oli voimakkain ja CPhG:iden vaikutus oli parempi kuin ekinakosidin. CPhG:t, ekinakosidit ja akteosidilla käsitellyt seerumit estivät kaikki HSC:n proliferaatiota annoksesta riippuvaisella tavalla.
LDH on sytoplasminen entsyymi elävissä soluissa, eikä se voi tunkeutua solukalvon läpi normaaleissa olosuhteissa. Kun solut vaurioituvat, kalvon läpäisevyys kasvaa ja LDH:ta vapautuu solun ulkopuolelle. Yleensä LDH voi havaita soluvaurion asteen [{{0}}]. Tutkimus osoitti, että CPhG:n, ekinakosidin ja akteosidilla sisältävän seerumin LDH-aktiivisuus osoitti vain lievää nousua verrattuna solukontrolliryhmään, eikä ero ollut tilastollisesti merkitsevä (p > 0,05), mikä viittaa siihen, että suurin osa solukalvosta säilytti eheytensä , ja CPhG:iden, ekinakosidin ja akteosidin aiheuttama HSC:iden esto ei johdu epäspesifisestä solutoksisuudesta.
Maksavaurion sattuessa aktivoituneet hepatosyytit voivat vapauttaa TGF-pi:tä, joka puolestaan aktivoi HSC-T6:n, joten TGF-pi:llä on läheinen yhteys fibroosin kanssa [25-27]. Tässä tutkimuksessa CPhG:itä, ekinakosidia ja akteosidia voidaan pitää houkuttelevana terapeuttisena strategiana HSC:n lisääntymisen estämiseksi sen jälkeen, kun HSC:itä oli stimuloitu wTGF-pi:llä in vitro. Arvelemme, että CPhG:itä, ekinakosidia ja akteosidia voidaan käyttää eräänlaisena maksafibroosin hoitona ja/tai ehkäisyyn, ja ne estävät varhaisen maksafibroosin muodostumista. Maksafibroosin muodostuminen on monimutkainen prosessi, johon liittyy monitekijä ja monisolu. Tässä patologisessa prosessissa solu-solu-, solu-sytokiini- ja solu-matriisivuorovaikutukset muodostavat hankalan verkoston. Tässä verkossa maksafibroosin kehittymistä voidaan säädellä erilaisilla signalointireiteillä ja -keinoilla. TGF-pi on klassinen HSC:n aktivaattori ja avainvälittäjä maksafibroosin patogeneesissä [28]. CPhG:t, ekinakosidi ja akteosidi voivat estää TGF-pi/smad-reittiin liittyvien mRNA:n ja proteiinien ilmentymistä HSC:issä.
TGF-pi saa aikaan soluvaikutuksensa smad-signalointireitin kautta, ja sitä on pidetty keskeisenä välittäjänä maksafibroosin ja tulehduksen kehittymisessä. Sitoutuessaan TGF-pi:n TGF-p-tyypin II reseptoriin tyypin II reseptorin kinaasi fosforyloi TGF-p tyypin I reseptorin GS-domeenin, mikä johtaa tyypin I reseptorin aktivoitumiseen [29]. P-smad2:n ja p-smad3:n toiminnan kautta kahdessa seriinitähteessä niiden C-terminaalin SSXS-motiivissa, reaktiot smad-signalointireitistä myötävirtaan aktivoituvat tyypin I reseptorin aktivoituessa [30]. P-smad2 ja p-smad3 muodostavat oligomeerisia komplekseja smad4:n kanssa, menevät sitten ytimeen ja harjoittavat biologista transkriptioaktiivisuuttaan. Siten smad-proteiinit välittävät signaaleja suoraan reseptorikinaasista tumaan [3i]. Toisaalta smad7 on tiukasti yhdistetty TGF-pi-reseptoriin, mikä johtaa smad 2/3:n aktivoitumattomuuteen sekä signaalinvälitysreittien estoon [32]. Smad7 voi estää p-smad2:ta ja p-smad3:a, aktivoitujen smad-kompleksien nukleaarista translokaatiota ja (CAGA) (9)-MLP-Luc:n aktivaatiota, mikä johtaa kollageeni I:n vähentyneeseen ilmentymiseen ja täydelliseen TGF-p-signaalitransduktion estoon. [33,34]. Tuloksemme osoittivat, että CPhG:t, ekinakosidi ja akteosidi voivat vähentää smad2- ja smad3-mRNA-ilmentymiä ja lisätä smad7-mRNA-ilmentymistä; estävät smad2-, p-smad2-, smad3- ja p-smad3-proteiinien ilmentymistä ja lisäävät smad7-proteiinin ilmentymistä, mikä viittaa siihen, että CPhG:illä, ekinakosidilla ja akteosidilla on myös rooli HSC-aktivaation estämisessä ja siten maksafibroosin estämisessä, mikä korostaa mahdollista antifibroosia mekanismi.
Kolmen testausaineen hepatoprotektiivisten vaikutusten järjestyksen osoitettiin olevan akteosidi > CPhGs > ekinakosidi. Jotta CPhG:n, ekinakosidin ja akteosidin maksafibroosilta suojaamisen mekanismin erojen syitä voitaisiin edelleen selvittää, niiden kemialliset rakenteet analysoitiin. Fenetyylialkoholiglykosidiosa näyttää olevan olennainen rakenne hepatoprotektiiviselle vaikutukselle [35]. Akteosidi (C29H36Oi5) on kaksoisglykosidi ja ekinakosidi (C35H46O20) triglykosidi, eli ekinakosidin rakenteessa on akteosidiin verrattuna ylimääräistä glykosidia, mikä johtaa sen tilakoon kasvuun. Akteosidin maksansuojaus tai HSC-aktiivisuuden esto on parempi kuin ekinakosidin, mikä saattaa johtua steerisen esteen olemassaolosta.
suojele maksaa: siiviläuute
4. Kokeellinen osa
4.1. Kemikaalit ja reagenssit
TGF-pi ostettiin Peprotechilta (Rocky Hill, NJ, USA). HSC-T6-solulinja ostettiin Wuhan Procell Gene Bio-technology Co., Ltd:ltä (Wuhan, Kiina). Dimetyylisulfoksidi (DMSO) ostettiin Sigma Inc:ltä (St. Louis, MO, USA). Smad2-, smad3- ja smad7-alukkeet tuotti Shanghai Sangon Biological and Technological Company (Shanghai, Kiina). Revert Aid ensimmäisen juosteen cDNA-synteesipakkaus ostettiin Thermo Scientificilta (Shanghai, Kiina). Quantifast SYBR vihreä PCR-sarja ostettiin QIAGEN GmbH:lta (Hilden, Saksa). p-smad2 (ser465/467) vasta-aine, Smad3 (C67H9) kanin mAb ja p-smad3 (ser423/425) kanin mAb hankittiin Cell Signaling Technologylta (Boston, MA, USA). Smad7-vasta-aine ostettiin Bosterilta (Wuhan, Kiina). Smad2-polyklonaalinen vasta-aine ja p-aktiini monoklonaalinen vasta-aine ostettiin Proteintechiltä (Wuhan, Kiina). Primaarisen vasta-aineen havaitseminen suoritettiin käyttämällä 2-asteista vasta-aineliuosta (Alk-Phos. Conjugated, Anti-rabbit) ja 2-asteista vasta-aineliuosta (Alk-Phos. Conjugated, Anti-mouse), jotka ostettiin yhtiöltä Invitrogen™ (Carlsbad, CA, USA). Laktaattidehydrogenaasimäärityspakkaus oli Nanjing Jiancheng Bioengineering Institutesta (Nanjing, Kiina).
4.2. Kasvimateriaali
C. tubulosa kerättiin Tulufanista Kiinan Xinjiang Uirghurin autonomisen alueen alueelta toukokuussa 2006. Jiang He, Institute of Materia Medica of Xinjiang, tunnisti kasvimateriaalit C. tubulosaksi. Lahjakorttinäyte talletettiin Xinjiangin Materia Medican instituuttiin Kiinassa.
4.3. CPhG:iden ja sen yhdisteiden eristäminen ja puhdistaminen
Kuivatut ja viipaloidut C. tubulosan (6.{1}} kg) juurakot uutettiin peräkkäin kolme kertaa palautusjäähdyttäen 7 0-prosenttisella etanolilla (4,8 1), ja sitten liuotin poistettiin yhdistetyistä uutteista. jolloin saatiin etanoliuute (1,146 kg). Etanoliuutteet puhdistettiin AB-8-hartsilla, jolloin saatiin raa'an fenyylietanoliglyosidi- (CPhGs) -uute. Veteen liukenemisen jälkeen uute puhdistettiin AB-8-adsorptiomakrohuokoisella hartsikromatografialla, jotta saatiin fenyylietanoliglykosivujen kokonaismäärä C. tubulosasta (CPhGs, 210 g). CPhG:t levitettiin ODS OP{{10}} -pylvääseen ja eluoitiin peräkkäin MeOH-H2-seoksilla (0:1 -^1:0). Eluaatit yhdistettiin viiteen alafraktioon TLC-käyttäytymisen mukaisesti käyttämällä liuotinjärjestelmää CHCh-MeOH-H2 (6:4:0,5). Täplät visualisoitiin 1-prosenttisella FeCih:llä ruiskutuksen jälkeen. Erilaisia fraktioita puhdistettiin toistuvasti Sephadex LH-20 -pylväskromatografialla metanolilla eluenttina, ja kaksi fenyylietanoliglykosidia eristettiin CPhG:stä. Niiden rakenteet vahvistettiin ekinakosidiksi (C35H46O20) ja akteosidiksi (C29H36O15) käyttämällä MS-, 1H- ja MC-NMR [35], joiden puhtaudeksi määritettiin UV-HPLC:llä vastaavasti 99,17 prosenttia ja 98,92 prosenttia. Ekinakosidin ja akteosidin rakenteet on esitetty kuvassa 9.
4.5. CPhG:iden kvantitatiivinen määritys
Nestekromatografiaa (HPLC) (LC{{0}}HPLC-instrumenttia, Shimadzu Co., Kioto, Japani) käytettiin CPhG:n echina-kosidin ja cteosidin sisällön analysointiin. Phenomenex Gemini ODS -kolonnia (250 x 4,6 mm, 5 pm) käytettiin 30 asteessa. Isokraattista liikkuvaa faasia, joka koostui metanoli-asetonitriili-1-prosenttisesta etikkahaposta (15:10:75, tilavuus/tilavuus/tilavuus), käytettiin 40 minuutin ajon aikana virtausnopeudella 0,6 ml/min UV-säteilyllä. havaitseminen 334 nm:ssä.
4.6. Soluviljely
HSC-soluja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eagle's-elatusaineessa (High Glucose) (DMEM, Peking, Kiina), johon oli lisätty 10 prosenttia naudan sikiön seerumia (FBS, Gibco, Carlsbad, CA, USA), 10 0 IU/ml penisilliiniä ja 100 ug/ml streptomysiiniä (HyClone, Logan, UT, USA) kostutetussa inkubaattorissa 37 asteessa 5 prosentin CO2:lla. Näitä soluja jatkoviljeltiin säännöllisesti 0,25-prosenttisella (1x) trypsiiniliuoksella (HyClone, Logan, UT, USA) ja väliaine vaihdettiin 2 päivän välein. Aluksi soluja viljeltiin DMEM:llä, joka sisälsi 10 % FBS:ää 48 tunnin ajan. Elatusaine korvattiin sitten DMEM:llä ilman FBS:ää solujen nälkään pitämiseksi 12 tunnin ajan. Näitä soluja kasvatettiin 48 tuntia ja 48 tunnin kuluttua seerumia nälkiinnettiin 0,5-prosenttisella FBS:llä 12 tuntia ennen kuin lisättiin 5 ng/ml TGF-&1:tä,
4.7. IC50-arvojen määrittäminen
Kun oli inkuboitu yön yli nälänhätäelatusaineessa, joka sisälsi {{0}},5 prosenttia FBS:ää, HSC-solut ympättiin 96-kuoppalevylle tiheydellä 5 x 104 solua/ml 24 tunnin ajan. HSC-soluja käsiteltiin CPhG:llä, ekinakosidilla ja akteosidilla eri pitoisuuksilla (0, 3,90625, 7,8125, 15,625, 31,25, 62,5, 125, 250 ja 500 ug/ml) 48 tunnin ajan. Jokaisessa pitoisuudessa oli neljä kuoppaa. Hoidon lopussa 20 卩L MTT [3-(4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli)-2,5-difenyylitetratsoliumbromidi] (Sigma; 5 mg/ml) lisättiin ja soluja inkuboitiin vielä 4 tuntia. DMSO:ta (200 rL) lisättiin kuhunkin kuoppaan supernatantin poistamisen jälkeen. Kun levyä oli ravistettu 10 minuuttia ravistelijassa, IC50-arvot saatiin mittaamalla absorbanssi 490 nm:n aallonpituudella käyttämällä entsyymileimauslaitetta (Benchmark PLUS, Hercules, CA, USA), tämä määritys tehtiin kolmena rinnakkaisena. CPhG:n, ekinakosidin ja akteosidin IC50-arvot olivat 119,125, 520,345 ja 6,999 Rg/ml, vastaavasti.
4.8 Solujen lisääntymistä estävät vaikutukset ja solujen elinkelpoisuus
HSC-solut altistettiin erilaisille CPhG-pitoisuuksille (25 50 100 Rg/ml), ekinakosidille (125 250 500 Rg/ml) ja akteosidille (1,5, 3, 6 Rg/ml). Eri konsentraatioita CPhG:itä, ekinakosidia ja akteosidia levitettiin levylle neljään peräkkäiseen kuoppaan ja inkuboitiin 48 tuntia. Solujen lisääntymistä estävät vaikutukset ja solujen elinkelpoisuuden taso (perustuu vaurioituneiden solujen supernatanttiin vapautuneen LDH-aktiivisuuden mittaukseen [36]) määritettiin MTT-määrityksellä. Estonopeus laskettiin käyttämällä seuraavaa kaavaa [37]:
Estoaste ( prosenttia ) " [1 — (koeryhmän keskimääräinen absorbanssi / nollakoeryhmän keskimääräinen absorbanssi)] x 100 prosenttia
Sarjan ohjeen mukaan
LDH (U/L) {{0}} (mitattu OD – kontrolli-OD)/(normaali OD – tyhjä OD) x 0,2 mmol/L x 1000
Alustava tutkimuksemme osoitti, että CPhG:t, ekinakosidi ja akteosidi eivät vaikuttaneet solujen elinkelpoisuuteen.
4.9. TGF-^1:n leviämistä estävät toimet
TGF-p1:n aktivoiman HSC:n on pitkään katsottu liittyvän maksafibroosiin, ja HSC:n kasvun estämistä on ehdotettu menetelmäksi maksafibroosin hoitoon [36,38]. CPhG:iden, ekinakosidin ja akteosidin antiproliferatiiviset vaikutukset TGF-p1:n aktivoimiin HSC:ihin määritettiin MTT-määrityksellä [39]. Käyttämällä kuvattuja menetelmiä ja lääkepitoisuuksia,
koeryhmiin kuuluivat kontrolliryhmä, TGF-pi-ryhmä, TGF-pi sekä eri konsentraatioiden lääkeryhmät. Kaikkia soluryhmiä paitsi kontrolliryhmää viljeltiin DMEM:llä, joka sisälsi 50 ng/ml TGF-p1:tä (ilman FBS:ää) 24 tunnin ajan. Solujen lisääntymistä estävä aktiivisuus laskettiin 100 x (käsitellyn yhdisteen absorbanssi - taustavalon absorbanssi)/(mallin absorbanssi - taustavalon absorbanssi).
4.10. Käänteinen transkriptio-polymeraasiketjureaktio (RT-PCR)
Smad2:n, smad3:n ja smad7:n mRNA:n ilmentymistaso määritettiin reaaliaikaisella PCR:llä. mRNA:n ilmentymisen määrittämiseksi HSC-soluissa solut (5 x 104 solua) kylvettiin kuusikuoppaisille levyille, joissa oli 30 ml DMEM:ää, jossa oli 10 prosenttia FBS:ää ja inkuboitiin yön yli 37 asteessa ja 5 prosenttia CO2. Sen jälkeen kun viljelyelatusaine oli vaihdettu seerumittomaan DMEM:ään, kuoppiin lisättiin CPhG:itä (100,50,25 µg/ml), ekinakosidia (500,250,125 µg/ml) ja akteosidia (6, 3,1,5 ug/ml). Kun oli inkuboitu 48 tuntia CPhG:iden ja monomeerikoostumusten kanssa, kokonais-RNA uutettiin käyttämällä TRIzol-reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ja sekoitettiin voimakkaasti kloroformin kanssa 15 sekunnin ajan. Kun lysaattia oli annettu seistä huoneenlämmössä 3 minuuttia, lysaattia sentrifugoitiin 12, 000 xg 15 minuuttia 4 asteessa. Vesifaasissa oleva RNA saostettiin isopropanolilla ja ylempi vesifaasi siirrettiin uuteen mikrosentrifugiputkeen. RNA saostettiin lisäämällä 0,75 % etanolia, minkä jälkeen mikrosentrifugiputkeen ja sentrifugoitiin 12,000 xg 4 asteessa enintään 5 minuuttia. Supernatantti poistettiin ja RNA:ta kuivattiin huoneenlämpötilassa 5-10 min. Alukkeet (Sangon) suunniteltiin käyttämällä Batch Primer 3:a, ja ne on lueteltu taulukossa 4. Tulokset normalisoitiin kotipitogeenin p-aktiinin mRNA:han sisäisenä kontrollina ja esitetään suhteellisina mRNA-tasoina. Reaktiot suoritettiin 8 |^L iQ SYBR Green Supermixillä, 1 10 pM alukeparilla, 8,5 ul:lla tislattua vettä ja 2,5 rl:lla cDNA:ta.
Kukin polymeraasiketjureaktio suoritettiin seuraavissa olosuhteissa: 95 astetta 3 minuuttia, sitten 40 sykliä 10 s 95 asteessa, 30 s 55 asteessa ja 10 s 55 asteessa -95 asteessa pidentämistä varten, minkä jälkeen yksi fluoresenssimittaus. Lopulliset tulokset kuvattiin suhteellisilla arvoilla (2_AACt). Laskenta ja analyysi suoritettiin iQ5 Real Time PCR Detection System -järjestelmällä.
4.11. Western Blot -analyysi
Kokosoluuutteet valmistettiin käyttämällä Radioimmunoprecipitation Assay (RIPA) -puskuria (Thermo Fisher Scientific, Inc.), jossa oli 1 % Halt-proteaasi-inhibiittoria ja 1 % Halt-fosfataasi-inhibiittoriseoksia (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Kokonaisproteiinia käytettiin smad2:n, p-smad2:n, smad3:n, p-smad3:n ja smad7:n havaitsemiseen. Proteiinipitoisuus mitattiin ja kvantifioitiin Bradfordin menetelmällä. Proteiini (10-30 Rg) erotettiin 10-prosenttisella SDS-PAGE-geelillä ja siirrettiin polyvinylideenifluoridi (PVDF) -kalvoille (Millipore, Boston, MA, USA). Kalvot estettiin 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa 5 prosentilla naudan seerumin albumiinilla ja primaarisilla vasta-aineilla (smad2 polyklonaalinen vasta-aine, p-smad2-vasta-aine, smad3 kanin mAb ja p-smad3 kanin mAb, 1:1000 laimennus; kanin mAb smad7, 1 :200 laimennus, p-aktiini monoklonaalinen vasta-aine, 1:5000 laimennus) inkuboitiin 4 asteessa yön yli. Vastaava Alk-Phos. konjugoituja sekundaarisia vasta-aineita inkuboitiin huoneenlämpötilassa. Lopuksi kalvot pestiin kolme kertaa 1 x Tris-HCl-suolaliuoksella, jossa oli 0,1 prosenttia Tween 20:tä, ja signaalit skannattiin ja visualisoitiin GEL DOC XR -kuvausjärjestelmällä (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Densitometrinen analyysi suoritettiin kiinnostaville proteiineille ja normalisoitiin p-aktiiniksi GEL DOC Image Studio -ohjelmistolla (Bio-Rad). p-aktiinia käytettiin sisäisenä kontrollina.
4.12. Tilastollinen analyysi
Tiedot ilmaistiin keskiarvoina 土 standardipoikkeama (SD). Tilastolliset analyysit suoritettiin SPSS 16.{1}} -ohjelmistolla (Xinjiang Medical University). Probit-analyysiä käytettiin analysoimaan IC50-arvoja. Eron merkitsevyys laskettiin yksisuuntaisella ANOVA-testillä ja arvoja, joiden p < 0,05,="" pidettiin="" tilastollisesti="">
5. Johtopäätökset
Yhteenvetona voidaan todeta, että C. tubulosan ja sen komponenttien ekinakosidin ja akteosidin CPhG:t osoittavat merkittäviä antifibroottisia vaikutuksia. Niistä akteosidin aktiivisuus on voimakkain, kun taas CPhG:iden aktiivisuus on näiden kahden yhdisteen välissä. TGF-p1/Smad-signaloinnin aktivaation estäminen voi olla taustalla oleva mekanismi, jolla CPhG:t suojaavat krooniselta maksasairaudelta, joka liittyy fibroosiin, ja ekinakosidi ja akteosidi ovat C. tubulosan tehokas antifibroottinen materiaaliperusta.
Kiitokset:Tätä tutkimusta tuki Kiinan National Natural Science Foundation (81260624). Kirjoittajat haluavat ilmaista vilpittömät kiitoksensa professori Tao Liulle hänen kirjoittamisen parantamisesta tässä artikkelissa.
Tekijän panokset:TL, JZ, S.-PY, LM ja S.-LZ suunnittelivat ja suunnittelivat kokeet. S.-PY, TL ja JZ analysoivat tiedot. S.-PY ja JZ kirjoittivat käsikirjoituksen. TL, LM ja JZ tarkastelivat käsikirjoituksen. Kaikki kirjoittajat lukivat ja hyväksyivät lopullisen käsikirjoituksen.
Eturistiriitoja:Kirjoittajat eivät ilmoittaneet eturistiriitaa.
Viitteet
1. Subramoniam, A.; Pushpangadan, P. Kasvilääketieteen kehittäminen maksasairauksiin. Ind. J. Pharmacol. 1999, 31, 166-175.
2. Friedman, SL Sairauden mekanismit: Maksafibroosin mekanismit ja terapeuttiset vaikutukset. Nat. Clin. Harjoittele. Gastroenteroli Hepatol. 2004,1, 98-105. [CrossRef] [PubMed]
3. Friedman, SL; Roll, FJ; Boyles, J.; Bissell, DM Maksan liposyytit: Normaalin rotan maksan tärkeimmät kollageenia tuottavat solut. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1985, 82, 8681-8685. [CrossRef] [PubMed]
4. Friedman, SL; Bansal, MB Maksafibroosin kääntyminen 一Tosiasia vai fantasia? H叩atology 2006, 43, S82-S88. [CrossRef] [PubMed]
5. Ahmad, A.; Ahmad, R. Maksafibroosin mekanismin ja mahdollisten terapeuttisten lähestymistapojen ymmärtäminen. Saudi J. Gastroenterol. 2012, 18, 155-167. [CrossRef] [PubMed]
6. Peter, H.; Korppi; Zhang, LB Orobanchaceae Ventenat. Flora of China, 23. painos; Toimituskomitea Flora of China: Chinese Academy of Sciences, Peking, Kiina, 2013; s. 1-16.
7. Kiinan kansantasavallan terveysministeriön Kiinan farmakopeakomissio. Kiinan farmakopea; Osa 1; Chemical Industry Publishing House: Peking, Kiina, 2010; s. 126.
8. Li, J.; Huang, D.; Hän, L. Roucongrongin (Herba Cistanches Deserticolae) vaikutus lisääntymismyrkyllisyyteen hiirillä, jonka Leigongtengin (Radix et Rhizoma Tripterygii) glykosidi aiheuttaa. J. Tradit. Leuka. Med. 2014, 34, 324-332. [CrossRef]
9. Xing, Y.; Liao, J.; Tang, Y.; Zhang, P.; Tan, C.; NIH.; Wu, X.; Li, N.; Jia, X. Xinjiangissa kasvavan Tamarix hohenackeri Bungen (Herba Cistanchesin isäntäkasvi) ACE:n ja verihiutaleiden aggregaation estäjät. Pharmacogn. Mag. 2014, 10, 111-118. [PubMed]
10. Jia, Y; Guan, Q.; Jiang, Y.; Salh, B.; Guo, Y.; Tu, P.; Du, C. Dekstraanisulfaatin natriumin aiheuttaman paksusuolentulehduksen parantaminen hiirillä ekinakosidilla rikastetulla Cistanche tubulosa -uutteella. Phytother. Res. 2014, 28, 110-119. [CrossRef] [PubMed]
11. Wong, HS; Ko, KM Herba Cistanches stimuloi solujen glutationin redox-kiertoa H9c2-kardiomyosyyttien mitokondrioiden hengityksestä syntyneiden reaktiivisten happilajien avulla. Pharm. Biol. 2013, 51, 64-73. [CrossRef] [PubMed]
12. Martin, A.; Clynes, M. Hapan fosfataasi: In vitro -toksisuustestien päätepiste. Vitro Cell. Dev. Biol. 1991, 27, 183-184. [CrossRef]
13. Lechuga, CG; Hernandez-Nazara, ZH; Dominguez Rosales, JA; Morris, ER; Rincon, AR; Rivas-Estilla, AM; Esteban-Gamboa, A.; Rojkind, M. TGF-01 moduloi matriisin metalloproteinaasin-13 ilmentymistä maksan tähtisoluissa monimutkaisilla mekanismeilla, joihin kuuluvat p38MAPK, PI3--kinaasi, AKT ja p70S6k. Olen. J. Physiol. Gastrointest Liver Physiol. 2004, 287, G974-G987. [CrossRef] [PubMed]
14. Nguyen, J.; Tang, SY; Nguyen, D.; Alliston, T. Load säätelee luun muodostumista ja sklerostiinin ilmentymistä TGFp-riippuvaisen mekanismin kautta. PLoS ONE 2013, 8, e53813. [CrossRef] [PubMed]
15. Pessah, M.; Marais, J.; Prunier, C.; Ferrand, N.; Lallemand, F.; Mauviel, A.; Atfi, A. C-Jun liittyy onkoproteiini Skiin ja tukahduttaa Smad2-transkription aktiivisuutta. J. Biol. Chem. 2002, 277, 29094-29100. [CrossRef] [PubMed]
16. Ding, N.; Yu, RT; Subramaniam, N.; Sherman, MH; Wilson, C.; Rao, R.; Leblanc, M.; Coulter, S.; Hän, M.; Scott, C.; et ai. D-vitamiinireseptori/SMAD-genominen piiri estää maksan fibroottisen vasteen. Cell 2013,153, 601-613. [CrossRef] [PubMed]
17. Yang, FR; Fang, BW; Lou, JS Fufang Biejia Ruangan Pillsin vaikutukset maksafibroosiin in vivo ja in vitro. World J. Gastroenterol. 2013, 19, 5326-5333. [CrossRef] [PubMed]
18. Sakaida, I.; Hironaka, K.; Kimura, T.; Terai, S.; Yamasaki, T.; Okita, K. Herbal medicine Sho-saiko-to (TJ{3}}) lisää ekspressiomatriksin metalloproteinaaseja (MMP) vähentäen metalloproteinaasien (TIMP) kudosinhibiittorin ilmentymistä rotan tähtisoluissa. Life Sci. 2004, 74, 2251-2263. [CrossRef] [PubMed]
19. Chen, M.; Chen, J.; Tsai, C.; Wang, W.; Chang, D.; Tu, DG; Hsieh, HY TGF-01:n ja sytokiinien rooli Sho-saiko-to:n maksafibroosin moduloinnissa rotan sappitieyhdistysmallissa. J. Ethnopharmacol. 2005, 97, 7-13. [CrossRef] [PubMed]
20. Bolarin, DM; Azinge, EC Biokemialliset markkerit, solunulkoiset komponentit maksafibroosissa ja kirroosissa. Nig. QJ Hosp. Med. 2007, 17, 42-52. [CrossRef] [PubMed]
21. Kong, D.; Zheng, S.; Lu, Y. Myofibroblastien lähde ja rooli maksafibroosissa. Leuka. Pharmacol. Sonni. 2011, 27, 297-300.
22. De Lavor, MSL; Binda, NS; Fukushima, FB; Caldeira, FMC; Da Silva, JF; Silva, CMO; de Oliveira, KM; Martins Bde, C.; Torres, BB; Rosado, IR; et ai. Iskemia-reperfuusiomalli rotan selkäytimessä: Solujen elinkelpoisuus ja apoptoosin signalointitutkimus. Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2015, 8, 9941-9949. [PubMed]
23. Bahadar, H.; Maqbool, F.; Niaz, K.; Abdollahi, M. Nanohiukkasten toksisuus ja yleiskatsaus nykyisiin kokeellisiin malleihin. Iran Biomed. J. 2016, 20, 1-11. [PubMed]