Cistanche Deserticolan fenyylietanoidiglykosidit: neuroprotektiivisen vaikutuksen mekanismi

Maiquan Li, et ai

Abstrakti:Ydintekijän erytroidiin 2- liittyvä tekijä 2 (Nrf2) on keskeinen transkriptiotekijä oksidatiivista stressiä ja neurodegeneratiivisia häiriöitä vastaan.Fenyylietanoidiglykosidit(PhG:t; salidrosidi,akteosidi, isoakteosidi jaekinakosidi) sisältää antioksidantteja jahermoja suojaavabioaktiivisuudet. Tämä tutkimus suoritettiin tutkimaanhermoja suojaavavaikutus ja molekyylimekanismiPhGs. PhGsesikäsittely tukahdutti merkittävästi H2O2--indusoitua sytotoksisuutta PC12-soluissa laukaisemalla Nrf2:n tuman translokaation ja kumoamalla hemioksygenaasi 1:n (HO-1), NAD(P)H-kinonioksidoreduktaasi 1:n (NQO1) vähentyneen proteiiniekspression ), glutamaatti-kysteiiniligaasi-katalyyttinen alayksikkö (GCLC) ja glutamaatti-kysteiiniligaasin modifiointialayksikkö (GCLM). Nrf2 siRNA tai HO-1 inhibiittori sinkkiprotoporfyriini (ZnPP) vähensihermoja suojaavavaikutus. PhG:t osoittivat mahdollista vuorovaikutusta Nrf2-sitoutumiskohdan kanssa Kelchin kaltaisessa ECH-assosiaatioproteiinissa 1 (Keap1). Tämä tulos voi tukea hypoteesia, että PhG:t ovat Nrf2:n aktivaattoreita. Osoitimme mahdollisen sitoutumisen PhG:iden ja Keapl-aktivoidun Nrf2/ARE-reitin välillä ja että PhG:illä, joissa oli enemmän glykosideja, oli tehostettuja vaikutuksia.

Avainsanat:Keap1; Nrf2;Neuroprotektiivinen; PC12-solut;PhGs(NQO1), muun muassa [5-7]. Tämä prosessi edustaa avainvaihetta solujen suojaamisessa oksidatiiviselta stressiltä, ​​ja siitä on tulossa lupaava terapeuttinen kohde hermosolujen suojauksessa [8]. Gaia raportoi, että Nrf2 lieventää LRRK2-- ja a-synukleiinin aiheuttamaa hermoston rappeutumista edistämällä tehokkaasti hermosolujen proteiinien homeostaasia solusta riippumattomalla ja ajasta riippuvaisella tavalla [9].

fenyylietanoidiglykosidit (PhGs) ovat tunnusomaisia ​​kanelihappo- ja hydroksyylifenyylietyyliosista, jotka ovat kiinnittyneet ap-glukopyranoosiin esteri- ja vastaavasti glykosidisidosten kautta. Nämä molekyylit kuuluvat vesiliukoisten luonnontuotteiden ryhmään, joka on laajalti levinnyt kasvikunnan alueella [10]. In vitro ja in vivo -tutkimukset ovat osoittaneet, että näillä yhdisteillä on antioksidantteja [11],hermoja suojaava[12], antibakteerinen,

Ottaa yhteyttä:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Cistanchella on hermostoa suojaavia ominaisuuksia, napsauta tästä saadaksesi lisätietoja

1. Esittely

Oksidatiivinen stressi, joka on antioksidanttien homeostaasin epätasapaino, aiheuttaa lipidien peroksidaatiota, vaurioita proteiinille ja DNA:lle, solujen ikääntymistä ja solukuolemaa. Tämä prosessi todennäköisesti myötävaikuttaa useisiin neurodegeneratiivisiin sairauksiin, kuten Alzheimerin tautiin (AD), Parkinsonin tautiin (PD) ja iskemiaan/reperfuusioon [1]. Vetyperoksidin (H2O2), joka on yksi tärkeimmistä reaktiivisista happilajeista (ROS), tiedetään aiheuttavan lipidiperoksidaatiota ja DNA-vaurioita [2]. Lisäksi H2O2 on endogeeninen hydroksyylivapaiden radikaalien lähde, joka edistää solujen oksidatiivisen stressin taustatasoa [3,4]. Siksi terapeuttisilla strategioilla oksidatiivisen stressin aiheuttaman apoptoosin ehkäisemiseksi voi olla potentiaalia neurodegeneratiivisten sairauksien hoidossa.

Ydintekijän erytroidiin 2- liittyvä tekijä 2 (Nrf2) on transkriptiotekijä, joka liittyy vahvasti oksidatiiviseen stressiin. Nrf2:n aktivaatio indusoi lukuisten antioksidantti- ja detoksifikaatiogeenien, mukaan lukien hemioksygenaasi-1 (HO-1), NAD(P)H-kinonioksidoreduktaasi 1:n, transkription

anti-inflammatoriset [13] ja immunomodulatoriset [14] bioaktiivisuudet. Osmanthusfragrans on yleinen ainesosa useissa aasialaisissa ruoissa, ja sitä on käytetty pitkään. Olemme aiemmin osoittaneet, että O. fragransin kukkauutteet tehostivat avaruudellista oppimista ja muistia, estivät oksidatiivisia vaurioita ja osoittivat hermostoa suojaavia aktiivisuuksia d-galaktoosin aiheuttamassa ikääntymisessä ICR-hiirimallissa [15]. Salidrosidi, akteosidi ja isoakteosidi ovat tärkeimmät PhG-vasteet O. fragransin kukkauutteiden antioksidanttisille vaikutuksille [16].

PhG:iden hermoja suojaavaa vaikutusta koskevat tutkimukset ovat saaneet toivottuja tuloksia. Salidrosidi vähensi merkittävästi MPP plus:lle altistuneiden PC12-solujen soluapoptoosia [17,18]. Akteosidi lievitti myös MPP plus -indusoitua apoptoosia ja oksidatiivista stressiä PC12-soluissa [19] ja A p25-35--indusoitua SH-SY5Y-soluvauriota [20].Ekinakosiditutkittiin tuumorinekroositekijä-a:n (TNFa) aiheuttamaa apoptoosia SH-SY5Y-soluissa [21], MPTP:n aiheuttamaa dopaminergistä toksisuutta hiirillä [22], glutamaatin vahingoittamia rotan aivokuoren solujen primääriviljelmiä [23] ja {{ 9}}OHDA:n aiheuttama vaurio PC12-soluissa [24]. Tulokset osoittivat, että PhG:illä oli sytoprotektiivinen vaikutus ja ne ovat potentiaalisia aineita hermostoa rappeuttavien sairauksien hoidossa. Tutkimukset ovat osoittaneet, että PhG:iden antioksidanttiset ominaisuudet ovat monien muiden näiden yhdisteiden bioaktiivisuuden taustalla [25]. Harvat tutkimukset ovat kuitenkin tutkineet PhG:iden molekyylimekanismia oksidatiivista toksisuutta vastaan.

Tutkimuksessamme valitsimme neljä tyypillistä PhG:tä seuraavasti: salidrosidi (fenyylietanolidisakkaridit), akteosidi (fenyylietanolidisakkaridit), isoakteosidi (fenyylietanoidisakkaridit) jaekinakosidi(fenyylietanolitrisakkaridit). Käytimme hermosolujen kuoleman mallia käyttämällä erilaistettuja PC12-soluja [26] tutkiaksemme PhG:iden suojaavaa vaikutusta ja molekyylimekanismia H2O2--indusoidussa PC12-solumallissa. Osoitimme, että PhG:t aktivoivat Nrf2/ARE-reitin sitoutumalla Kelchin kaltaiseen ECH-assosioituneeseen proteiiniin 1 (Keap1). Tämä prosessi lisäsi antioksidanttientsyymien toimintaa ja lisäsi PC12-solujen vastustuskykyä oksidatiiviselle stressille.

2. Tulokset

2.1. PhG:t estävät H2O2-indusoidun sytotoksisuuden PC12-soluissa

Testattiin H2O2:n ja PhG:iden (0,1,1,5 ja 10 卩g/ml) sytotoksiset vaikutukset PC12-soluihin. Tulokset osoittivat, että H2O2 aiheutti PC12-solujen elinkelpoisuuden menetyksen pitoisuudesta ja ajasta riippuvaisilla tavoilla (kuvio 1A). PC12-solujen altistuminen 200 H2O2:lle 2 tunnin ajan johti solujen elinkelpoisuuteen 57,4 prosenttia. Solujen esikäsittely PhG:illä pitoisuuksina 0,1, 1, 5 ja 10 -/ml ei vaikuttanut solujen elinkelpoisuuteen (kuva 1B) ja suojasi PC12-soluja huomattavasti H2O2--indusoidulta vauriolta parantamalla solujen elinkelpoisuutta. 9.549-22.141 prosenttia , 12.092-25.289 prosenttia , 1.470-9.289 prosenttia ja 3.411-11.441 prosenttia , vastaavasti (kuva 1C) . Kuitenkin salidrosidi (0,1 ^g/ml), isoakteosidi (0,1, 1, 5 ja 10 ^g/ml),ekinakosidi(0.1, 1 ja 5 ^g/ml) esikäsittely ei osoittanut merkittävää eroa HzOz-indusoidussa soluvauriossa. Solujen esikäsittely PhG:illä paransi myös H202:n indusoimaa morfologista ominaisuutta (kuvio 1D).

Kuva 1. PhG:t suppressoivat H2O2--indusoitua sytotoksisuutta PC12-soluissa. Solujen elinkelpoisuus havaittiin MTT-määrityksellä. H2O2:n (A) ja PhG:n (B) sytotoksinen vaikutus eri pitoisuuksilla PC12-soluihin. (C) PhG:t heikensivät H2O2--indusoitua solujen elinkelpoisuuden laskua. PC12-soluja inkuboitiin PhG:iden kanssa ({{10},1 ja 10 wg/ml) 24 tuntia, minkä jälkeen niitä inkuboitiin 200 pM H2O2:n kanssa toisen ajan. 2 tuntia PhG:iden poistamisen jälkeen. (D) Morfologinen havainto. Hoidon jälkeen soluja tarkkailtiin faasikontrastimikroskoopilla (x100), CK: normaali ryhmä, H2O2: H2O2:lla käsitelty ryhmä, HL: salidrosidilla pieniannoksista hoidettu ryhmä, HH: salidrosidilla suurella annoksella käsitelty ryhmä, ML: akteosidilla pieniannoksisesti käsitelty ryhmä, MH: akteosidilla suurella annoksella käsitelty ryhmä, IL: isoakteosidilla pienillä annoksilla käsitelty ryhmä, IH: isoakteosidilla suurella annoksella käsitelty ryhmä, SL: ekinakosidilla pieniannoksiseksi käsitelty ryhmä, SH: ekinakosidilla suurella annoksella käsitelty ryhmä. ** p < 0,01="" verrattuna="" käsittelemättömään="" ryhmään;="" #="" p="">< 0,05="" h202:lla="" käsiteltyä="" ryhmää="" vastaan;="" ##="" p="">< 0,01="" h202-käsiteltyyn="" ryhmään="">

2.2. PhG:t estivät H2O2-indusoitua ROS:n solunsisäistä kertymistä, lipidiperoksidaatiota (MDA) ja lisääntynyttä superoksididismutaasin (SOD) aktiivisuutta PC12-soluissa

PC12-solujen altistuminen 200 pM H2O2:lle 2 tunnin ajan nosti ROS-tasoja, MDA-pitoisuutta ja vähensi SOD-aktiivisuutta (kuva 2). PhGs-esikäsittely alensi ROS-tasoa, salidrosidia ja akteosidia, ja isoakteosidin ja ekinakosidin esikäsittelyn suuri annos alensi merkittävästi ROS-tasoa (p < 0,01).="" salidrosidin="" esikäsittely="" ei="" osoittanut="" vaikutusta="" mda-pitoisuuteen,="">akteosidiesikäsittely heikensi merkittävästi MDA-pitoisuutta (p < 0,05).="" isoakteosidi-="" ja="" ekinakosidiesikäsittely="" alensi="" merkittävästi="" mda-pitoisuutta="">

Kuva 2. PhG:t estivät ROS:n ja MDA:n kertymisen ja lisäsivät SOD:n aktiivisuutta PC12-soluissa. PC12-soluja inkuboitiin PhG:iden (0.1 ja 10 4g/ml) kanssa 24 tuntia ja sitten inkuboitiin 200 |^M H2O2:n kanssa vielä toisen ajan. 2 tuntia PhG:iden poistamisen jälkeen. (A) PhG:t estivät ROS:n ja MDA:n kertymisen. (B) PhG:t estivät MDA:n kertymisen. (C) PhG:t lisäsivät SOD:n aktiivisuutta. CK: normaali ryhmä, malli: H2O2 käsitelty ryhmä, salidrosidi: salidrosidilla käsitelty ryhmä, akteosidi: akteosidilla käsitelty ryhmä, isoakteosidi: isoakteosidilla käsitelty ryhmä, ekinakosidi: ekinakosidilla käsitelty ryhmä. ** p < 0,01="" vs.="" hoitamaton="" ryhmä;="" #="" p="">< 0,05="" vs.="" h202="" käsitelty="" ryhmä,="" ##="" p="">< 0,01,="" vs.="" h202="" käsitelty="">

2.3.PhG:n käänteinen H2O2-indusoitu apoptoosi PC12-soluissa

H2O2-käsittely (200 |1M) 2 tunnin ajan lisäsi merkittävästi apoptoosia PC12-soluissa, ja kokonaisapoptoottinen määrä oli jopa 16,02 prosenttia (kuva 3). Kuitenkin esikäsittely PhG:illä (0,1 ja 10 卩g/ml) 24 tunnin ajan vähensi apoptoosin nopeutta pitoisuudesta riippuvaisella tavalla (p < 0,01).="">akteosidi, isoakteosidi jaekinakosidivähensi merkittävästi solujen apoptoosin prosenttiosuutta 4.750-6.627 prosenttia, 4.413-5.800 prosenttia, 6.593-10.047 prosenttia ja 1.530-7. vastaavasti 510 prosenttia.

Kuva 3. PhG:t käänsivät H2O2--indusoidun apoptoosin PC12-soluissa. PC12-soluja inkuboitiin PhG:iden (0.1 ja 10 卩g/ml) kanssa 24 tuntia ja sitten inkuboitiin 200 pM H202:n kanssa vielä 2 tuntia sen jälkeen, kun PhG:t oli poistettu. Sitten apoptoosi mitattiin virtaussytometrillä käyttäen PI/FITC-fluoresoivaa koetinta.

CK: normaali ryhmä, malli: H2O2-käsitelty ryhmä, salidrosidi: salidrosidilla käsitelty ryhmä, akteosidi: akteosidilla käsitelty ryhmä, isoakteosidi: isoakteosidilla käsitelty ryhmä,Ekinakosidi: ekinakosidihoidettu ryhmä. ** p < {{0}},01="" vs.="" hoitamaton="" ryhmä;="" ##="" p="">< 0,01="" h202-käsiteltyyn="" ryhmään="">

2.4. PhGs lievitti H2O2-indusoitua Nrf2-ARE-polkujen säätelyhäiriötä PC12-soluissa

Nrf{0}}ARE-reitti, joka on yksi tärkeimmistä antioksidanttireiteistä useimmissa solutyypeissä, on tärkeä solujen kasvun ja solukuoleman säätelyssä. Siksi tutkimme, liittyykö Nrf2-ARE-reitti H2O2--indusoituun apoptoosiin immunofluoresenssi- ja Western blot -analyysillä käyttämällä spesifisiä vasta-aineita. Immunofluoresenssimääritys osoitti, että PhG:t (0,1 ja 10 pg/ml) indusoivat Nrf2:n tumatranslokaatiota (kuvio 4). Hoidon jälkeen PhGs, isoakteosidi jaekinakosidijohti solun normaalin morfologian osittaiseen palautumiseen. Tulokset Western blot -analyysistä ja harmaa tiheysanalyysistä osoittivat, että PhG:illä ({{0}},1 ja 10 pg/ml) ei ollut merkittävää vaikutusta Nrf2:n ilmentymiseen sytoplasmassa (kuva 5A, B) (p > {{20}},05), mutta lisääntynyt Nrf2-ekspressio ytimessä (kuvio 5C, D) (p < 0,01).="" sitten="" tutkimme="" nrf2:n="" roolia="" h2o2-indusoidussa="" apoptoosissa="" tuomalla="" nrf2="" sirna:ta.="" nrf2:n="" proteiinin="" ja="" mrna:n="" ilmentyminen="" väheni="" merkittävästi="" kaikissa="" nrf2-sirna:lla="" käsitellyissä="" ryhmissä="" (kuvio="" 5e-h).="" phg:t="" (0,1="" ja="" 10="" pg/ml)="" estivät="" h2o2--indusoidun="" sytotoksisuuden="" ryhmissä="" ilman="" nrf2-sirna-käsittelyä="" (p="">< 0,01),="" mutta="" tällainen="" suoja="" kumosi="" nrf2-sirna:lla.="" nrf2-sirna-käsittelyn="" jälkeen="" solujen="" elinkelpoisuus="" laski="" merkittävästi="" jopa="" phgs-käsittelyllä="" (kuvio="">

Kuva 5. PhG:iden suojaava vaikutus Nrf2:een H2O2-käsitellyissä PC12-soluissa. (A) Nrf2-proteiinin ilmentyminen sytoplasmassa havaittiin immunoblottauksella käyttämällä spesifistä vasta-ainetta. p-aktiinia käytettiin latauskontrollina. (B) Nrf2-proteiinin kvantitatiivinen densitometrinen analyysi sytoplasmassa. (C) Nrf2-proteiinin ilmentyminen tumassa havaittiin immunoblottauksella käyttämällä spesifistä vasta-ainetta. Histoneja H3 käytettiin latauskontrollina. (D) Tumassa olevan Nrf2-proteiinin kvantitatiivinen densitometrinen analyysi. (E, F) PC12-soluja esi-inkuboitiin ilman (E) tai (F) Nrf2 siRNA:n kanssa 24 tuntia, sitten inkuboitiin PhG:iden kanssa tai ilman (0.1 ja 10 昭/ml) 24 tuntia ja inkuboitiin H202:n kanssa vielä 2 tuntia sen jälkeen, kun PhG:t oli poistettu. Nrf2-proteiinin kokonaisekspressio havaittiin immunoblottauksella käyttämällä spesifistä vasta-ainetta, ja p-aktiinia käytettiin latauskontrollina. (G) Kokonais-Nf2-proteiinin kvantitatiivinen densitometrinen analyysi. (H) Nrf2-mRNA:n kvantitatiivinen analyysi. (I) PC12-soluja esi-inkuboitiin siRNA:n kanssa tai ilman sitä 24 tuntia, sitten inkuboitiin PhG:iden kanssa tai ilman niitä (0,1 ja 10 -/ml) 24 tuntia ja inkuboitiin H202:n kanssa vielä 2 tuntia PhG:iden poistamisen jälkeen. Käsittelyn jälkeen selviytymissolut määritettiin MTT-määrityksellä. CK: normaali ryhmä, malli: H2O2 käsitelty ryhmä, kontrolli Si: kontrolli siRNA käsitelty ryhmä, SiRNA Negatiivinen: ilman siRNA käsitelty ryhmä, SiRNA positiivinen: SiRNA käsitelty ryhmä, salidrosidi: salidrosidilla käsitelty ryhmä, akteosidi: akteosidilla käsitelty ryhmä, isoakteosidi: isoakteosidilla käsitelty ryhmä,Ekinakosidi: ekinakosidilla käsitelty ryhmä. ** p < {{0}}.01="" vs.="" hoitamaton="" ryhmä;="" #="" p="">< 0.05,="" vs.="" h2o2-käsitelty="" ryhmä="" (ilman="" nrf2-sirna-käsiteltyä),="" ##="" p="">< 0,01,="" vs.="" h202-käsitelty="" ryhmä="" (ilman="" nrf2-sirna-käsiteltyä);="" &="" p="">< 0,05="" vs.="" h202-käsitelty="" ryhmä="" (käsitelty="" nrf2-sirna:lla)="" ja="" p="">< 0,01="" vs.="" h202-käsitelty="" ryhmä="" (käsitelty="">

2.4. PhG:t käänsivät H2O2-indusoidun HO-1:n, NQO1:n, GCLC:n ja GCLM:n proteiinin ilmentymisen heikkenemisen

HO{{0}}, NQO1 ja glutamaatti-kysteiiniligaasi (GCL) ovat tärkeitä solun antioksidanttientsyymejä, ja HO-1, NQO1 ja GCL:n katalyyttiset tai modifioivat alayksiköt (GCLC tai GCLM) ovat Nrf{5}}säädellyt alavirran geenit [27]. Hoidon jälkeen havaittiin HO-1:n, NQO1:n, GCLC:n ja GCLM:n proteiiniekspressio. Ilmeinen ero havaittiin HO-1:n ja NQO1:n proteiiniekspression välillä H2O2:n kanssa tai ilman sitä (kuvio 6A-C) (p < 0.01).="" phg:t="" (0.1="" ja="" 10="" p^g/ml)="" kumosivat="" h2o2--indusoidun="" ho-1-proteiinin="" ilmentymisen="" heikkenemisen="" (paitsi="" salidrosidissa="" {{32}="" },1="" pg/ml),="" nqo1="" (paitsi="" akteosidi="" arvossa="" 0,1="" pg/ml)="" (p="">< 0,01).="" h202="" vähensi="" myös="" gclc-="" ja="" gclm-proteiinin="" ilmentymistä="" (p="">< 0,05)="" (kuvio="" 6a,="" d,="" e).="" phg:t="" (0,1="" ja="" 10="" pg/ml)="" kumosivat="" h2o2--indusoidun="" gclc:n="" proteiinin="" ilmentymisen="" alasäätelyn="">ekinakosidi{{0}},1 pg/ml) (p < 0.01)="" ja="" gclm="" (paitsi="" salidrosidi="" 0,1="" pg/ml)="" (="" p="">< 0.01).="" sitten="" ho-1:n="" kemiallisia="" inhibiittoreita="" käytettiin="" arvioimaan="" edelleen="" antioksidanttientsyymien="" roolia="" phg:iden="" suojan="" säätelyssä="" h2o2--indusoitua="" sytotoksisuutta="" vastaan.="" phg:t="" (0,1="" ja="" 10="" pg/ml)="" estivät="" h2o2--indusoidun="" sytotoksisuuden,="" mutta="" ho-1-inhibiittori="" znpp="" (p="">< 0,01)="" kumosi="" tällaisen="" suojaavan="" vaikutuksen="" pitoisuudella="" 20="" pm="" (kuva="" 6f,="" p="">< 0,01)="">

2.5. Keap1 Expression ja Molecular Docking Analysis

Fysiologisissa olosuhteissa Keap1 toimii Nrf2:n repressoriproteiinina sitoutumalla Nrf2:n Neh2-domeeniin ja kohdistamalla Nrf2:n Cul3--pohjaiseen E3-ubikvitiiniligaasiin ubikvitinaatiota ja myöhempää hajoamista varten 26S-proteasomin toimesta [28]. Sitoutumiskykyä PhG:iden Keap1:een arvioitiin molekyylitelakointianalyysillä niiden antioksidanttisen vaikutuksen mekanismin tutkimiseksi.

3. Keskustelu

Tutkimme PhG:iden hermosuojausta H2O2:n aiheuttamasta sytotoksisuudesta PC12-soluissa. Tulokset osoittavat, että PhG:iden esikäsittely vähensi merkittävästi HzOz:n aiheuttamaa sytotoksisuutta, heikensi solunsisäistä ROS-tasoa, paransi solunsisäisten antioksidanttientsyymien tasoa ja lopulta käänsi H2O2--indusoidun sytotoksisuuden PC12-soluissa. Lisäksi PhG:t lisäsivät Nrf2:n transkriptionaalista aktivaatiota, kumosivat HzOz:n aiheuttaman HO-1:n, NQO1:n, GCLC:n ja GCLM:n proteiiniekspression alenemisen. Lisäksi PhG:t osoittivat mahdollista vuorovaikutusta Nrf2-sitoutumiskohdan kanssa Keap1-proteiinissa.

H2O2--indusoidussa PC12-soluvauriossa lipidiperoksidaatio, joka viittaa lipidien oksidatiiviseen hajoamiseen, lisäsi kalvojen läpäisevyyttä, mikä johti soluvaurioihin [29]. MDA:n muodostumista käytetään laajalti lipidiperoksidaatioindeksinä [30]. H2O2 lisäsi ROS-tuotantoa ja uupunut antioksidanttipuolustusentsyymit, kuten SOD, katalaasi ja GPx. Tämä prosessi johtaa oksidatiiviseen stressiin [31], jolla on keskeinen rooli useimpien neurodegeneratiivisten sairauksien syy-yhteydessä ja etenemisessä. Aiempien tutkimusten mukaisesti havaitsimme kohonneen ROS-tason, vähentyneen solunsisäisen antioksidanttientsyymin ja PC12-solujen lisääntyneen apoptoosin H2O2-hoidon jälkeen. PhGs-esikäsittely heikensi merkittävästi HzOz:n aiheuttamaa solunsisäisen ROS:n kasvua, paransi solunsisäisiä antioksidanttientsyymejä ja lopulta käänsi HzOz:n aiheuttaman sytotoksisuuden PC12-soluissa.

Kuang et ai. [32] kertoi siitäekinakosidiosoitti merkittävää neuroprotektiivista vaikutusta H2O2--indusoituun sytotoksisuuteen PC12-soluissa mitokondrioiden apoptoottisen reitin kautta. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että ekinakosidilla, salidrosidilla, akteosidilla ja isoakteosidilla oli hermostoa suojaavia vaikutuksia tehostamalla PC12-solujen antioksidanttiaktiivisuutta, koska ne lisäsivät Nrf2:n transkriptionaalista aktivaatiota ja säätelevät HO-1:n, NQO1:n alavirran proteiiniekspressiota, GCLC ja GCLM. Lukuisat tutkimukset ovat selvästi osoittaneet, että Nrf2-kohdegeenien, erityisesti HO-1, aktivaatio astrosyyteissä ja hermosoluissa suojaa voimakkaasti tulehdukselta, oksidatiiviselta vauriolta ja solukuolemalta. HO-1-järjestelmän on raportoitu olevan erittäin aktiivinen keskushermostossa, ja sen modulaatiolla on ilmeisesti ratkaiseva rooli neurodegeneratiivisten häiriöiden patogeneesissä [33]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat myös selventäneet Nrf2:n roolia PD:n etenemisessä ja riskissä [9] ja Keap1:n tehokkaana kohteena Nrf2:n uudelleenaktivaatiossa AD:ssa [34]. Tulokset tukevat uutta näyttöä Nrf2:sta terapeuttisena kohteena hermoston rappeutumissairauksissa.

Molekyylitelakointianalyysi osoitti, että PhG:t voivat sitoutua Keap1:een seuraavilla sitoutumiskapasiteetilla:ekinakosidi>isoakteosidi > akteosidi > salidrosidi. Näiden tulosten mukaisesti PhG:iden esikäsittely johti Nrf2-ytimen translokaatioon seuraavan Nrf2-ilmentymän ytimessä:ekinakosidi>isoakteosidi * akteosidi > salidrosidi. Oletimme, että glykosidien määrä vaikutti PhG:iden ja Keap1:n mahdolliseen sitoutumismuotoon, ja sitoutumismuoto aiheutti edelleen Nrf2:n vapautumisen Keap1:stä. Tämä prosessi johti Nrf2:n ja alavirran geenien aktivoitumiseen ja viime kädessä suojaa PC12-soluja H2O{6}}-indusoidulta oksidatiiviselta stressiltä.

4. Materiaalit ja menetelmät

4.1. Kemialliset yhdisteet ja reagenssit

Salidrosidi (CAS-nro 10338-51-9), akteosidi (CAS-nro 61276-17-3), isoakteosidi (CAS-nro 61303-13-7) jaekinakosidi(CAS-nro {{0}}) ostettiin YYuanye Biotechnology Companylta (Shanghai, Kiina). PhG:t liuotettiin PBS:ään 10 mg/ml varastoliuoksen tuottamiseksi, jota säilytettiin -20 asteessa. H202 ostettiin yhtiöltä Aladdin® (Shanghai, Kiina). RPMI-1640-elatusaine ja sikiön naudan seerumi ostettiin Hyclonelta (Logan, UT, USA) ja 0,5 prosentin trypsiini-EDTA, penisilliini ja streptomysiini ostettiin Keyistä (Hangzhou, Kiina). MDA, SOD-diagnostiikkasarjat, MTT ja DCFH-DA ostettiin Beyotime Institute of Biotechnologysta (Nanjing, Jiangsu, Kiina). Anneksiin V-FITC/PI kaksoisvärjäyssarja ostettiin Solarbio Life Sciencesilta (Peking, Kiina). Vasta-aineet Nrf2:lle, Histone H3:lle, Keap1:lle, HO-1:lle, NQO1:lle, GCLC:lle, GCLM:lle ja p-aktiinille, anti-hiiri-piparjuuriperoksidin (HRP) IgG:lle ja anti-kani-HRP-IgG:lle ostettiin Abcamilta. (Lontoo, Iso-Britannia). HO-1:n ja ZnPP:n estäjät ostettiin Sigma Chemical Co.:lta (St. Louis, MO, USA). RNAiso Plus, PrimeScript™RT-reagenssipakkaus gDNA Eraserilla ja SYBR® Premix Ex Taq™ II ostettiin Takaralta (Shiga, Japani). Lipofectamine® RNAiMAX Transfection Reagent ostettiin Thermo Fisher Scientificilta (Waltham, UK). Nrf2 siRNA-sekvenssit olivat seuraavat: eteenpäin, CCGAAUUACAGUGUCUUAA; ja taaksepäin, UUAAGACACUGUAAUUCGG. Sillä välin kontrolli-siRNA-sekvenssit olivat seuraavat: eteenpäin, UUCUCCGAACGUGUCACGU; ja taaksepäin, ACGUGACACGUUCGGAGAA.

4.2. Soluviljely

Hiiren lisämunuaisen feokromosytoomalinja (PC12-solut) saatiin Institute of Biochemistry and Cell Biology, SIBS:stä (CAS, Shanghai, Kiina). Soluja pidettiin RPMI-1640:ssa (Hyclone), joka sisälsi 10 prosenttia naudan sikiön seerumia (Hyclone), 100 U/ml penisilliiniä ja 0,1 mg/ml streptomysiiniä 37 asteessa 5 prosentin CO2:n kanssa. Väliaine vaihdettiin joka toinen päivä.

4.3. Solujen elinkelpoisuusmääritys

PC12-solut kylvettiin 96-kuoppalevyille 2 x 104 solua/kuoppa. Kiinnittymisen jälkeen soluja esi-inkuboitiin inhibiittorin kanssa tai ilman sitä 20 minuuttia, inkuboitiin PhG:iden kanssa tai ilman niitä 24 tuntia ja sitten inkuboitiin H202:n kanssa vielä 2 tuntia sen jälkeen, kun PhG:t oli poistettu. Inkuboinnin jälkeen soluja käsiteltiin 5 mg/ml MTT:llä 4 tuntia 37 °C:ssa, ja väliaineet poistettiin varovasti. Formatsaanikiteet, jotka olivat muodostuneet selviytyneistä soluista, liuotettiin 150 rl:aan DMSO:ta sinisen värin muodostamiseksi [35], ja absorbanssi mitattiin 570 nm:ssä levynlukijalla. Kontrollit käyttivät samaa elatusainepitoisuutta pelkän DMSO:n kanssa. Solujen elinkelpoisuus normalisoitiin kontrollin prosenttiosuutena.

PhG:iden pitoisuudet (0,1, 1,5 ja 10 Rg/ml) valittiin PhG:iden sytotoksisuusanalyysin ja ekinakosidin raportoidun sytoprotektiivisen vaikutuksen mukaan [32]. Raportin mukaan sytotoksisuusvaikutusta ei havaittu alle 10 Rg/ml, ja ekinakosidin ilmoitettiin osoittavan sytoprotektiivista vaikutusta HzOz-vaurioituneessa solumallissa.

4.4. Apoptoosimääritys

Apoptoosi havaittiin Annexin V-FITC/PI-kaksoisvärjäyssarjalla (Solarbio). PC12-solut kylvettiin 6-kuoppalevyille tiheydellä 2 x 105 solua/kuoppa. Kiinnittämisen jälkeen soluja käsiteltiin PhG:illä (0,1 ja 10 Rg/ml) 24 tuntia ja inkuboitiin H202:n kanssa vielä 2 tuntia sen jälkeen, kun PhG:t oli poistettu. Inkuboinnin jälkeen solut pestiin kylmässä PBS:ssä, sentrifugoitiin kahdesti nopeudella 1500 rpm 10 minuuttia ja suspensoitiin uudelleen 500 rl:aan sitoutumispuskuria. FITC-leimattu Annexin V (5 rL) ja propidiumjodidi.

4.5. Solunsisäisen ROS:n, MDA-tuotannon ja SOD:n mittaus

Solunsisäinen ROS-taso määritettiin käyttämällä ROS-herkkää fluoresoivaa koetinta, nimittäin 2,7-diklooridihydrofluoresoivaa diasetaattia (DCFH-DA). PC12-solut kylvettiin 6-kuoppalevyille tiheydellä 2 x 105 solua/kuoppa. Kiinnittymisen jälkeen soluja käsiteltiin PhG:illä (0,1 ja 10 µg/ml) 24 tuntia ja inkuboitiin H202:n kanssa vielä 2 tuntia sen jälkeen, kun PhG:t oli poistettu. Inkuboinnin jälkeen solut pestiin PBS:llä kolmesti ja inkuboitiin sen jälkeen 10 uM DCFH-DA:n kanssa. 37 asteessa 20 minuutin inkuboinnin jälkeen solut pestiin PBS:llä ja kerättiin hellävaraisella sentrifugoinnilla. Solunsisäinen ROS mitattiin käyttämällä Gallios™-virtaussytometriä (Beckman Coulter, Brea, CA, USA).

MDA ja SOD mitattiin määrityssarjoilla (Beyotime Biotechnology, Nanjing, Jiangsu, Kiina). Kaikki menettelyt ovat täysin valmistajien ohjeiden mukaisia. MDA- ja SOD-pitoisuudet normalisoitiin vastaavalla kokonaisproteiinipitoisuudella.

4.6. Nrf2 Nuclear Translocation Immunofluorescence

PC12-solut kylvettiin 6-kuoppalasilevyille tiheydellä 2 x 105 per kuoppa. Kiinnittymisen jälkeen soluja käsiteltiin PhG:illä (0,1 ja 10 卩g/ml) 24 tuntia ja inkuboitiin H202:n kanssa vielä 2 tuntia sen jälkeen, kun PhG:t oli poistettu. Inkuboinnin jälkeen solut pestiin kylmässä PBS:ssä ja kiinnitettiin 4-prosenttisessa paraformaldehydissä 15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen suoritettiin kalvon läpäisevyys käyttämällä 0,5-prosenttista Triton X-100:a PBS:ssä 5 minuutin ajan. Soluja inkuboitiin anti-Nrf2 Rabbit IgG:n (Abcam) kanssa 5 prosentin FBS:n kanssa yön yli 4 °C:ssa. Sitten sekundaariset anti-kanin vasta-aineet, jotka oli konjugoitu FITC:hen, levitettiin soluille 20 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Tumat värjättiin 4z,6-diamidino-2-fenyyli-indolilla (DAPI) viimeisessä valmistusvaiheessa. Objektilasit huuhdeltiin lyhyesti PBS:llä, ilmakuivattiin ja kiinnitettiin antifluoresenssiin haalistuvaan väliaineeseen. Objektilasit visualisoitiin laserkonfokaalimikroskoopilla (LMS780, Zeiss, Saksa).

4.7. Proteiinin uuttaminen

PC12-solut kylvettiin 100 mm:n maljoille 1 x 107 solua/malja. Kiinnittymisen jälkeen soluja käsiteltiin PhG:illä (0,1 ja 10 µg/ml) 24 tuntia ja sitten inkuboitiin H202:n kanssa vielä 2 tuntia PhG:t poistaen. Inkuboinnin jälkeen solut pestiin kahdesti kylmällä PBS:llä ja kaavittiin maljoilta 1000 ul:lla PBS:ää. Soluhomogenaatteja sentrifugoitiin nopeudella 1500 rpm 10 minuuttia. Käsittelyn jälkeen soluproteiinit uutettiin käyttämällä Beyotime RIPA -solulyysipuskuria 1 mM PMSF:n kanssa valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lisäksi sytoplasmiset ja tumaproteiinit eristettiin, kuten on kuvattu Beyotimen ydin- ja sytoplasmauuttopakkauksessa. Näytteiden proteiinipitoisuus havaittiin Beyotimen BCA-proteiinimäärityssarjalla, ja kaikki näytteet säilytettiin -80 asteessa Western blot -analyysiä varten.

4.8 Western blot -analyysi

Western blot -analyysi suoritettiin käyttämällä standardimenetelmiä. Lyhyesti sanottuna proteiininäytteet (20 tai 30 ug) erotettiin SDS-PAGE:lla ja siirrettiin PVDF-kalvoille. Kalvot estettiin 5-prosenttisessa maito-TBST:ssä ja inkuboitiin yön yli 4 asteessa primaarisessa vasta-aineessa. Käytetyt vasta-aineet olivat Nrf2 (Abcam), Keap1 (Abcam), HO-1 (Abcam), NQO-1 (Abcam), GCLC (Abcam), GCLM (Abcam), Histone H3 (Abcam) ja p-aktiini (Abcam). Toissijaisena vasta-aineena käytettiin peroksidaasikonjugoitua anti-hiiri-IgG:tä (Abcam) tai anti-kanin IgG:tä (Abcam). Proteiininauhat visualisoitiin käyttämällä ChemiScope-sarjaa (Clinx Science Instruments, Shanghai, Kiina). Proteiinivyöhykkeiden harmaaarvo määritettiin käyttämällä ImageJ:tä (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA).

4.9. Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR

Kokonais-RNA uutettiin käyttämällä RNAiso Plus -laitetta (Takara, Shiga, Japani) noudattaen valmistajan ohjeita. Kokonais-RNA-näytteet käänteiskopioitiin PrimeScript™RT-reagenssisarjalla, jossa oli gDNA Eraser (Takara, Shiga, Japani) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttämällä SYBR® Premix Ex Taq™ II:ta (Takara, Shiga, Japani) Applied Biosystems ViiA™ 7 Real-Time PCR Systemissä. Kohdegeenien suhteellinen ilmentyminen normalisoitiin p-aktiiniksi ja analysoitiin 2-AACt-menetelmällä. Alukesekvenssit Nrf2:lle olivat seuraavat: eteenpäin, ACAGTGCTCCTATGCGTGAA ja käänteinen, TCTGGGCGGCGACTTTAT. p-Aktiinin alukesekvenssit olivat seuraavat: eteenpäin, GCTGTCCCTGTATGCCTCT; ja taaksepäin, TTGATGTCACGCACGATTT.

4.10. siRNA-transfektio

PC12-soluja viljeltiin 6-kuoppalasilevyillä tiheydellä 2 x 105 kuoppaa kohti (Western blot -analyysiä varten) tai 96-kuoppalasilevyillä tiheydellä 2 x 104 kuoppaa kohti (soluille elinkelpoisuusanalyysi). Kontrolli-siRNA ja Nrf2 siRNA transfektoitiin soluihin käyttämällä Lipofectamine RNAiMAXia (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. 24 tunnin inkubaation jälkeen soluja käsiteltiin PhG:illä ja H202:lla tai ilman niitä ilmoitettujen aikojen ajan ja sitten niitä käytettiin Western blot -analyysissä, qRT-PCR:ssä tai solujen elinkelpoisuusanalyysissä, kuten edellä on kuvattu.

4.11 Molecular Docking Analysis

Molecular docking analysis was performed to investigate the possible binding mode of PhGs to Keap1. The 3D structure of ligands was obtained from NCBI. The crystallized structure of Keap1 (PDB Code: 4L7B) was prepared using correcting structure issues (such as break bond and miss loop) using SYBYL-X 2.0. In this software simulation, crash represents the inadequate penetration between the protein and the ligand. Polar represents the hydrogen bonding and electrostatic interactions between the protein and the ligand. G-score [36] represents the hydrogen bonding, complex (ligand-protein), and internal (ligand-ligand) energies between the protein and the ligand. PMF-score [37] represents the Helmholtz free energy between the protein and the ligand. D-score [38] represents the charge and van der Waals interactions between the protein and the ligand. Chem-score [39] represents the hydrogen bonding, metal-ligand interaction, lipophilic contact, and rotational entropy, along with an intercept term between the protein and the ligand. C score represents the consensus score between the protein and the ligand, comprehensively reflecting the G, PMF, D, and Chem-scores. Tota-score reflects the binding capacity of the ligand to the protein. The best modes were generated and evaluated using the Total-score (>6) and C-score (>4).

4.12 Tilastollinen analyysi

Tiedot analysoitiin käyttämällä yksisuuntaista ANOVAa ja LSD-analyysejä käyttäen SPSS:ää. Kaikki tulokset vahvistettiin kolmesta riippumattomasta kokeesta. Tiedot ilmaistiin keskiarvoina 土 SD. Tilastollisesti merkitseviä eroja otettiin huomioon p <>

Kiitokset: Tätä tutkimusta tukivat Kiinan kansallinen suuri tutkimus- ja kehitysohjelma (nro 2017YFD0400200), Kiinan Zhejiangin maakunnan luonnontieteellinen säätiö (nro R15C200002) ja maataloustuotteiden laadun turvallisuusriskin arviointiprojekti (nro. GJFP2018015), Kiinan maatalous- ja maaseutuministeriö.

Tekijän panokset:Baiyi Lu ja Maiquan Li suunnittelivat tutkimuksen. Maiquan Li suoritti laboratoriotyöt, data-analyysin ja kirjoitti paperin. Maiquan Li, Tao Xu, Fei Zhou, Mengmeng Wang, Huaxin Song, Xing Xiao ja Baiyi Lu tarkistivat käsikirjoituksen.

1 National Engineering Laboratory of Intelligent Food Technology and Equipment,

Maatalous- ja maaseutuministeriön maataloustuotteiden sadonkorjuun jälkeisen käsittelyn avainlaboratorio, maatalous- ja maaseutuministeriön maataloustuotteiden ravitsemusarvioinnin avainlaboratorio, Zhejiangin maatalouselintarvikkeiden jalostuksen avainlaboratorio, Fuli Food Science -instituutti, Biosysteemien korkeakoulu Tekniikka ja elintarviketiede, Zhejiangin yliopisto, Hangzhou 310058, Kiina;

2 College of the First Clinical Medical, Guangzhoun kiinalaisen lääketieteen yliopisto,

Viitteet

1. Sun, AY; Chen, YM Oksidatiivinen stressi ja neurodegeneratiiviset häiriöt. J. Biomed. Sci. 1998, 5, 401-414.

2. Maheshwari, A.; Misro, MM; Aggarwal, A.; Sharma, RK; Nandan, D. H202:n indusoiman kivesten sukusolujen apoptoosin mukana olevat reitit. FEBS J. 2009, 276, 870-881.

3. Halliwell, B. Reaktiiviset happilajit ja keskushermosto. J. Neurochem. 1992, 59, 1609-1623.

4. Richardson, JS; Subbarao, KV; Ang, LC Raudan aiheuttaman vapaiden radikaalien peroksidaation mahdollisesta roolista hermoston rappeutumisessa Alzheimerin taudissa. Ann. NY Acad. Sci. 1992, 648, 326-327.

5. Zhang, DD Mekanistiset tutkimukset Nrf2-Keap1-signalointireitistä. Drug Metab. Rev. 2006, 38, 769-789.

6. Itoh, K.; Tong, KI; Yamamoto, M. Molekyylimekanismi, joka aktivoi Nrf2-Keap1-reitin elektrofiilien adaptiivisen vasteen säätelyssä. Vapaa Radic. Biol. Med. 2004, 36, 1208-1213.

7. Kong, AN; Owuor, E.; Yu, R.; Hebbar, V.; Chen, C.; Hu, R.; Mandlekar, S. Ksenobioottisten entsyymien induktio karttakinaasireitillä ja antioksidantti- tai elektrofiilivasteelementillä (ARE/EpRE). Drug Metab. Rev. 2001, 33, 255-271.

8. Buendia, I.; Michalska, P.; Navarro, E.; Gameiro, I.; Egea, J.; Leon, R. Nrf{1}}ARE-polku: Nouseva kohde oksidatiivista stressiä ja hermotulehdusta vastaan ​​hermoston rappeutumissairauksissa. Pharmacol. Siellä. 2016, 157, 84-104. [CrossRef] [PubMed]

9. Skibinski, G.; Hwang, V; Ando, ​​DM; Daub, A.; Lee, AK; Ravisankar, A.; Modan, S.; Finucane, MM; Shabby, BA; Finkbeiner, S. Nrf2 lieventää LRRK2-- ja a-synukleiinin aiheuttamaa hermoston rappeutumista moduloimalla proteostaasia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2016, 114, 1165-1170.

10. Jimenez, C.; Riguera, R. Fenyylietanoidiglykosidit kasveissa: rakenne ja biologinen aktiivisuus. Nat. Tuot. Rep. 1994, 11, 591-606.

11. Georgiev, M.; Alipieva, K.; Orhan, I.; Abrashev, R.; Denev, P.; Angelova, M. Verbascum xanthophoeniceum Grisebin antioksidantit ja koliiniesteraasit estävät toimet. ja sen fenyylietanoidiglykosidit. Food Chem. 2011, 128, 100-105.

12. Li, N.; Wang, J.; Ma, J.; Gu, Z.; Jiang, C.; Yu, L.; Fu, X. Neuroprotective Effects of Cistanches Herba Therapy potilailla, joilla on kohtalainen Alzheimerin tauti. Evid.-pohjainen täydennys. Altern. Med. 2015, 2015, 103985.

13. Liu, YL; Hän, WJ; Mo, L.; Shi, MF; Zhu, YY; Pan, S.; Li, XR; Xu, QM; Yang, SL Monochasma savatieri Franchin fenyylietanoidiglykosidien antimikrobiset, anti-inflammatoriset vaikutukset ja toksikologia. entinen Maxim. J. Ethnopharmacol. 2013,149, 431-437.

14. Dong, Q.; Yao, J.; Fang, JN; Ding, K. Cistanche deserticola YC Ma:n kahden kylmällä vedellä uutettavan polysakkaridin rakenteellinen karakterisointi ja immunologinen aktiivisuus. Hiilihydraatti. Res. 2007, 342, 1343-1349.

15. Xiong, L.; Mao, S.; Lu, B.; Yang, J.; Zhou, F.; Hu, Y.; Jiang, Y.; Shen, C.; Zhao, Y. Osmanthusfragransin kukkauute ja akteosidi suojaavat d-galaktoosin aiheuttamalta ikääntymiseltä ICR-hiirimallissa. J. Med. Ruoka 2016, 19, 54-61.

16. Jiang, Y.; Mao, S.; Huang, W.; Lu, B.; Cai, Z.; Zhou, F.; Li, M.; Lou, T.; Zhao, Y. Osmanthusfragrans Lourin fenyylietanoidiglykosidiprofiilit ja antioksidanttiaktiivisuus. Kukat UPLC/PDA/MS:n ja simuloidun ruoansulatusmallin mukaan. J. Agric. Food Chem. 2016, 64, 2459-2466.

17. Li, X.; Kyllä, X.; Li, X.; Sun, X.; Liang, Q.; Tao, L.; Kang, X.; Chen, J. Salidroside suojaa MPP plus -indusoitua apoptoosia vastaan ​​PC12-soluissa estämällä NO-reittiä. Brain Res. 2011, 1382, 9-18.

18. Zhang, L.; Ding, W.; Sun, H.; Zhou, Q.; Huang, J.; Li, X.; Xie, Y.; Chen, J. Salidroside suojaa PC12-soluja MPP plus -indusoidulta apoptoosilta aktivoimalla PI3K/Akt-reittiä. Food Chem. Toxicol. 2012, 50, 2591-2597.

19. Sheng, GQ; Zhang, JR; Pu, XP; Ma, J.; Li, CL Verbaskosidin suojaava vaikutus 1-metyyli-4--fenyylipyridinium-ionin aiheuttamaan neurotoksisuuteen PC12-soluissa. euroa J. Pharmacol. 2002, 451, 119-124.

20. Wang, H.; Xu, Y.; Yan, J.; Zhao, X.; Sun, X.; Zhang, Y.; Guo, J.; Zhu, C. Acteoside suojaa ihmisen neuroblastooma SH-SY5Y -soluja beeta-amyloidin aiheuttamalta soluvauriolta. Brain Res. 2009, 1283, 139-147.