PGC-1 estää NLRP3-tulehdusta säilyttämällä mitokondrioiden elinkelpoisuuden suojellakseen munuaisfibroosia
Dec 15, 2023
JOHDANTO
Krooninen munuaissairaus(CKD) on maailmanlaajuinen terveysongelma, ja sen esiintyvyys on kasvanut maailmanlaajuisesti [1–3].CKD-potilaatheillä on lisääntynyt riski edetä loppuvaiheen munuaissairaudeksi ja kuolleisuuteen [4, 5]. Siksi on tärkeää löytää tehokkaat terapeuttiset kohteet, joilla estetäänCKD:n eteneminen. Munuaisten tubulointerstitiaalinentulehdus ja fibroosiovat keskeisiä patologisia tunnusmerkkejäCKD:n eteneminen[6–8]. Munuaisten tubulaariset epiteelisolut(RTEC) ovat välttämättömiä nesteen ja elektrolyyttien homeostaasin ylläpitämiselle ja muodostavat 90 % munuaisten massasta. RTEC:t turvaavat runsaasti mitokondrioita ja niillä on korkeat tasot peroksisomaalisen proliferaattorin aktivoimia reseptori- (PPAR) ja peroksisomaalisia proliferaattori-koaktivaattoreita-1 (PGC-1), jotka täyttävät metabolisen ja toiminnallisen energiantarpeensa [9]. Kasvavat todisteet viittaavat siihen, että mitokondrioiden toimintahäiriö, jolle on ominaista lukumäärän väheneminen ja cristaen depolarisaatio, turvotus ja hajoaminen, myötävaikuttaa suuresti munuaisfibroosiin [10, 11]. Vaurioituneet mitokondriot eivät tuota tehokkaasti adenosiinitrifosfaattia (ATP) ja vapauttaa liikaareaktiiviset happilajit(ROS) ja mitokondriaalinen DNA (mtDNA), jotka tämän seurauksena laukaisevat alavirran tulehdusvasteita ja johtavat solukuolemaan ja tubulusvaurioon.
NOD:n kaltainen reseptoriperheen pyriinidomeenia sisältävä 3 (NLRP3) osallistuu erilaisiin isännän synnynnäisiin immuunivasteisiin mikrobiaalisille ja ei-mikrobiaalisille ärsykkeille [12, 13]. Useat patogeenit ja endogeeniset vaarasignaalit, jotka vapautuvat vaurioituneista ja kuolevista soluista, aktivoivat NLRP3:n ja muodostavat proteiinikompleksin, jota kutsutaan "inflammasomiksi" [14]. NLRP3-inflammasomi indusoi sitten kaspaasin-1 automaattisen prosessoinnin ja aktivoitumisen, mikä johtaa prosytokiinien pilkkoutumiseen kypsiksi IL-1- ja IL-18-soluiksi. Viime aikoina NLRP3-tulehdus on osallisena munuaisvaurion ja fibroosin patogeneesissä [15–17]. Erilaisissa munuaissairauksien eläinmalleissa NLRP3-tulehdusreitti aktivoituu ja sen lopputuotteet, IL-1 ja IL-18, voivat aiheuttaa munuaistiehyiden vaurioita [16–19]. Mielenkiintoista on, että munuaisten sisäiset solut, kuten RTEC:t ja podosyytit, ekspressoivat NLRP3:a, mikä viittaa NLRP3-tulehdussignaalin mahdolliseen rooliin soluvauriossa [20, 21]. Lisäksi viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet mahdollisen vuorovaikutuksen mitokondrioiden toimintahäiriön ja NLRP3-tulehdusaktivaation välillä munuaistiehyiden vauriomalleissa [22–24]. Ei kuitenkaan tiedetä, voiko PGC-1, keskeinen mitokondrioiden biogeneesin säätelijä, säädellä NLRP3-reittiä mitokondrioiden dynamiikkaa moduloimalla.
Siten tutkimme PGC-1 roolia NLRP3-tulehdusaktivaation säätelyssä RTEC:issä. Erityisesti tutkimme voiko PGC:n -1 aktivoitumisen tai suppression aiheuttama muuttunut mitokondrioiden elinkelpoisuus ja dynamiikka säädellä NLRP3-tulehdusreittiä ja sitenvaikuttaa munuaisvaurioon.
Wecistanchen tukipalvelu - Kiinan suurin vesisäiliön viejä:
Sähköposti:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Puhelin:+86 15292862950
Osta lisätietoja teknisistä tiedoista:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
SANA LUONNOLLISTA ORGAANIISTA KISTANKSIUUTEET, JOKA SISÄLTÄ 25 % KINAKOOSIDEA JA 9 % AKTEOSIDIA MUNUAINEN TUTTUTUKSEEN
MENETELMÄT
Soluviljelmät, TGF- 1-, PGC-1-aktivaattorin käsittely ja transfektio primaarisiin RTEC-soluihin RTEC:t eristettiin C57BL/6-hiiristä. Lyhyt menetelmä on kuvattu kohdassa Täydentävät menetelmät. Subkonfluentteja RTEC-soluja FBS-rajoitettiin 24 tunnin ajan, minkä jälkeen väliaine korvattiin 1-prosenttisella FBS DMEM-elatusaineella kontrolliryhmässä ja samalla elatusaineella TGF- 1 (5 ng/ml) (R&D Systems, Minneapolis, MN , USA) TGF- 1-ryhmälle. RTEC:t kerättiin RNA- ja proteiinianalyysejä varten 48 tuntia elatusainevaihdon jälkeen. PGC-1-aktivaattori, metformiini (1 mM) käsiteltiin sekä kontrolli- että TGF- 1-ryhmissä. Lääkeannokset määritettiin aikaisempien testiemme perusteella. Lisäksi solut transfektoitiin myös Ppargcla-plasmidilla (1 ug) (Addgene, Cambridge, MA, USA) ja Ppargcla pienellä häiritsevällä RNA:lla (siRNA) käyttämällä Lipofectamine 2000- ja Plus-reagensseja (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Seuraavaksi, 6 tuntia transfektion jälkeen, elatusaine vaihdettiin seerumittomaan väliaineeseen ja soluja inkuboitiin vielä 48 tuntia. Drp1:n ilmentymisen estämiseksi tuhoamme Drp1-geenin lentiviruksella, joka sisältää Drp1:n, joka kohdistuu lyhyeen hiusneula-RNA:han (shRNA) infektoidaksemme RTEC:itä (ystävällisesti lahjaksi Dr. Yu J:ltä, Yonsei University College of Medicine) [25]. Tutkiaksemme edelleen NLRP3-tulehduksen ja mitokondriovaurion välistä suhdetta saimme myös RTEC:t Nlrp3-poistohiiriltä (ystävällisesti lahjakkaita tohtori Yu J:ltä, Yonsei University College of Medicine).
Eläinten tutkimus ja hoito
Urospuoliset C57BL/6-hiiret (6 viikkoa vanhoja, alkupaino 20 g) ostettiin The Jackson Laboratorylta (Bar Harbor, ME, USA). Eläimiä pidettiin lämpötilakontrolloidussa huoneessa (22 astetta) 12 tunnin valo/pimeä-syklissä. Kaikki eläimet jaettiin satunnaisesti. Viikko saapumisen jälkeen eläimet jaettiin kahteen ryhmään ja niitä ruokittiin joko normaalilla ruokavaliolla (ND; n=10) tai 0,2 % adeniinilla (Ade; n=10) enintään 4 viikon ajan. Sekä ND- että Ade-ryhmiä hoidettiin myös päivittäin intraperitoneaalisella metformiini-injektiolla (250 mg/kg), viikkoa ennen ruokavalion aloittamista. 4 viikon ND- tai Ade-hoidon jälkeen eläimet tapettiin ja munuaiset uutettiin nukutettaessa Zoletilillä (10 mg/kg) (Virbac, Carros, Ranska). Lyhyt menetelmä yksipuolisten virtsanjohtimen tukkeumien (UUO) hiirten valmistamiseksi on kuvattu lisämenetelmissä. Sitten munuaisnäytteet pakastettiin välittömästi nestetypessä ja säilytettiin -80 asteessa käyttöön asti.
Reaaliaikainen kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktio, Western blot -analyysit
Geenien transkriptitasoja, mukaan lukien Ppargc1a, NLRP3-tulehdusreitti, mitokondriodynamiikka, tuumorinekroositekijän aiheuttama proteiini 3 (TNFAIP3), oksidatiivinen stressimarkkeri ja profibroottiset markkerit, verrattiin kvantitatiivisella polymeraasiketjureaktiolla (qPCR). Tässä tutkimuksessa käytetyt alukesekvenssit on kuvattu lisätaulukossa 1. Yksityiskohtaisemmat menetelmät on kuvattu kohdassa Täydentävät menetelmät. PGC-1:n, NLRP3-tulehdusreitin, TNFAIP3:n, oksidatiivisen stressin markkerin ja profibroottisten markkerien proteiiniekspressiotasoja tutkittiin Western blot -analyyseillä. Yksityiskohtaiset menetelmät ja tiedot vasta-aineista on kuvattu erikseen kohdassa Täydentävät menetelmät.
NLRP3-tulehduskokoonpanon määritys
Kaspaasin rekrytointidomeenin (ASC) sisältävän apoptoosiin liittyvän täplämäisen proteiinin oligomerisaation määrittämiseksi suoritettiin disukkinimidyylisuberaatti (DSS) (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) kuvatulla tavalla. aiemmin [26]. Lyhyesti sanottuna RTECS ja solut munuaiskudosnäytteistä pelletoitiin sentrifugoimalla ja hajotettiin 0,5 ml:ssa lyysipuskuria, joka sisälsi 20 mM Hepes KOH, pH 7,5, 150 mM KCl, 1 % NP40, 0,1 mM PMSF ja proteaasi-inhibiittoriseos jäällä. Solulysaatteja sentrifugoitiin nopeudella 6 000 rpm 4 asteessa 10 minuuttia. Pelletit pestiin kahdesti PBS:llä ja suspendoitiin sitten uudelleen 500 ul:aan PBS:ää. Uudelleensuspendoidut pelletit silloitettiin tuoreella DSS:llä (2 mM) 30 minuutin ajan ja sitten pelletoitiin sentrifugoimalla nopeudella 6000 rpm 10 minuuttia. Silloitetut pelletit suspendoitiin uudelleen 30 ul:aan SDS-näytepuskuria ja fraktioitiin 12 % SDS-polyakryyliamidigeelillä, mitä seurasi immunoblottaus ASC-vasta-aineella (Cell Signaling Technology, MA, USA).
Oksidatiivisen stressin tason mittaus
Oksidatiivisen stressin (malondialdehydi [MDA]) tasot mitattiin RTEC:issä ja munuaiskudoksissa käyttämällä MDA-määrityssarjaa (Abcam, Cambridge, MA, USA). 10 mg RTEC:itä homogenisoitiin jäillä 300 ul:ssa MDA-lyysipuskuria (Abcam, Cambridge, MA, USA), sitten sentrifugoitiin (13, 000 × g, 10 min) liukenemattomien materiaalien poistamiseksi. 10 ml plasmaa sekoitettiin 500 ul:aan 42 mM H2S04:ää ja 125 ul:aan fosfovolframihappoliuosta huoneenlämpötilassa 5 minuutin ajan. Sentrifugoinnin (13,000 × g, 3 min) jälkeen pelletti suspendoitiin uudelleen jäihin 100 ul:lla kahdesti tislattua vettä. Sitten 200 ul liuosta ja 600 ul 2-tiobarbituurihappoliuosta inkuboitiin 95 asteessa 60 minuuttia ennen jäähdyttämistä huoneenlämpötilaan jäähauteessa 10 minuutin ajan. Absorbanssin intensiteetti 532 nm:ssä oli verrannollinen MDA-tasoon.
Mitokondrioiden eristäminen
RTEC:t fraktioitiin sytosoliin ja mitokondrioihin käyttämällä mitokondrioiden eristyspakkausta (BioVision, Inc. CA, USA) valmistajan protokollan mukaisesti. Lyhyesti sanottuna solut kerättiin ja pestiin 1 0 ml:lla jääkylmää PBS:ää. Solut sentrifugoitiin nopeudella 600 x g 5 minuuttia 4 asteessa ja suspendoitiin uudelleen 1,0 ml:aan 1 x sytosoliuuttopuskuria. Homogenisointi suoritettiin jäillä ja sentrifugoitiin 1200 x g:llä 10 minuuttia 4 asteessa tumien ja ehjien solujen poistamiseksi. Kerättyä supernatanttia sentrifugoitiin 10,000 × g 30 minuuttia 4 asteessa. Saadut pelletit suspendoitiin uudelleen 1,0 ml:aan 1 x sytosoliuuttopuskuria ja sentrifugoitiin 10, 000 x g 30 minuuttia 4 asteessa mitokondrioiden saamiseksi. Saadut mitokondriot hajotettiin 30 ul:ssa mitokondrioiden lyysipuskuria ja lisättiin 100 ul:aan entsyymiseosta (sisältyy eristyspakkaukseen) 100 ul:n kanssa absoluuttista etanolia. Sentrifugoinnin jälkeen saatu pelletti oli mtDNA. Sytosolinen mtDNA saatiin supernatantista etanolilla saostuksen jälkeen. mtDNA:n pitoisuus määritettiin qPCR-määrityksellä.
Mitokondrioiden dynamiikan ja toiminnan arviointi
Mitokondrioiden dynamiikan visualisointiin käytettiin mitokondrioiden immunofluoresenssivärjäystä MitoTracker Deep Red (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). RTEC:t kiinnitettiin 4 % paraformaldehydissä ja estettiin DPBS:ssä, joka sisälsi 5 % normaalia kanin seerumia ja 0,1 % Tweenia- 20. Sitten solut värjättiin anti-hiiri-NLRP3:lla, MitoTrackerilla, jota seurasi AlexaFluor{7}}konjugoidut vuohen anti-kanin vasta-aineet (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), ja lopuksi objektilasit kiinnitettiin DAPI:lla ja niistä kuvattiin. Seuraavaksi tutkimme mitokondrioiden rakennetta tavallisella transmissioelektronimikroskoopilla. Primaariset RTEC:t kiinnitettiin seoksella, jossa oli 2 % paraformaldehydiä ja 2,5 % glutaraldehydiä yön yli, pestiin, dehydratoitiin ja upotettiin hartsiin standardimenetelmien mukaisesti. Mitokondrioita tutkittiin JEOL 1011 -mikroskoopilla (JEOL, Tokio, Japani). Mitokondrioiden hengitysnopeuden arvioimiseksi käytettiin Seahorse Bioscience ×24 solunulkoista vuoanalysaattoria (Seahorse Bioscience, Billerica, MA, USA). Mitokondrioiden ROS-tuotannon mittaamiseksi solut suspendoitiin uudelleen Hank's Balanced Salt -liuokseen asianmukaisten käsittelyjen jälkeen ja värjättiin MitoSOX:lla (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 37 asteessa 20 minuutin ajan. Solujen fluoresenssi mitattiin virtaussytometrillä (FACSVerse, BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Mitokondrioiden kalvopotentiaalin määrittämiseen käytettiin tetrametyylirodamiinietyyliesteriä (TMRE) Mitokondriaalikalvopotentiaalin määrityspakkausta (Abcam, Cambridge, MA, USA).
TULOKSET
Muutokset PGC-1-, mitokondriodynamiikassa ja NLRP3-tulehdusreitissä munuaisvaurion aikana Ensinnäkin tutkimme PGC-1-, mitokondriodynamiikan ja NLRP3-reitin ilmentymistä TGF- 1-käsitellyissä RTEC-soluissa. . Näissä soluissa TGF- 1-käsittely alensi Ppargc1a:n transkripti- ja proteiinitasoja (kuvat 1A, B ja täydentävä kuva 1A). Vastaavasti mitofusiinin (Mfn), mitokondrioiden fuusioon liittyvän geenin, ja mitokondrioiden massaa edustavan mitokondrion transkriptiotekijä A:n (Tfam) mRNA:n ilmentymistasot alenivat merkittävästi, kun taas dynamiiniin liittyvän proteiinin 1 (Drp1), mitokondrio. fissioon liittyvän geenin määrä lisääntyi kontrolliin verrattuna (kuvio 1C). Lisäksi TGF- 1-hoito aktivoi NLRP3-tulehdussignaalin, mikä on osoituksena NLRP3-tulehdusreittiin liittyvien geenien ja proteiinien lisääntyneistä ilmentymistasoista (kuvat 1D, E ja täydentävä kuva 1B). NLRP3-reitin lopputuotteiden IL-1 ja IL-18 pitoisuudet TGF- 1--käsitellyissä solulysaateissa ELISA:lla mitattuna lisääntyivät (kuvio 1F). Lisäksi fibronektiini ja kollageeni 1 mukaan luettuina fibroottisten markkerien ilmentymistasot sekä Bax/bcl-2-suhteen apoptoottinen solukuolemaindeksi ja pilkottu kaspaasi-3 kasvoivat (kuva 1G, H ja täydentävä kuva 1C ). Nämä havainnot olivat samanlaisia adeniinin aiheuttaman munuaisvaurion mallissa (kuva 2A-H ja täydentävä kuva 1D-F). Siten munuaisvaurion aikana tapahtuu merkittäviä muutoksia PGC-1-ekspressiossa ja mitokondriodynamiikassa sekä NLRP3-tulehdusreitin aktivaatio.
Kuva 1 Muutokset PGC-1-, mitokondriodynamiikassa ja NLRP3-tulehdusreitissä TGF- 1--käsitellyissä RTEC:issä. PGC-1:n mRNA- ja B-proteiinin ilmentymistasot laskivat TGF- 1--käsitellyissä RTEC:issä. Mitokondrioiden dynaamisten geenien, mukaan lukien Mfn, Tfam ja Drp1, C-mRNA:n ilmentyminen muuttui TGF- 1--käsitellyissä RTEC:issä. NLRP3-tulehdusreitin D-mRNA- ja E-proteiinin ilmentymistasot lisääntyivät TGF{{10}}-käsitellyissä RTEC:issä. F ELISA:lla arvioidut IL-1- ja IL-18-pitoisuudet lisääntyivät TGF- 1--käsitellyissä RTEC:issä. Fibroottisten markkerien, mukaan lukien fibronektiini ja kollageeni 1, sekä apoptoottisten Bax/bcl-2-solukuolemamerkkien-3 ja pilkotun kaspaasin-3 G-mRNA- ja H-proteiinin ilmentymistasot lisääntyivät TGF- 1--käsitellyissä RTEC-soluissa. Huomautus: *P < 0,05 vs. kontrolli. PGC-1 peroksisomaalinen proliferaattori-koaktivaattori-1; NLRP3 NOD:n kaltainen reseptoriperhe, pyriinin domeenin sisältävä 3; ASC, apoptoosiin liittyvä pilkkumainen proteiini, joka sisältää kaspaasin rekrytointidomeenin; RTEC munuaisten tubulaarinen epiteelisolu; Mfn mitofusiini; Tfam mitokondrion transkriptiotekijä A; Drp1 dynamiiniin liittyvä proteiini 1; ELISA-entsyymi-immunosorbenttimääritys.
PGC-1 palauttaa heikentyneen mitokondriodynamiikan ja morfologian munuaisvaurion aikana
Seuraavaksi tutkimme, voisiko PGC-1, mitokondrioiden biogeneesin avainsäätelijä, heikentää mitokondrioiden dynamiikkaa munuaisvaurion aikana. Ppargc1:n ilmentymisen moduloimiseksi käytimme lisäksi Ppargc1a-plasmidia, siRNA:ta Ppargc1:tä vastaan (siPGC-1) ja metformiinia, PGC-1:n epäsuoraa aktivaattoria. Kuten odotettiin, heikentyneet mitokondrioiden dynaamiset geenit palautettiin Ppargc1:n yli-ilmentymisellä. Sitä vastoin Ppargc1a:n pudottaminen siPGC-1:lla vähensi Mfn:n ja Tfam:n ilmentymistä, mutta lisäsi Drp1:n ilmentymistä (kuvat 3A–C ja täydentävät kuvat 2A, B). Nämä havainnot vahvistivat lisäkokeita metformiinilla (kuva 3D-F ja täydentävä kuva 2C, D). Tällaiset parannukset johtivat mitokondrioiden toiminnan palautumiseen. PGC-1:n palauttaminen Ppargc1a-plasmidilla ja metformiinilla paransi merkittävästi vähentynyttä mitokondrioiden kalvopotentiaalia ja vähentynyttä hapenkulutusta TGF- 1:lla käsitellyissä RTEC:issä (lisäkuvat 3A–D). PGC-1 -muutosten mukaisesti fosfo-AMP-aktivoidun proteiinikinaasin (p-AMPK) ilmentyminen väheni TGF- --käsitellyissä soluissa, kun taas metformiinihoito palautti nämä ilmentymät (kuvio 3F ja Täydentävä kuva 2E). Metformiini ei kuitenkaan lisännyt PGC-1:n mRNA:n ja proteiinin ilmentymistasoja RTEC-soluissa hiljentämällä Ppargc1a:ta. Nämä havainnot viittaavat siihen, että AMPK välittää metformiinin vaikutusta ja PGC -1 on AMPK:n alavirran efektori (täydentävä kuva 2F, G, J). Metformiinin suotuisat vaikutukset mitokondrioiden dynamiikkaan kumottiin myös hiljentämällä Ppargc1a (lisäkuva 2H-J). In vivo, hoito metformiinilla myös palautti transkriptitason Ppargc1 ja käänsi muuttunut ilmentyminen mitokondrioiden dynaamisia liittyviä geenejä adeniini-ruokittu ja UUO hiirillä (kuva 3G-I ja täydentävä kuva. 2K, L, 4A-E). Metformiinin AMPK-aktiivisuus vahvistettiin myös in vitro adeniinilla syötetyssä mallissa (kuva 3I ja täydentävä kuva 2M). Elektronimikroskopiatutkimus vahvisti myös mitokondrioiden eheyden menetyksen adeniinilla ruokittujen ja UUO-hiirten RTEC:issä. Metformiini kuitenkin paransi näitä merkittävästi (kuvio 3J ja täydentävä kuva 4F). Nämä havainnot viittaavat siihen, että PGC-1 palauttaa heikentyneen dynamiikan, morfologian ja toiminnot mitokondrioissa munuaisvaurion aikana.
Mitokondriovauriot voivat johtaa munuaissolukuolemaan ja fibroosiin. Havaitsimme fibroottisten markkerien, mukaan lukien fibronektiinin ja kollageeni 1:n, kohonneita ilmentymistasoja sekä Bax/bcl-2-suhteen ja pilkkoneen kaspaasin-3 apoptoottisen solukuoleman indeksiä RTEC:issä TGF- 1-hoidon jälkeen. Näitä lisääntyneitä solukuolemamarkkereiden ilmentymiä vaimensi PGC-1 ja metformiinin yli-ilmentyminen, kun taas siPGC-1 pahensi niitä (kuvat 4A–D ja täydentävät kuvat 5A, B). Näiden löydösten mukaisesti fibroottisten markkerien ilmentymistasot ja apoptoottisten solukuolemien indeksi lisääntyivät merkittävästi adeniinia saaneilla ja UUO-hiirillä. Sitä vastoin metformiini käänsi kaikki nämä ilmaisut (kuvat 4E, F ja täydentävät kuviot 5C, 6A, B). Massonin trikromivärjäys vahvisti myös metformiinin parantuneen fibroosin (kuvio 4G). Erityisesti lisääntyneet solukuolemamarkkerit ja NLRP3-signalointi TGF-käsitellyissä RTEC-soluissa kumosi Z-Asp-2,6- diklooribentsoyylioksimetyyliketonilla (Enzo Life Science, Farmingdale, NY, USA), pan-kaspaasilla. inhibiittori, mikä viittaa siihen, että TGF- --indusoitu vaurio johtuu todennäköisesti mitokondriovauriosta ja varhaisesta apoptoosista (lisäkuvat 7A–D). Nämä havainnot yhdessä viittaavat siihen, että PGC-1-aktivaatio heikentää mitokondriovaurioita ja vähentää solukuolemaa ja munuaisfibroosia.
PGC-1 moduloi
NLRP3:n tulehduksellinen signalointireitti Tutkimme sitten edelleen PGC-1- ja NLRP3-tulehdusreitin välistä suhdetta munuaisvaurion välittämisessä. Kun PGC-1:n yli-ilmentyminen indusoitiin käyttämällä Ppargc1a-plasmiditransfektiota, NLRP3:n, ASC:n, IL-1:n ja IL-18:n ilmentymistasot vähenivät TGF- 1--käsitellyissä RTEC:issä ( Kuvat 5A, B ja lisäkuva 8A). ELISA:lla mitatut IL-1- ja IL-18-pitoisuudet TGF- 1--käsitellyissä solulysaateissa laskivat myös Ppargc1a-plasmiditransfektion jälkeen (kuvio 5C). Hoito metformiinilla tuotti samanlaisen löydön (kuvio 5D, E ja täydentävä kuva 8B). Kuitenkin Ppargc1a:n kaatuminen johti kohonneisiin NLRP3-tulehdusreittiin liittyvien geenien ja proteiinien ilmentymistasoihin (kuvat 5A, B ja täydentävä kuva 8A). Lisäksi metformiini vähensi samanaikaisesti NLRP3-tulehduksen signaalireitin aktivaatiota adeniinia saaneilla ja UUO-hiirillä (kuvat 5F, G ja täydentävät kuvat 6C, D, 8C). IL-1- ja IL-18-pitoisuudet RTEC:issä ja munuaiskudoslysaateissa laskivat merkittävästi metformiinikäsittelyllä ELISA:lla mitattuna (kuva 5H).
Ottaen huomioon PGC:n-1 kyvyn säädellä mitokondrioiden dynamiikkaa, testasimme sitten Drp1:n roolia NLRP3-tulehdusaktivaatiossa. NLRP3:n tulehduksellinen signalointi väheni merkittävästi Drp1:n kaatuessa. Kuitenkaan RTEC-soluissa, joissa sekä Ppargc1a että Drp1 on tuhoutunut, NLRP3:n tulehduksellisten komponenttien ilmentymistasot eivät laskeneet verrattuna TGF- 1--käsiteltyjen solujen tasoihin. Vuonna RTECs kanssa Ppargc1a yli-ilmentymistä ja Drp1 knock-down, NLRP3 inflammasome signalointi oli vähemmän aktivoitu (lisäkuva. 9, B). Nämä havainnot viittaavat siihen, että Drp1 voi osittain välittää NLRP3-tulehdusaktivaatiota, mutta muut PGC-1-toiminnot ovat mukana NLRP3-signalointireitin säätelyssä.
Tutkimme edelleen, onko NLRP3-tulehduksesta peräisin olevaa palautesignaalia. Tätä tarkoitusta varten saimme RTEC:t primääriviljelmällä Nlrp3 knockout -hiiristä. Näissä TGF- 1:lla käsitellyissä soluissa NLRP3-signalointi aktivoitui vähemmän kuin vastaavissa soluissa, mikä johti mitokondriodynamiikan parannuksiin (lisäkuvat 10A–E). Vastaavasti fibroottisissa muutoksissa ja solukuolemassa tapahtui samanaikaisia parannuksia Nlrp3:n puuttuessa (täydentävä kuva 10F, G). Nämä havainnot viittaavat mahdolliseen kaksisuuntaiseen suhteeseen mitokondrioiden vaurioiden ja NLRP3-signaloinnin välillä.
NLRP3:n oligomerointi adapteriproteiinin ASC:n kanssa on avainvaihe tulehduksellisen kompleksin muodostumisessa. Näin ollen tutkimme, vaikuttaako PGC- 1 NLRP3-inflammasomin muodostumiseen. TGF- 1--käsitellyissä RTEC:issä havaittiin ASC:n sitoutumista NLRP3:een. Tämä oligomerisaatio vähensi merkittävästi PGC-1:n tai metformiinin yli-ilmentymistä, kun taas sitoutuminen palautui siPGC-1:lla (kuvat 6A–C). Adeniinia saaneilla hiirillä NLRP3:n oligomeroituminen ja aktivaatio vahvistettiin ASC:n sitoutumisella NLRP3:een, ja tämä poistettiin metformiinilla (kuvio 6D, E).
Lopuksi tutkimme edelleen mitokondrioiden sisältöä ja samanaikaista muutosta NLRP3-ekspressiossa. Konfokaalinen mikroskopiatutkimus paljasti, että MitoTracker Redin intensiteetissä ja NLRP3:n ilmentymisessä tapahtui vastavuoroinen muutos RTEC:issä PGC:n kanssa tai ilman sitä-1. TGF- 1 vähensi MitoTrackerin värjäytymisintensiteettiä, ja ne palautuivat PGC-1-yli-ilmentymisen ja metformiinin vaikutuksesta. Sitä vastoin PGC-1:n yli-ilmentyminen ja metformiini vähensi NLRP3:n lisääntynyttä ilmentymistä TGF- 1--käsitellyissä RTEC:issä. siPGC-1 kuitenkin kumosi nämä havainnot (kuva 7). Kaiken kaikkiaan nämä havainnot osoittavat, että NLRP3-tulehduskompleksin muodostuminen indusoitui munuaisvaurion aikana, ja PGC-1 heikensi tämän reitin aktivaatiota.
Kuva 5 PGC-1 moduloi NLRP3-tulehduksen signalointireittiä. NLRP3-tulehdusreitin mRNA- ja B-proteiinin ilmentymistasot vähenivät TGF- 1--käsitellyissä RTEC:issä Ppargc1a-plasmidin transfektiolla, kun taas siPGC-1 lisääntyi. C ELISA:lla arvioidut IL- 1- ja IL-18-pitoisuudet vähenivät TGF- 1--käsitellyissä RTEC-soluissa Ppargc1a:n yli-ilmentyessä. NLRP3-tulehdusreitin D-mRNA- ja E-proteiinin ilmentymistasot heikkenivät TGF- 1--käsitellyissä RTEC:issä metformiinilla. ELISA:lla arvioidut NLRP3-tulehdusreitin F-mRNA- ja G-proteiinin ilmentymistasot sekä IL-1- ja IL-18-H-pitoisuudet heikkenivät metformiinilla adeniinia syötetyissä hiirissä. Huomautus: *P < 0.05 vs. kontrolli; **P < 0,05 vs. TGF- 1-käsitellyt RTEC:t tai adeniinilla ruokitut hiiret. PGC-1 peroksisomaalinen proliferaattori-koaktivaattori-1; NLRP3 NOD:n kaltainen reseptoriperhe, pyriinin domeenin sisältävä 3; ASC-apoptoosiin liittyvä täplämäinen proteiini, joka sisältää kaspaasin rekrytointidomeenin; RTEC munuaisten tubulaarinen epiteelisolu; ELISA-entsyymi-immunosorbenttimääritys; Ade-adeniini; Tapasi metformiinin.
Kuva 6 PGC-1 moduloi NLRP3-tulehduksen oligomeroitumista munuaisvaurion aikana. TGF- 1--käsitellyissä RTEC:issä havaittiin DSS-välitteisellä silloituksella määritettyjä A–C ASC:n oligomeerirakenteita, jotka heikensivät Ppargc1a:n ja metformiinin yli-ilmentymistä, kun taas siPGC-1 pahensi niitä. D, E ASC:n oligomeerisiä rakenteita havaittiin adeniinia saaneilla hiirillä, joita metformiini heikensi. Huomautus: *P < 0.05 vs. kontrolli; **P < 0,05 vs. TGF- 1-käsitellyt RTEC:t tai adeniinilla ruokitut hiiret. PGC-1 peroksisomaalinen proliferaattori-koaktivaattori-1; NLRP3 NOD:n kaltainen reseptoriperhe, pyriinin domeenin sisältävä 3; ASC-apoptoosiin liittyvä täplämäinen proteiini, joka sisältää kaspaasin rekrytointidomeenin; DSS-disukkinimidyylisuberaatti; RTEC munuaisten tubulaarinen epiteelisolu; Ade-adeniini; Tapasi metformiinin.
PGC-1 ohjaa mtDNA:n, oksidatiivisen stressin ja TNFAIP3:n vapautumista säätelemään NLRP3-tulehdusta
Selvittääksemme edelleen mekaanista yhteyttä PGC-1- ja NLRP3-tulehdusreitin välillä munuaisvauriossa tutkimme ensin mtDNA:n muutoksia soluvaurion yhteydessä, mikä tunnetaan NLRP3-tulehdusaktivaation laukaisevana. MtDNA:n kopiomäärät vähenivät mitokondriofraktiossa ja lisääntyivät sytosolifraktiossa TGF- 1-hoidon jälkeen, mikä viittaa siihen, että mtDNA:ta vapautui mitokondrioista sytosoliin. Erityisesti nämä muutokset palautuivat Ppargcla:n yli-ilmentymisen jälkeen (kuvio 8A).
Sitten tutkimme oksidatiivista stressiä, joka on NLRP3-tulehduksen positiivinen säätelijä. TGF- 1-käsitellyissä RTEC-soluissa oksidatiivinen stressi oli huomattavan voimakasta verrokkeihin verrattuna, mikä osoitti lisääntyneen MitoSOX-värjäytymisen intensiteetin ja kohonneiden MDA-tasojen. Käsittely Ppargc1a-plasmidilla ja metformiinilla heikensi tätä mitokondrioiden ROS:n ylituotantoa. Sitä vastoin Ppargc1a:n tuhoutuminen lisäsi entisestään oksidatiivista stressiä TGF- 1--käsitellyissä RTEC:issä (kuvat 8B–D). Kuten in vitro -tutkimuksen havainnot, MDA-tasot nousivat merkittävästi adeniini- ja UUO-hiirillä. Metformiini vähensi lisääntynyttä oksidatiivista stressiä (kuva 8E ja täydentävä kuva 6E).
Lopuksi tutkimme edelleen TNFAIP3:a, jota säätelee PGC-1 ja joka tunnetaan myös NLRP3-tulehduksen negatiivisena säätelijänä. TGF- 1 alensi Tnfaip3:n transkriptitasoja ja tämä vähentynyt Tnfaip3:n ilmentyminen palautettiin palauttamalla PGC-1. Sitä vastoin Ppargc1a:n kaatuminen johti edelleen vähentyneeseen Tnfaip3:n ilmentymiseen (kuva 8F, G ja täydentävä kuva 8D, E). Lisäksi TNFAIP3:n ilmentyminen oli vähentynyt adeniinia saaneilla ja UUO-hiirillä, ja metformiini palautti tämän ilmentymisen (kuvio 8H ja täydentävät kuviot 6F, 8F). Kaiken kaikkiaan nämä havainnot viittaavat siihen, että PGC-1 voi säädellä NLRP3-tulehdusta moduloimalla mtDNA:n vapautumista, mitokondrioiden ROS-/hapetusstressiä ja TNFAIP3:a.
Wecistanchen tukipalvelu - Kiinan suurin vesisäiliön viejä:
Sähköposti:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Puhelin:+86 15292862950
Osta lisätietoja teknisistä tiedoista:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
