Osa 3: Isorhamnetiinin vaikutukset diabetekseen ja siihen liittyviin komplikaatioihin: Katsaus in vitro- ja in vivo -tutkimuksiin ja post hoc -transkriptioanalyysi osallistuneesta molekyylireitistä

Lisätietoja: ottaa yhteyttätina.xiang@wecistanche.com

5. Post Hoc -transkriptomianalyysi ennustaa isorhamnetiinin mahdollisen vaikutuksen diabetekseen kantasolupohjaisessa työkalussa

Olemme perustaneet kantasolupohjaisen työkalun perinataalistakantasolu, ihmisen amnion epiteelisolut (hAEC) luonnollisten yhdisteiden bioaktiivisuuden arvioimiseksi käyttämällä koko genomin mikrosiruanalyysiä [71, 140-144]. Viime vuosina yhä suurempi määrä lääkekasveissa olevia bioaktiivisia yhdisteitä on seulottu niiden mahdollisten terapeuttisten ja ehkäisevien vaikutusten suhteen. Tässä yhteydessä ihmisen pluripotentteja kantasoluja (hPSC) käyttävät kantasoluihin perustuvat lähestymistavat saavat suurta huomiota fysiologisesti merkityksellisempinä in vitro -ihmismalleina lääkeseulonnassa ja tuhansien yhdisteiden validoinnissa sekä akateemisessa tutkimuksessa että lääketeollisuudessa[{{4} }]. Kuitenkin hPSC-soluilla, mukaan lukien alkion kantasolut (hESC:t) ja indusoidut pluripotentit kantasolut (hiPSC:t), on rajalliset soluresurssit, ne vaativat invasiivisia uuttomenetelmiä, kalliita solujen uudelleenohjelmointia ja kriittisiä ylläpitotoimenpiteitä sekä aiheuttavat eettisiä rajoituksia. ovat vähemmän edullisia huumeiden seulonnan käytännön lähteenä. Toisaalta hAEC-arvot saadaan hylätystä istukasta, lääketieteellisestä jätetuotteesta. Ne eivät vaadi invasiivisia sadonkorjuumenetelmiä, ja niillä on mahdollisimman vähän eettisiä huolenaiheita. Lisäksi hAEC:t ovat peräisin pluripotenteista epiblasteista, ja ne säilyttävät siten ESC:n kaltaisen monilinjaisen erilaistumispotentiaalin, ja ne voidaan erottaa soluiksi kaikista kolmesta itukerroksesta [148-151].

On syytä huomata, että sopivalla erilaistumisprotokollalla hAEC-solut voidaan eriyttää maksasoluiksi [152-155], kolangiosyyteiksi [156] ja, mikä tärkeintä, haiman kaltaisiksi insuliinia tuottaviksi soluiksi[157-160 ]. hAEC-indusoitujen pankreaattisten solujen siirto streptotsotosiinin aiheuttamiin diabeettisiin hiiriin voisi normalisoida verensokeritason [161]. hAEC:t[162] sekä hAEC:istä [163] johdetut eksosomit voivat nopeuttaa diabeettisen haavan paranemista edistämällä angiogeneesiä ja fibroblastien toimintaa ja vähentämällä tulehdusta. hAEC:iden sisällyttäminen saarekeorganoideihin [164] ja natiivi saarekkeiden suojaaminen hAEC-kerroksella [165] voisi tehostaa saarekesiirrettä ja revaskularisaatiota diabeettisissa hiirimalleissa. Lisäksi hAEC-peräisillä hepatosyyttimäisillä soluilla sekä itse hAEC:llä on raportoitu olevan terapeuttista tehoa maksasairauksissa, mukaan lukien maksafibroosi [166,167], kirroosi [168] ja maksan vajaatoiminta [169].

Kun otetaan huomioon DM:n monimutkainen patofysiologia, hAEC ei ehkä ole ihanteellinen in vitro -malli yhdisteiden diabetesta ehkäisevien vaikutusten tutkimiseen. Kantasolumaisten ominaisuuksiensa vuoksi sitä voidaan kuitenkin käyttää kohdeyhdisteiden alkuseulonnassa. Olemme aiemmin tutkineet isorhamnetiinin antifibroottista [71] ja maksan erilaistumista indusoivaa [170] potentiaalia hAEC:issä. Tässä tutkimuksessa olemme suorittaneet kohdistetun sekundaarianalyysin aiemmin julkaistuista tiedoistamme [71] tutkiaksemme isorhamnetiinin mahdollisia toimintojadiabetes(Figure 4). Data analysis was conducted for three biological replicates of day 10 control (n = 3) and isorhamnetin-treated (n =3) hAECs. The cells were grown in 3D cell culture. Control cells were maintained in placental basal epithelial cell medium(Promo Cell, Cat.#C-26140)in absence of any differentiation medium or growth factors, whereas treatment cells were supplemented with 20 mM of isorhamnetin (Sigma-Aldrich, Japan) for 10 days. Differentially expressed genes (DEGs) are referred to as genes with a linear fold change>2 ja p-arvo<0.05(one-way between-subjects="" anova).="" a="" total="" of="" 303="" degs="" were="" identified;="" among="" them,="" 60="" were="" upregulated="" and="" 243="" were="" downregulated.="" details="" of="" methodology="" have="" been="" explained="" elsewhere="" [71,170].="" all="" microarray="" data="" are="" available="" at="" gene="" expression="" omnibus(geo)="" under="" accession="" number:="" gse153149="" (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc="GSE153149,accessed" on="" 24="" november="">

Napsauta tätä saadaksesi lisätietoja tuotteista

5.1. Solutyypin allekirjoitusgeenisarjat

Aiemmissa hAEC-tutkimuksissamme havaitsimme, että erityyppiset yhdisteet voivat ohjata hAEC:iden erilaistumista eri solulinjoihin, kuten kofeiinihappoesteri, rosmariinihappo [142] ja kofeoyylikiinihappojohdannainen3,4,5- Tri-O-kofeoyylikiinihappo (TCQA)[140], joka voi tehostaa hermosolujen erilaistumista, kun taas antosyaniini, syanidiini-3-O-glukosidi (Cy3G), indusoi rasvasolujen erilaistumista [143] hAEC:issä. Havaitsimme, että luonnollisten yhdisteiden bioaktiivisuudet tai toiminnallisuudet voidaan yleensä ennustaa rikastetuista solutyypeistä DEG:illä.

Tutkimme merkittävästi rikastuneita solutyyppien allekirjoitustietojoukkoja käyttämällä Molecular Signatures Database (MSigDB) -versiota. GSEA-verkkoohjelmiston 7.4 (https://software. broadinstitute.org/gsea/index.jsp; käytetty 26. marraskuuta 2021)[171]. Nämä geenisarjat sisältävät klusterimarkkerin allekirjoitusgeenejä ihmiskudoksen yksisolusekvensointitutkimuksissa tunnistetuille solutyypeille ja helpottavat solutyyppimäärityksiä tietosarjoissa, kuten organoidimallien kehittämiskokeissa.

Havaitsimme, että merkittävin solutyypin geenisarja oli haiman mesenkymaaliset stroomasolut [172] (kuvio 4A). Lisäksi haiman kanava- ja endoteelisolutyypit rikastuivat merkittävästi [172]. Haiman allekirjoitusgeenit isorhamnetiinilla käsitellyissä hAEC:issä osallistuvat epiteeli-mesenkymaaliseen siirtymiseen, TGF-signalointiin, TNF-signalointiin NF-kB:n kautta, KRAS-signalointiin ja rasvahappometaboliaan. Myös useat maksan allekirjoitusgeenisarjat rikastuivat merkittävästi, kuten HSC:t, kupffer-solut, sappitiesolut [173] ja sikiön maksan mesotelisolut [174]. Siellä oli myös useita merkittävästi rikastettuja luustolihasten allekirjoitusgeenisarjoja, mukaan lukien fibrilliini1 plus fibroadipogeeniset progenitorisolut (FBN1 plus FAP), fibroadipogeeniset progenitorisolut (FAP) ja luustolihasten perisyytit [175]. Maksan allekirjoitusgeenien biologiset toiminnot isorhamnetiinilla käsitellyissä hAEC:issä sisältävät useita tulehdusreaktioreittejä, kun taas luustolihasten allekirjoitusgeenit säätelevät haavan paranemista, kollageenisäikeen organisoitumista ja MAPK-kaskadia. Merkitys mitattiin väärien löydösten prosentteina, hypergeometrisen p-arvon analogina Benjaminin ja Hochbergin korjauksen jälkeen useiden hypoteesien testaamiseen (FDR q-arvo<>

5.2. Merkittävästi rikastetut Hallmark-geenisarjat

Seuraavaksi tutkimme merkittävästi rikastuneita tunnusmerkkigeenisarjoja MSigDB:ssä (haettu 26.11.2021). Hallmark-geenisarjat edustavat spesifisiä, hyvin määriteltyjä biologisia tiloja tai prosesseja, jotka on luotu geenisarjan päällekkäisyyksien tunnistamisen ja koherentin ilmentymisen osoittavien geenien säilyttämisen perusteella. Tunnusmerkit sisältävät 50 geenisarjan kokoelmaa, joka on tiivistetty yli 4000 päällekkäisestä geenijoukosta, ja siten niillä on vähentynyt kohina ja redundanssi [176].

Merkittävästi rikastuneita tunnusmerkkigeenisarjoja ovat geenit, jotka määrittävät epiteeli-mesenkymaalisen siirtymän, geenit, jotka säätelevät ylösnousua vasteena hypoksialle, geenit, joita säätelee NF-kB vasteena TNF:lle, geenit, joita KRAS-aktivaatio säätelee ylös ja alas, geenit, jotka välittävät apoptoosia kaspaaseja aktivoimalla, geenit, jotka osallistuvat myogeneesi, geenit, jotka lisääntyvät vasteena TGF- 1:lle, geenit, joita STAT5 lisää vasteena IL-2-stimulaatiolle, geenit, jotka määrittävät tulehdusvasteen, geenit, jotka osallistuvat p53-reitteihin ja -verkostoihin sekä geenit, jotka koodaavat proteiineja, jotka osallistuvat glykolyysiin ja glukoneogeneesi (kuvio 4B). Merkitys otettiin huomioon FDR q-arvolla<>

Mielenkiintoinen havainto on KRAS-aktivaation rikastaminen isorhamnetiinilla käsiteltyjen hAEC:iden DEG:illä. Useiden KRAS-indusoitujen geeniekspressioiden, kuten MMP9, TSPAN1 ja ITGBL1, todettiin säätelevän merkittävästi isorhamnetiinin vaikutuksesta. Hyperglykemia laukaisee genomisen epävakauden, joka johtaa KRAS-mutaatioihin haimasoluissa [177], ja se on myös yhdistetty haimasyöpien [178] ja paksusuolen syöpien lisääntyneeseen riskiin ja invasiivisuuteen [179]. Wang et al. raportoivat, että isorhamnetiini estää haiman adenokarsinoomasolulinjan PANC-1 lisääntymistä vähentämällä Ras/MAPK-signalointireitin aktiivisuutta [134]. Siksi, kuten kohdassa 4.2.4 mainittiin, isorhamnetiinin vaikutusta KRAS-indusoituun diabeteksen, erityisesti haimasyöpien, syöpäriskiin kannattaa tutkia lisää.

5.3. Merkittävästi rikastuneita polkuja

DEG:iden reittianalyysit suoritettiin Comparative Toxicogenomics Database (CTD) -tietokannan (http://ctdbase.org/; saatavilla 29. marraskuuta 2021)[180] avulla. CTD edustaa Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) ja REACTOME-polkuja. Löysimme, että useitatulehduksellinenReitit, kollageenin muodostuminen ja kokoaminen, PI3K-Akt-signalointireitti ja AGE-RAGE-signalointireitti diabeteksen komplikaatioissa rikastuivat merkittävästi (kuvio 4C).

Edistyneet glykaation lopputuotteet (AGE:t) tuotetaan proteiinien, lipidien ja nukleiinihappojen ei-entsymaattisen glykaation ja hapetuksen kautta. Edistyneen glykaation lopputuotteiden (RAGE) reseptorit kuuluvat immunoglobuliinien superperheeseen. AGE/RAGE-signalointi on monimutkainen ja monimutkainen sarja, joka aktivoi useita solunsisäisiä signaalireittejä, joihin liittyy proteiinikinaasi C:tä, NADPH-oksidaasia ja MAPK:ita, mikä johtaa NF-kB-indusoituun IL-1-, IL-6-ilmentymiseen, TNF-, VCAM-1 ja VEGF. Erityisesti AGE/RAGE-signalointi on liitetty diabetesvälitteiseen verisuonten kalkkeutumiseen TGF-välitteisen fibroosin, NFkB- ja ERK1/2-reittien aktivoitumisen kautta [181-184]. Havaitsimme, että isorhamnetiini vähensi merkittävästi AGE/RAGE-signalointiin liittyvää geeniekspressiota, kuten COL1A1, COL1A2, COL4A6, FN1, MMP2 ja SERPINE1. Kuten aiemmassa osiossa todettiin, isorhamnetiinin antifibroottiset vaikutukset on dokumentoitu hyvin [71,74,99,119], ja siksi voidaan väittää, että isorhamnetiinilla voi olla myös edullisia vaikutuksia diabeteksen aiheuttamaan verisuonipatologiaan.

5.4. Merkittävästi rikastuneet aineenvaihduntataudit ja niihin liittyvät geeniekspressiot

Kuroidut geenitauti-assosiaatiotiedot haettiin CTD:stä (haettu 29.11.2021). Kuroimme vain merkittävästi rikastuneita aineenvaihduntasairauksia. Rikastumisen merkitys laskettiin Bonferroni-menetelmällä säädetyllä hypergeometrisellä jakaumalla. Merkittävästi rikastuneita aineenvaihduntasairauksia olivat DM, glukoosi- ja lipidiaineenvaihduntahäiriöt, hyperglykemia ja liikalihavuus (kuvio 4D). Lämpökartta osoittaa, että PPAR:t, TGF:t, TNF:t, IL:t, kollageenin ja apoptoosia indusoivat geeniekspressiot vähenivät merkittävästi isorhamnetiinilla käsitellyissä hAEC:issä (kuvio 4E). Toisaalta insuliinireseptorit, lipoproteiinilipaasit ja apoptoosin estäjät lisääntyivät merkittävästi isorhamnetiinilla käsitellyissä hAEC:issä.

Kohdennettu microarray-tietoanalyysimme isorhamnetiinilla käsitellyistä hAEC:istä vahvisti myös isorhamnetiinin potentiaalin säädellä DM:ään ja siihen liittyviin komplikaatioihin liittyviä biologisia toimintoja.

6. Isorhamnetiiniaglykonin ja sen glykosyloitujen johdannaisten biologinen hyötyosuus ja imeytyminen suolistossa

Kun läsnäolo eri luokkiinflavonoiditluonnossa on mielenkiintoista analysoida näiden yhdisteiden läsnäoloa kehossa. Kun puhutaan isorhamnetiinin aineenvaihdunnasta ja sen saatavuudesta ihmiskehossa kulutuksen jälkeen, puhutaan alkuperästä, aineenvaihdunnasta ja kuljetuksista. Tämä perustuu havaintoon, joka on tehty kromatografialla joistakin flavonoideista, kuten flavonoleista ihmisen seerumissa. Nestekromatografia-massaspektrometria antaa käsityksen tiettyjen flavonoidien biologisesta hyötyosuudesta niiden aglykoni- ja glykosidimuodoissa elimistössä [49]. Massaspektrometriaa voidaan käyttää flavonoidien määrittämiseen biologisista näytteistä [185]. Tutkimus raportoi 23 sekoitettua sulfaatti-, metyyli-, glukuronidi- ja glukoosijohdannaista.kversetiinisekä vapaaehtoisten ihmisten virtsassa että plasmassa 1 tunti kevyesti paistetun punasipulin nauttimisen jälkeen. Tämä tutkimus havaitsi sekä kversetiinin että isorhamnetiinin glykosideja plasmasta [186].

Useat tekijät vaikuttavat ravinteiden pääsyyn ruoansulatuskanavan kautta. Esimerkiksi suoliston mikrobiotosta peräisin olevat entsyymit vaikuttavat fenoliyhdisteiden pääsyyn.

Ginkgo-lehtiuutteilla hiirimallilla tehty tutkimus osoitti suoliston mikrobiotan merkityksen joidenkin bioaktiivisten molekyylien, erityisesti isorhamnetiinin, biologiselle hyötyosuudelle ja imeytymiselle ruoansulatuskanavasta [187]. Tässä vaiheessa suoliston mikrobiston entsyymit tuottavatflavonoidiaglykonit ja erilaiset rengasfissiotuotteet. Kokoverinäytteiden analyysit osoittivat, että antibakteerinen hoito lisäsi isorhamnetiinin ottoa, mikä viittaa siihen, että suoliston mikrobiotaentsyymeillä on negatiivinen vaikutus luonnollisten molekyylien, kuten isorhamnetiinin, farmakokinetiikkaan.Antibakteerinentai probioottien käyttö voi lisätä isorhamnetiinin glykosidimuodon biologista hyötyosuutta. Lisäksi bioaktiivisten molekyylien in vitro biotransformaationopeudet ja viipymäajat erosivat normaaleilla, diabeettisilla ja diabeettisilla nefropatiarotilla [188].

Toisaalta eri kalvokuljettajat säätelevät flavonoidien kuljetusta, kuten natriumista riippuvainen glukoosinkuljettaja 1 (SGLT1) ja monilääkeresistenssiin liittyvät proteiinit 2 ja 3 (MRP2 ja MRP3)[189]. Tässä yhteydessä MRP-kuljettajat säätelevät isorhamnetiinin transsellulaarisia ja parasellulaarisia kuljetusreittejä [190]. Solujen sisällä isorhamnetiinin kuljetus apikaalista tyvipuolelle oli 6.8-9.3-kertaa suurempi. Kuvassa 5 on yhteenveto isorhamnetiinin diabetesta ehkäisevistä vaikutuksista.

7. Päätelmät

Isorhamnetiini on flavonoidiperheen, tarkemmin sanottuna flavonolien, fenoliyhdiste. Alun perin se on kversetiinimolekyyli, mutta se on metyloitunut. Isorham-netiiniä esiintyy kasvikunnan alueella monissa luonnonvaraisissa ja kosmeettisissa kasveissa. Lisäksi useat lääkekasvit tuottavat tätä molekyyliä ja useat tutkimukset ovat osoittaneet sen diabetesta estävän vaikutuksen muiden biologisten toimintojen ohella. Kaikki nämä tiedot osoittavat siten isorhamnetiinin kiinnostuksen terapeuttiseen teollisuuteen. Tästä näkökulmasta olisi erittäin mielenkiintoista tutkia erityisesti luonnonvaroista eristettyjen isorhamnetiinin ja sen johdannaisten vaikutusta aineenvaihduntahäiriöihin. On myös tarpeen korostaa ja tarkastella tässä yhteydessä tehtyjä kliinisiä tutkimuksia, joissa on käytetty runsaasti flavonoideja sisältäviä fraktioita ja luonnontuotteita, jotta vältetään synteettisten ja kemiallisten huumeiden aiheuttamat sivuvaikutukset.

Viitteet

1. Gill, SS; Tuteja, N. Reaktiiviset happilajit ja antioksidanttikoneet viljelykasvien abioottisessa stressinsietokyvyssä. Plant Physiol. Biochem. 2010, 48, 909–930. [CrossRef] [PubMed]

2. Corpas, FJ; Gupta, DK; Palma, JM Reaktiivisten happilajien (ROS) tuotantopaikat kasvisolujen organelleissa. Reaktiiviset happilajit ja oksidatiiviset vauriot stressin alla olevissa kasveissa; Springer: Berliini/Heidelberg, Saksa, 2015; s. 1–22.

3. Falleh, H.; Oueslati, S.; Guyot, S.; Dali, AB; Magné, C.; Abdelly, C.; Kouri, R. LC/ESI-MS/MS karakterisointi prosyanidiinien ja propelargonidiinien, jotka ovat vastuussa syötävän halofyytin Mesembryanthemum edule L. voimakkaasta antioksidanttiaktiivisuudesta. Food Chem. 2011, 127, 1732–1738. [CrossRef]

4. Trabelsi, N.; Oueslati, S.; Falleh, H.; Waffo-Téguo, P.; Papastamoulis, Y.; Mérillon, J.-M.; Abdelly, C.; Ksouri, R. Voimakkaiden antioksidanttien eristäminen lääkehalofyytistä Limoniastrum guyonianum. Food Chem. 2012, 135, 1419–1424. [CrossRef] [PubMed]

5. Boulaaba, M.; Mkadmini, K.; Tsolmon, S.; Han, J.; Smaoui, A.; Kawada, K.; Ksouri, R.; Isoda, H.; Abdelly, C. Arthrocnemum Indicum -uutteiden antiproliferatiivinen vaikutus in vitro Caco-2-syöpäsoluihin solusyklin ohjauksen ja siihen liittyvän fenoli-LC-TOF-MS-tunnistuksen avulla. Evid.-pohjainen täydennys. Altern. Med. 2013, 2013, 529375. [CrossRef]

6. Karker, M.; De Tommasi, N.; Smaoui, A.; Abdelly, C.; Ksouri, R.; Braca, A. Tamarix Africanan uudet sulfatoidut flavonoidit ja sen polaariuutteen biologiset vaikutukset. Planta Med. 2016, 82, 1374–1380. [CrossRef]

7. Bourgou, S.; Rebey, IB; Mkadmini, K.; Isoda, H.; Kouri, R.; Kouri, WM Artemisia herbalin LC-ESI-TOF-MS ja GC-MS profilointi ja bioaktiivisten ominaisuuksien arviointi. Food Res. Int. 2017, 99, 702–712. [CrossRef]

8. Boulaaba, M.; Medini, F.; Hajlaoui, H.; Mkadmini, K.; Falleh, H.; Kouri, R.; Isoda, H.; Smaoui, A.; Abdelly, C. Salsola kali L:n fenoliuutteiden biologinen aktiivisuus ja fytokemiallinen analyysi. Endogeenisten tekijöiden rooli parhaiden kasviuutteiden valinnassa. S. Afr. J. Bot. 2019, 123, 193–199. [CrossRef]

9. Najjar, H.; Abdelkarim, BA; Doria, E.; Boubakri, A.; Trabelsi, N.; Falleh, H.; Tlili, H.; Neffati, M. Joidenkin Tunisian lääkekasvien fenolikoostumus, joka liittyy antiproliferatiiviseen vaikutukseen ihmisen rintasyövän MCF-7-soluissa. EuroBiotechnol. J. 2020, 4, 104–112. [CrossRef]

10. Bourgou, S.; Bettaieb Rebey, I.; Ben Kaab, S.; Hammami, M.; Dakhlaoui, S.; Sawsen, S.; Msaada, K.; Isoda, H.; Ksouri, R.; Fauconnier, M.-L. Vihreä liuotin, joka korvaa heksaanin bioaktiivisten lipidien uuttamisessa mustakuminan ja basilikan siemenistä. Foods 2021, 10, 1493. [CrossRef]