Osa2: Munuaisvaurion molekyyli-1 on potentiaalinen reseptori SARS-CoV-2: lle

Lisätietoja. kontaktitina.xiang@wecistanche.com

Koronaviruksen kliiniset oireet

1. Inkubointiaika on pitkä, ja tärkeimmät oireet ovat kuume, väsymys, kurkkukipu ja yskä. Kuume voi olla korkea kuume, kohtalainen kuume tai matala kuume;

2. Imeväiset ja vanhukset eivät ole tyypillisiä, ja niihin liittyy usein hengityksen vinkumista ja hengenahdistusta. Vaikeissa tapauksissa voi esiintyä usean järjestelmän vaurioita;

3. Kuiva yskä alkuvaiheessa on pääasiassa paroksysmaalista ja vakavaa, samanlainen kuin hinkuyskä, joka vaikuttaa uneen ja toimintaan; myöhemmässä vaiheessa yskä on ysköstä, yskös on ilkeä, sisältää toisinaan pienen määrän verta, ja joihinkin liittyy hengityksen vinkumista;

4. Joillakin potilailla on lieviä oireita, eikä heillä ehkä ole kuumetta. Useimmilla potilailla on hyvä ennuste, ja pieni määrä potilaita on kriittisesti sairaita tai jopa kuolee;

5. Akuutti hengitysvaikeusoireyhtymä, septinen sokki, tulenkestävä metabolinen asidoosi ja hyytymishäiriöt.

Uuden koronaviruksen ehkäiseminen, oman immuniteetin parantaminen on ihmisille tehokkain keino taistella virusta vastaan. Cistanche, jota on käytetty ravitsevana aarteena muinaisista ajoista lähtien, tunnetaan nimellä "autiomaaginseng" ja on koskemattomuuden vahvistamisen kuningas. Cistanche - Immuniteetin vahvistamisen kuningas

Nykyaikainen lääketieteellinen tutkimus on osoittanut, että kehon ravitsemisen ja vahvistamisen toimintojen lisäksi Cistanchesilla on merkittäviä parantavia vaikutuksia kasvainten, ikääntymistä estävien, rytmihäiriöiden, apoptoosin estämisen ja immuniteetin parantamisen estämisessä. palvelus.

SitäCistanchen glukosidien kokonaismääräovat ginsengin aktiivisia komponentteja immuunitoiminnan säätelyyn, mikä voi parantaa immuunitoimintaa paitsi normaaleille ihmisille myös ihmisille, joilla on alhainen immuunitoiminta.

Kliininen havainto on vahvistanut, että Cistanchella on tietty parantava vaikutus pahanlaatuisiin kasvaimiin ja että sillä on ilmeinen vaikutus leukosyyttien lisääntymiseen. Ginsengin ottaminen sädehoidon ja kemoterapian aikana voi vähentää sädehoidon ja kemoterapian myrkyllisiä ja sivuvaikutuksia, nopeuttaa vaurioituneen kudoksen korjaamista ja estää leukopeniaa;

Keskustelu

TaistellaCOVID-19 -pandemia, syvällinen ymmärrys siitä, mitenSARS-CoV-2tunkeutuu ihmisen soluihin on perusteltua. Tutkimukset ovat osoittaneet SARS-CoV-2:n suoran infektionmunuainenkeuhkojen lisäksi (Braun et ai., 2020; Farkash ym.,2020). ACE2 on kuitenkin ainoa hyvin tunnistettu reseptori, joka voi välittää tätä hyökkäystä. Lisäksi SARS-CoV-2: n munuaistropismi ja siihen liittyvätmunuaisvaurionäyttävät selittämättömiltä ACE2: n suhteellisen alhaisen tason vuoksi viruksen hyökkäyksen aikana (Kuba et ai., 2005). Tässä tutkimuksemme viittaa siihen, että KIM1, rajusti säädelty biomarkkeri munuaisvaurioon (Yang et ai., 2015), välittää SARS-CoV-2-munuaisten invaasiota reseptorina.

Havaitsimme myös, että SARS-CoV-2-RBD sitoutuu KIM1: een, jolla on suurempi affiniteetti kuin SARS-CoV-RBD: llä ja MERS-COV-RBD: llä, mikä todennäköisesti on SARS-CoV-2: n vahvemman tartunnan taustalla (Rabaan et ai., 2020); siksi munuaistulehdus ja KIM1: n roolit näissä vaikeissa hengityselinsairauksissa kannattaa tarkistaa. Erityisesti tuloksemme viittaavat erillisiin KIM1: n ja ACE2: n sitoutumiskohtiin viruksen RBD: ssä, joten on syytä tutkia, välittävätkö KIM1 ja ACE2 SARS-CoV-2-hyökkäystä näissä elimissä ja miten. Lisäksi, koska KIM1 on endosytosoitu klatriiniriippuvaisten reittien kautta (Zhao et ai., 2016), olisi myös mielenkiintoista tutkia edelleen KIM1-riippuvaista prosessia viruksen kiinnittymisen jälkeen solukalvoon.

ACE2 on SARS-CoV-2: n parhaiten tutkittu reseptori, mutta se ei ole ihanteellinen terapeuttinen kohde COVID-19: lle, koska se ilmenee laajalti useissa elimissä ja sillä on ratkaiseva rooli verenpaineen säätelyssä ja sydän- / munuaisvaurioiden ehkäisyssä (Imai et ai., 2005; Li et ai.,2020d). Sitä vastoin KIM1: llä on vahvempi yhteys munuaisten toimintaan ja se ilmaistaan voimakkaasti vasta sen jälkeen, kunmunuaisten vamma(Kondratowicz ym., 2011; Yuan et ai., 2015; Costafreda ja Kaplan,2018), mikä tekee siitä tarkemman ja ehkä myös turvallisemman terapeuttisen kohteen COVID-19-potilaille, joilla on munuaissairauksia.

Yhteenvetona voidaan todeta, että tietomme viittaavat KIM1: n ratkaisevaan rooliin SARS-CoV-2-munuaistropismissa SARS-CoV-2: n mahdollisena reseptorina. Tässä ehdotamme mallia KIM1: n ja ACE2: n välittämästä "noidankehästä" (kuva 5G), joka voi selittää SARS-CoV-2: n munuaistropismin COVID-19-potilailla. SARS-CoV-2-invaasion alkuvaiheessa korkeampi fysiologinen taso (täydentävä kuva S1) ja sitoutumisaffiniteetti (täydentävä taulukko S1) tekevät ACE2:sta ensisijaisen kohteen, joka ei ole munuaisspesifinen. Viruksen aiheuttaman AKl:n puhkeamisen jälkeen tuloksena oleva rajusti säädelty KIM1 edistää kuitenkin nopeasti kim1:n ja ACE2:n välittämää sekundaarista virusinfektiota, joka on munuaisspesifisempi ja pahentaa siten munuaisvaurioita noidankehässä (kuva 5G). Lähestymistavat, jotka voivat rikkoa SARS-CoV-2: n ja KIM1: n välisen vuorovaikutuksen, mukaan lukien kim1-vastaiset vasta-aineet, pienimolekyyliset estäjät ja KIM1-johdetut antagonistipeptidit, voivat valaista COVID-19-hoitoa.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

Rekombinantti SARS-CoV-2-RBD (T80302) saatiin Genscriptistä. Antagonistipeptidi 1 (AP1, SCSLFTCQNGIV, puhtaus >95%) ja antagonistipeptidi 2 (AP2, SCSLFTCQNGGGWF, puhtaus >95%) syntetisoitiin kemiallisesti Genscriptillä. Anti-hiiri-lgG-vasta-aine (p/n 18-8816-33) ja anti-kani-lgG-kehonvasta-aine (p/n 18-8817-33) saatiin Rocklandista. IgG surebeadsin kanssa" Proteiini G magneettihelmet (J2112LB-02) ostettiin Bio-Radilta. DAPI (D9542) oli kotoisin Sigmasta. Alex Flour 594 merkitty phalloidin (C2205S) oli Beyotimesilta. Käytettiin vasta-aineita KIM1: tä (NBP1-76701, Novus Biologicals), Flagia (F1804, Sigma), HA: ta (H6908, Sigma) ja ACE2: ta (2115-1-AP, Proteintech) vastaan.

KIM1:n ja ACE2:n lausekeprofiilien hankinta ja analysointi

Saadaksemme KIM1: n ja ACE2: n kattavat transkriptomi- ja proteiiniprofiilit ihmiskudoksille keräsimme ja analysoimme transkriptiotietoja ja immunohistokemiaan perustuvia proteiiniprofiileja Human Protein Atlasista (HPA, https://www.proteinatlas.org), joka osoitti ihmisen proteiinien ilmentymisen ja lokalisoinnin kudosten ja elinten välillä perustuen RNA: n (RNA-seq) syvään sekvensointiin 37 normaalista kudoksesta ja immunohistokemiasta kudosmikroarrayissa, jotka sisältävät 44 kudostyyppiä (Uhlen et ai., 2015). Proteiinia koodaavan geenin HPA-RNA-seq-kudos kirjattiin keskimääräisinä proteiineja koodaavina transkriptioina miljoonaa kohti (pTPM), mikä vastaa kunkin kudoksen näytteiden keskiarvoja. Histologiaan perustuvat proteiiniekspressiotasot analysoitiin manuaalisesti neljään tasoon (ei havaittu, matala, keskitaso ja korkea). Täydentävässä kuvassa S1 on lueteltu KIM1:n ja ACE2:n 10 parasta tissulaarista transkriptiotasoa ja histologiaan perustuvia proteiiniekspressiotasoja, ja KIM1:n ja ACE2:n päällekkäiset ilmentymisprofiilit on tiivistetty.

Molekyylien telakointi- ja dynamiikkasimulaatiot

Telakoinnit suoritettiin Z-Dockin (http://zdock. umassmed.edu/) kautta. Mahdollisten sidontamallien etsimiseen käytettiin SARS-CoV-RBD:n (PBD ID 2AJF), SARS-CoV-2-RBD:n (PDB ID 6MOJ), MERS-COV-RBD:n (PDB ID 4L3N), ACE2:n (PDB ID 1R42) ja KIM1 Ig V -verkkotunnuksen (PDB ID 5DZO) kiderakenteita. Parhaiten pisteytetyt proteiinikompleksit valittiin seuraaviin molekyylidynamiikkasimulaatioihin, jotka Desmond-palvelin suoritti ja analysoi Pymol2.3 ja Maestro11.8.012.50 ns: n dynamiikkasimulaatiokaaviota käytettiin proteiinikompleksien dynaamisten parametrien tutkimiseen. MM-GBSA:n sitovan vapaan energian laski HawkDock (Misini lgnjatovic et ai.,2016).

Neliön keskiarvopoikkeama (RMSD) ja juurikeskineliön vaihtelu (RMSF)

RMSD: tä käytettiin arvioimaan keskimääräisen muutoksen atomien valinnan siirtymässä tietylle kehykselle kuvatulla tavalla (Li et ai., 2011). RMSF tehtiin proteiiniketjun siirtymämuutosten tutkimiseksi (Li et ai.,2011).

AKI-hiirimallit ja qPCR

I/R-vamma suoritettiin C57BL/6-hiirillä, kuten aiemmin kuvailimme (Chen et ai., 2015, 2017). Sisplatiinin aiheuttaman AKI:n osalta 30 mg/kg kehonpainoista sisplatiinia injektoitiin vatsaontelonsisäisesti 8 viikon ikäisille uroshiirille, ja hiiret uhrattiin 3 päivää myöhemmin. Veri- ja munuaisnäytteet kerättiin lisäanalyysejä varten, n=4 kullekin koe-eläinryhmälle. RNAiso Plus (TaKaRa) eristi kokonais-RNA: n munuaisista ja transkriptoitiin käänteisesti cDNA: ksi käyttäen M-MLV: n ensimmäisen säikeen synteesijärjestelmää (Invitrogen). Spesifisten geenitranskriptioiden runsaus arvioitiin qPCR:llä. Tutkimuksessa käytetään alukkeita (lisätaulukko S4).

Rakentaa

Nisäkkäiden ilmentymisplasmidit ihmisen KIM1: lle, KIM1 Ig V: lle (KIM1-jäämät aa 20-127), KIM1 △lg V (katkaistu KIM1 ilman jäämiä aa 20-127), KIM1-CFP, KIM1-V-CFP, ACE2, SARS-CoV-2-RBD (SARS-CoV-2-S-jäämät aa 319-541), SARS-CoV-2-2-S, SARS-CoV-2-RBD-YFP ja TIM4-YFPwere rakennettiin. Vastaavien cDNA-fragmenttien PCR-vahvistustuotteet kloonattiin pRK-promoottoripohjaiseksi vektoriksi, joka sisälsi joko HA- tai FLAG-tunnisteen. SARS-CoV-2:een liittyvät plasmidit olivat ystävällisiä lahjoja Shandongin yliopiston tohtori P.H.Wang.

Soluviljely ja transfektio

Ihmisen munuaisten tubulaarinen solulinja HK-2 (saatu China Center for Type Culture Collectionista) viljeltiin DMEM/F12-väliaineessa (Hyclone), joka sisälsi 17,5 mM glukoosia ja 10% sikiön naudan seerumia. SARS-CoV-2:n soluihin kohdistuvan vaikutuksen arvioimiseksi HK-2-solut transfektoitiin SARS-CoV-2-S- ja SARS-CoV-2-RBD-plasmideilla ja kerättiin sitten lisäilmaisua varten.

Yhteis-IP

Ilmoitetut HK-2/HEK293T-solut (1×10) jaettiin 1 ml:n esilyysipuskuriin(25 mM Tris-HCl,pH7,4 150mM NaCl,1% NP-40, 1mM EDTA, 5% glyserolia), joka on suunniteltu alasveto- ja IP-määrityksiin ja helmien pesupuskuriksi. IP:tä varten solulysaatti immunosaostettiin ilmoitetulla vasta-aineella tai vastaavalla gG:llä SureBeadsTM Protein G -magneettihelmillä yön yli 4C:ssä. Pesun jälkeen esilyysipuskurilla, joka sisälsi 500 mM NaCl: ää, helmet keitettiin latauspuskurissa ja altistettiin immunoblottaukselle (Wan et ai., 2017).

FRET-määritys

Kim1:n ja SARS-CoV-2-RBD:n välinen solunsisäinen vuorovaikutus havaittiin tavallisella FRET-pohjaisella määrityksellä (Karpova ja McNally,2006)käyttäen KIM1-CFP:tä ja SARS-CoV-2-RBD-YFP:tä. Lyhyesti sanottuna nisäkkäiden ilmentymisplasmidit, jotka ilmentävät KIM1-CFP: tä tai KIM1 Alg V-CFP: tä, kotransfektoitiin SARS-CoV-2-RBD-YFP: n kanssa 293T-soluihin. Fluoresenssispektrofotometripohjaiseen havaitsemiseen solut kerättiin ja hajotettiin 24 tuntia transfektion jälkeen, ja lysaatti havaittiin F-2700-fluoresenssispektrofotometrillä (Hitachi) aallonpituusskannauksen (500-600 nm) ja aikaskannauksen (435/527 nm, viritys/emissio) avulla. Konfokaalipohjaista havaitsemista varten solut kuvattiin Leica TCS SP8 -konfokaalimikroskoopilla suuritehoisen objektiivisen linssin alla (40×)(YKP-kanava: 435/485 nm, viritys/emissio; YFP-kanava: 485/527nm, viritys/emissio; FRET-kanava: 435/527 nm, viritys/emissio) (Li et ai., 2020b). Konjugoimattomien YKP:n ja YFP:n yhteistransfektio sisällytettiin negatiiviseksi kontrolliksi kuvatulla tavalla (Karpova ja McNally, 2006). FRET-määritys havaitsi KIM1:n ja sen ligand TIM4:n välisen vuorovaikutuksen positiivisena kontrollina (Rong et ai., 2011).

CRISPR-Cas9-välitteinen KIM1:n tyrmäys

CRISPR-Cas9-pohjaisia protokollia genomisuunnitteluun käytettiin kuvatulla tavalla (Zhang et ai.,2017). Kim1:lle on annettu ohje-RNA-kohdesekvenssit (lisätaulukko S4).

FITC-merkinnät ja konfokaalimikroskopia

FITC-etiketti suoritettiin aiemmin kuvatulla tavalla (Li et ai., 2020b; Zhang et al.,2020). Lyhyesti sanottuna SARS-CoV-2-RBD: tä inkuboitiin FITC: llä (moolisuhde 1: 5) yön yli, ja sitten 5 mM NHCl lisättiin reaktion pysäyttämiseksi ja toimimattoman FITC: n sammuttamiseksi. Liuos dialysoitiin kahdesti ja kylmäkuivattiin jatkokäyttöä varten.

HEK293T-soluja (5×109) tai HK-2-soluja (1×107) inkuboitiin vapailla FITC- tai FITC-SARS-CoV-2-RBD-soluilla (100 μg/ml 2:lle). Peptidipohjaisten sisäistämismääritysten osalta AP1 tai AP2(50μM) lisättiin yhdessä FITC-SARS-CoV-2-RBD:n (100 μg/m) kanssa. Kun solukalvot oli kiinnitetty 4%: lla (w / v) formaldehydillä, solukalvot värjättiin Alex Flour 594: llä, joka oli merkitty phalloidiniksi (2 μg / ml), ja ytimet värjättiin DAPI: llä (1μg / m) ja kuvattiin sitten Leica TCS SP8 -konfokaalimikroskoopilla. Kutakin ryhmää kohden arviointiin sisällytettiin vähintään 100 solua viidestä kentästä suuritehoisen objektiivilinssin alla (64×). Edustavia kuvia esiteltiin. Kuvien kvantifioinnin suoritti ImageJ1.8.0.

Solujen elinkelpoisuusmääritykset

Soluja levitettiin 3000-4000 soluun kuoppaa kohti 96-kuoppalevyissä. 80 %:n yhtymäkohdassa SARS-CoV-2-RBD:llä (100 μg/ml) inkuboituja soluja käsiteltiin AP1:llä tai AP2:lla (10,50,100 μM) tai ilman niitä. Sen jälkeen kuhunkin lisättiin 10 μl MTT:tä (5 mg/ml

hyvin 4 tunnin ajan väliaine poistettiin ja DMSO lisättiin. Absorbanssi mitattiin 490 nm: ssä normalisoitiin vastaavalle kontrolliryhmälle.

Tilastollinen analyysi

Tiedot ilmaistiin keskiarvona±SD. Merkittäviä eroja arvioitiin kaksihäntäisellä opiskelijatestillä. Kaksipuolinen P-arvo<0.05 was="" considered="" statistically="" significant.="" analyses="" were="" performed="" with="" excel="" 2017="" and="" graphpad="" prism="">