Osa 1: Isorhamnetiinin vaikutukset diabetekseen ja siihen liittyviin komplikaatioihin: Katsaus in vitro- ja in vivo -tutkimuksiin ja post hoc -transkriptioanalyysi osallistuneesta molekyylireitistä

Lisätietoja: ottaa yhteyttätina.xiang@wecistanche.com

Abstrakti: Diabetesmellitus, erityisesti tyyppi 2 (T2DM), on merkittävä kansanterveysongelma maailmanlaajuisesti. DM:lle on ominaista korkeat glykemia- ja insuliinitasot, jotka johtuvat heikentyneestä insuliinin erittymisestä ja solujen insuliiniherkkyydestä, joka tunnetaan nimellä insuliiniresistenssi. T2DM aiheuttaa useita ja vakavia komplikaatioita, kuten nefropatiaa, neuropatiaa ja retinopatiaa, jotka aiheuttavat solujen oksidatiivisia vaurioita erilaisissa sisäisissä kudoksissa, erityisesti haimassa, sydämessä, rasvakudoksessa, maksassa ja munuaisissa. Kasviuutteet ja niiden bioaktiiviset fytokemikaalit herättävät kiinnostusta uusina terapeuttisina ja ehkäisevinä vaihtoehtoina T2DM:lle ja siihen liittyville komplikaatioille. Tässä suhteessa isorhamnetiini, kasviflavonoidi, on pitkään tutkittu sen mahdollisten diabetesta ehkäisevien vaikutusten vuoksi. Tässä katsauksessa kuvataan sen vaikutusta diabetekseen liittyvien häiriöiden vähentämiseen alentamalla glukoositasoja, parantamalla oksidatiivista tilaa, lievittämällä tulehdusta ja moduloimalla lipidiaineenvaihduntaa ja rasvasolujen erilaistumista säätelemällä in vitro ja in vivo -tutkimuksissa raportoituja signaalireittejä. Lisäksi sisällytämme post hoc koko genomin transkriptomianalyysin isorhamnetiinin biologisista aktiivisuudesta kantasolupohjaisella työkalulla.

Avainsanat: isorhamnetiini; kversetiini; biologiset toimet; diabetes; molekyylien reitit; microarray

Napsauta tästä saadaksesi lisätietoja yhteystiedoista

1. Esittely

Kasveja on käytetty perinteisinä lääkkeinä lähes kaikilla maailman mantereilla muinaisista ajoista lähtien. Tieteellinen tutkimus niiden lääkinnällisen käytön syistä on johtanut bioaktiivisten molekyylien tutkimiseen. Äärimmäisissä ympäristöolosuhteissa kasvavia äärimmäisiä kasveja pidetään hyvänä potentiaalisena kiinnostavien bioaktiivisten molekyylien lähteenä. Itse asiassa nämä ympäristörajoitteet ovat syynä happiaineenvaihduntaan, joka johtaa oksidatiiviseen stressiin lisäämällä reaktiivisia happilajeja (ROS)[1,2]. Joillakin kasveilla, kuten halofyyteillä, on voimakasantioksidanttijärjestelmä näiden haitallisten yhdisteiden poistamiseksi. Kiinnostavien bioaktiivisten molekyylien joukossa on fenoliyhdisteitä. Useat tutkimukset ovat arvostaneet laboratoriossa runsaasti polyfenoleja sisältäviä kasveja rajoittavilla olosuhteilla tai ilman niitä [3-10]. Polyfenoleja sisältävillä uutteilla on useita biologisia vaikutuksia, kuten anti-inflammatorisia ja syöpää ehkäiseviä vaikutuksia [11-13]. Muut tutkimukset osoittivat isorhamnetiinin antioksidanttisen, antimikrobisen [8,14-16] sekä liikalihavuuden, diabeteksen ja maksan steatotoosin [17-19] vaikutukset. Näistä polyfenoleistaflavonoiditerotetaan. Tämä ryhmä sisältää useita alaryhmiä, kuten flavonolit. Isorhamnetiini on yksi flavonolien tärkeimmistä yhdisteistä. Isorhamnetiini on monometoksiflavoni tai O-metyloitu flavonoli flavonoidien luokasta. se onkversetiinijossa metoksiryhmä korvaa hydroksiryhmän asemassa 3'. Joitakin isorhamnetiinijohdannaisia ​​esiintyy luonnossa, kuten isorhamnetiini 3-O- -d-glukopyranosidi, isorhamnetiini 3-O-neohesperidosidi ja isorhamnetiini 3-O-rutinosidi Calendula officinalis L:stä [20]. Isorhamnetiinilla on merkittäviä biologisia ominaisuuksia, kuten antioksidantti [21], syöpää [22], antimikrobinen [23], antiviraalinen [24], anti-inflammatorinen ja diabetesta ehkäisevä vaikutus [21,25-33].

Tässä katsauksessa keskitytään ensisijaisesti isorhamnetiinin alkuperään, kemialliseen rakenteeseen, eristys- ja uuttomenetelmiin sekä fytokemialliseen näkökulmaan. Sitten, toisessa osassa, keskitymme kuvaamaan tämän flavonolin mahdollisia diabeteksen vastaisia ​​vaikutuksia vähentämällä diabetekseen liittyviä häiriöitä alentamalla glukoositasoja, parantamalla oksidatiivista tilaa, lievittämällä tulehdusta ja moduloimalla lipidiaineenvaihduntaa ja rasvasolujen erilaistumista. Lopuksi teimme toissijaisen analyysin aiemmin julkaistuista koko genomin mikrosirutiedoistamme tutkiaksemme isorhamnetiinin diabetekseen liittyviä bioaktiivisuuksia kantasolupohjaisessa työkalussa. Pyrimme myös tuomaan esiin tämän molekyylin vaikutusta asiaan liittyvien signalointireittien säätelyyn raportoimalla tällä tutkimusalalla käytetyt in vitro ja in vivo -tutkimukset. Tässä katsauksessa paljastimme isorhamnetiinin diabetesta estävän vaikutuksen ominaisuudet verrattunakversetiinijota pidetään isorhamnetiinin metaboliittina ja tärkeänä referenssinä diabeteksen luonnollisessa hoidossa.

2. Yleinen katsaus bioaktiivisiin molekyyleihin erityisesti polyfenoleissa ja flavonoideissa

2.1. Oksidatiivinen stressi bioaktiivisten molekyylien alkuperänä kasveissa

Useat kasvit voivat altistua erilaisille ympäristöolosuhteille (suolaisuus, kuivuus, UV-säteet, raskasmetallit, äärimmäiset lämpötilat, ravinteiden puute, ilmansaasteet ja patogeenien hyökkäykset). Nämä rajoitukset ovat syynä happiaineenvaihdunnan toimintahäiriöille, jotka synnyttävät oksidatiivista stressiä lisäämällä reaktiivisia happilajeja (ROS). Happimolekyylillä (O2) on tärkeä rooli fotosynteettisissä organismeissa. Alun perin korkeammissa kasveissa ja levissä elektroneihin liittyvä kaasunvaihto tapahtuu kloroplasteissa sieppaamalla hiilidioksidia päivän aikana ja tuottamalla happea. Tämä kaasunvaihto sisältää elektroneja. Vakavissa ympäristörajoitteissa suuri osa hapesta ei todellakaan vähene ja voi siten tuottaa ROS:ia joissakin kasvisolujen organelleissa [1,2] kloroplastien asianmukaisen toiminnan ja elektronien siirron epätasapainon vuoksi. 1]. Lisäksi yllä mainittujen ympäristörajoitusten alaisuudessa syntyy monia ROS-yhdisteitä, kuten hydroksyyliradikaali (OH), superoksidianioniradikaali (O,-), alkoksyyli- ja peroksyyliradikaalit (RO: ja RO2, vastaavasti), vetyperoksidi (H2O2, ), hypokloriittiradikaali (-OCl), singlettihappi (O2), typpioksidiradikaali (NO) ja muut lipidiperoksidit (kuten malondialdehydi ja 4-hydroksinonenaali)[2,34,35]. Joskus ROS:lla voi olla rooli solujen signaloinnissa kasvien fysiologisessa käyttäytymisessä, esimerkiksi siementen kasvu- ja kehitysprosessissa, kudosten kehityksessä ja siirtymisessä solujen lisääntymisestä solujen pidentymiseen erilaistumisen aikaisemmissa vaiheissa [36] . Korkealla tasolla nämä molekyylit aiheuttavat molekyylivaurioita, kuten kalvojen lipidiperoksidaatiota, proteiinien ja DNA:n muutoksia ja solukuolemaa [1,35,37]. Jotkut kasvit, kuten halofyytit, pystyvät sopeutumaan hyvin näihin olosuhteisiin tehokkaan antioksidanttijärjestelmän avulla. Halofyyttien tiedetään olevan sekundaaristen metaboliittien, kuten polyfenolien, lähteitä [3-10]. Nämä kirjoittajat osoittavat, että vaikeissa olosuhteissa polyfenoleja syntetisoidaan niin, että niillä on tärkeä rooli suojaamisessa stressin aiheuttamilta oksidatiivisilta vaurioilta. Näiden fenoliyhdisteiden biosynteesi, pitoisuus ja aktiivisuudet ovat useiden ulkoisten (valo, lämpötila, suolapitoisuus ja kuivuus) ja sisäisten (genotyyppi, elin ja kehitysvaihe) parametrien funktio, jotka vaikuttavat niiden sisältöön ja jakautumiseen kasveissa. 8,38,39]. Esimerkiksi Pyracantha coccineassa joitakin flavonoideja, kuten flavanoneja, flavoneja ja flavonoleja, on versoissa kasvuvaiheen aikana ja juurissa yksinomaan lisääntymisvaiheessa 40]. Toisaalta useat kirjoittajat ovat osoittaneet, että näillä fenoliyhdisteillä on muita biologisia ominaisuuksia, kuten anti-inflammatorisia ja syöpää ehkäiseviä vaikutuksia [11-13]. Muut tutkimukset osoittivat fenoliuutteiden antioksidanttiset, antimikrobiset [8,14-16] ja diabeteksen vastaiset [18,41,42] vaikutukset.

2.2. Luonnollisten antioksidanttien luokitus

Antioksidanttijärjestelmä voidaan luokitella näiden komponenttien luonteen mukaan entsymaattisiksi tai ei-entsymaattisiksi yhdisteiksi. Ensimmäiset sisältävät superoksididismutaasin (SOD), katalaasi (CAT), askorbaattiperoksidaasin ja glutationireduktaasin [1,3542-44]. Näihin entsyymeihin liittyvät geenit paljastivat niiden merkityksen sadonkorjuun jälkeisen varastojuuren fysiologisen heikkenemisen aikana ja vasteena osmoottiselle stressille ja abskisiinihapolle sekä Xanthomonas axonopodis -infektiolle [44]. Toinen ryhmä sisältää pääasiassa fenoliyhdisteitä, karotenoideja, vitamiineja ja osmolyyttejä [1]. Fenoliyhdisteille on tunnusomaista yhden tai useamman bentseenirenkaan läsnäolo, ja ne eroavat perusmolekyylin monimutkaisuudesta, hydroksyylin lukumäärästä ja sijainnista sekä polymeroitumisasteesta. Nämä yhdisteet ovat sekundaarisia metaboliitteja, jotka jakautuvat kolmeen laajaan ryhmään: fenolihapot (bentsoe- ja kanelihappojen johdannaiset), flavonoidit (flavonolit, flavonolit, flavanonit, flavonit, antosyaniinit) ja tanniinit (hydrolysoituvat tanniinit ja proantosyanidiinit). Näiden molekyylien lisäksi erotetaan myös stilbeenejä, lignaaneja ja kumariineja [45].

2.3. Flavonoidien alkuperä ja biokemiallinen rakenne, erityisesti Isorhamnetin

Fenoliyhdisteet ovat kasveissa yleisiä sekundaarisia metaboliitteja. Näissä yhdisteissä on aromaattinen rengas, jossa on yksi tai useampi hydroksyyliryhmä (OH), ja ne sisältävät molekyylejä yksinkertaisista fenolihapoista polymeroituneisiin yhdisteisiin, kuten tanniineihin. Fenoliyhdisteiden synteesi on monimutkainen prosessi, joka käy läpi useita vaiheita. Fenoliyhdisteet ovat bioaktiivisia molekyylejä, joilla on kaksi alkuperäreittiä: toisella puolella shikimiinihappo ja toisella puolella fenyylipropanoidimolekyylit. Flavonoidien, kuten isorhamnetiinin, biosynteesi perustuu näihin reitteihin. Itse asiassa toisaalta shikimaatti muodostaa perusrungon polyfenoleille, joissa on yksi tai useampi bentseenirengas (C6), jossa on yksi tai useampi hydroksyylifunktio. Toisaalta on olemassa C6-C3-emäksen synteesi, joka muodostuu fenyylialaniinin kondensoitumisesta kanelihapoksi (kuva 1)[46].

Tarkemmin sanottuna shikimiinihappo on useiden reaktioiden perusta, edustaen aromaattisten aminohappojen runkoa, jotka ovat fenoliyhdisteiden initiaattoreita. Ensimmäinen vaihe koostuu kahden molekyylin yhdistelmästä: fosfoenolipyruvaatti ja erytroosi-4-fosfaatti, jotka neljän reaktion jälkeen johtavat fenolien ensimmäisen rungon muodostumiseen: shikimaatti- tai shikimiinihappo (CHoOs). Tämä esittää myöhemmin ensimmäisen renkaan, joka luonnehtii fenoleja, joissa on kaksi hydroksyyliryhmää. Shikimaatti käy läpi kuusi reaktiota, jotka päättyvät ensimmäiseen aminohappoon: fenyylialaniiniin. Kahden keskeisen entsyymin, fenyylialaniiniammoniakkilyaasin (PAL) ja sinnamaatti-4-hydroksylaasin (C4H) ansiosta fenyylialaniini muodostaa peräkkäin cinnamaattia ja p-kumaraattia. Tässä vaiheessa PAL-aktiivisuuden taso voi säädellä kvantitatiivisesti fenolisia yhdisteitä. p-kumaraattimolekyyli on kumariinijohdannaisten alkuperä. Fenyylipropanoidimolekyylien synteesireitille on tunnusomaista avainentsyymi, jota kutsutaan 4-kumaraatti-CoA-ligaasiksi (4CL), joka katalysoi koentsyymi A(CoA) p-kumariinin tiolifunktion läsnä ollessa. happo 4-kumaroyyli-CoA(C30Ha2N-O18P, S). Flavonoidien aromaattinen A-rengas syntyy kolmen malonyyli-CoA (-C6) -molekyylin kondensaatiosta.

Myöhemmin 4-kumaroyyli-CoA tuotti naringeniinikalkonia, mikä selittää yhteyden aromaattisen B-renkaan ja kalkonin 3C-renkaan (C6-C3-) välillä. Kalkoni on keskeinen elementti tässä aiheessa, koska se on kaikkien flavonoidien esiaste, joka perustuu kahdesta bentseenirenkaasta koostuvaan viidentoista hiilen runkoon. Myöhemmin kalkoni muuttuu naringeniiniksi (kutsutaan myös flavanoniksi tai trihydroksiflavoniksi) kalkonisomeraasin (CHI) vaikutuksesta. Toisaalta flavoneja, kuten apigeniini, asetiini, krysiini tai luteoliini syntetisoidaan naringeniinista flavonin läsnä ollessa. syntaasi (FNS). Toisaalta naringeniinista tuotetaan erilaisia ​​flavonoleja ja meripihkahappoyhdisteitä kahden entsyymin läsnä ollessa; flavanoni-3-dioksigenaasi (F3D) ja flavonolisyntaasi (FS). Flavonolijohdannaisten lisäksi valmistetaan myös muita yhdisteitä, kuten kaempferolia, myrisetiiniä ja kversetiiniä. Metyyliryhmän siirrolla S-adenosyyli-L-metioniinista isorhamnetiini tuotetaan flavonin 3'-O-metyylitransferaasin (FMT) läsnä ollessa [47,48]. Sitten isorhamnetiini on monometoksiflavoni tai O-metyloitu flavonoli flavonoidien luokasta. Se on kversetiini (prekursori), jossa hydroksiryhmä asemassa 3' on korvattu metoksiryhmällä. Joitakin isorhamnetiinijohdannaisia ​​on luonnossa, kuten isorhamnetiini 3-O- -d-glukopyranosidi, isorhamnetiini 3-O-neohesperidosidi ja isorhamnetiini 3-O-rutinosidi Calendula officinalis L:stä [20].

Itse asiassa flavonoideja pidetään yhtenä polyfenoliperheen tärkeimmistä ryhmistä. Niiden rakenne perustuu difenyylipropaanityyppiin, jossa on kaksi bentseenirengasta (rengas A ja B, katso kuva 2), jotka on yhdistetty kolmihiiliketjulla, joka muodostaa suljetun pyraanirenkaan (C-rengas). Siksi niiden rakenteeseen viitataan nimellä C6-C3-C6. O-glykosylaatioasemat ovat C7 flavoneissa, isoflavoneissa, flavanoneissa ja flavonoleissa ja C3 flavonoleissa ja antosyanidiineissa. C-glykosylaatioasemat ovat C6 ja C8 flavoneissa [49]. Lisäksi fenoliyhdisteiden antioksidanttisen roolin merkitys liittyy molekyylin hydroksylaatioasteeseen. Flavonoideja ovat isoflavonit, flavonit, flavanonit ja niiden glykosidit ja flavonolit isorhamnetiinina, jota kutsutaan myös 3'-metoksikversetiiniksi ja 3-metyylikversetiiniksi [50]. Kasveissa entsyymi, UDP-riippuvaiset glykosyylitransferaasit, vastaa isorhamnetiinin glykosidimuodosta (isorhamnetiini 3-O-glukosidi). Tämä entsyymi käyttää nukleotididifosfaattisokereita, yleensä uridiinidifosfaattisokeria (UDP) siirtääkseen metyyliryhmän kiertoon ja liittääkseen glykosidifunktion isorhamnetiiniin [51].

2.4. Lääkekasveista peräisin olevan ilsorhamnetiinin eristäminen ja analyysit

Isohamnetiinin levinneisyys lääkekasveissa on erittäin laaja ja uutto- ja analyysimenetelmät vaihtelevat. Isohamnetiinijohdannaiset ovat erityisen haluttuja. Hydroksyyli- ja metyyliryhmät auttavat niiden karakterisoinnissa. Eräitä menetelmiä käytetään isorhamnetiinin uuttamiseen, mukaan lukien fraktiointiin perustuvat kemometriset lähestymistavat, entsyymi ja superkriittisen nesteen uutto (SFE-CO2). Ensinnäkin fraktiointia voidaan käyttää uuttamisen yksinkertaistamiseksi poistamalla kaikki öljy- ja lipofiiliset pigmentit lipidejä sisältävistä näytteistä. Näyte, josta rasva on poistettu, sonikoidaan myös ennen maserointia metanolin ja veden seoksessa. Kromatografiaa voidaan sitten käyttää fenoliyhdisteiden, erityisesti flavonoidien, analyyseihin [49]. Näihin viimeksi mainittuihin yhdisteisiin käytetään LC-MS:ää ja sekä sähkösumutusionisaatiota (ESI) että ilmakehän painekemiallista ionisaatiota käytetään usein, ja paras herkkyys flavonoideille saavutetaan yleensä negatiivisen ionin tilassa [49]. Esimerkiksi Tunisian autiomaasta kerättyjen Calligonum Azel Maire -kasvifraktioiden fytokemia on arvioitu ja fenolien, kuten flavonien, tunnistamiseen on käytetty ultrakorkean suorituskyvyn nestekromatografiaa yhdistettynä nelinkertaiseen lentoaikamassaspektrometriaan UHPLC-ESI-QTOF. ja flavanolit, jotka olivat yleisimmät tunnistetut fenoliyhdisteet [52]. Tarkemmin sanottuna isorhamnetiiniglukosidin ja isorhamnetiiniglukosyyliramnosidin läsnäolo vahvistettiin tärkeimmiksi yhdisteiksi syötävän halofyytin Mesembryanthemum edule lehdissä käyttämällä LC/ESI-MS/MS-tekniikkaa [3]. Tätä työtä seurasivat muut, jotka ovat käyttäneet LC-ESI-TOF-MS:ää monien polyfenolien karakterisoimiseen; niiden joukossa flavonoideja tunnistettiin halofyyttien, kuten Arthrocnemum indicum [5], Tamarix gallica [16], Glaucium flavum[13] ja Salsola kali[8], täyden kukintavaiheen ilmaosista. Kuten viime töissä, Artemisia herbalin LC-ESI-TOF-MS- ja GC-MS-profilointi suoritettiin fenolien, kuten flavonien, flavonolien ja flavonoidialkaloidien, tunnistamiseksi[7]. Toinen työ suoritettiin Pancratium maritimumilla, ja HPLC-DAD-ESI/MS-analyysi paljasti flavonoidien, mukaan lukien flavonolin, läsnäolon isorhamnetiinina niiden pentoksidi- ja heksosidikonjugaatteineen, kuten isorhamnetiinidiheksosidi [53].

Ei-rasvaisena yhdisteenä flavonolit voitaisiin eristää heksaanilla. Sitten voidaan käyttää polaarista liuotinta, kuten etanolia. Limoniastrum guyonianum -tutkimus HPLC:llä osoitti monien fenolien, muun muassa isorhamnetiini-3-O-rutinosidin [54], läsnäolon.

Kaukana fenoliuutteista, fenolisia yhdisteitä löytyy myös öljyistä, kuten oliiviöljystä [55]. Näillä yhdisteillä on kyky suojata öljyjä hapettumista vastaan ​​ja parantaa öljyn ravintoarvoa. Isorhamnetiinia on fenoliyhdisteenä havaittu myös öljyuutteesta Tunisian mustakuminan (Nigella sativa L.) siemenistä, jotka on saatu vihreällä liuottimella, kuten 2-metyylitetrahydrofuraanilla (MeTHF) öljyn tai heksaanin vaihtoehtona. -pohjainen liuotin öljyllä rikastettujen fenoliyhdisteiden uuttamiseen [10]. Isoramnetiinin läsnäolo hyväksyttiin HPLC-analyysillä. Analyysit, joissa käytettiin nestekromatografiaa diodirividetektorilla (LC-DAD), paljastivat suuren isorhamnetiinimäärän, joka vaihteli välillä 6,3-6,6 (ug/g öljyä), kun öljy oli uutettu mustakuminasta MeTHF:llä ja vastaavasti heksaanilla. Lisäksi H-ydinmagneettiresonanssia (HNMR) ja C-ydinmagneettista resonanssia (CNMR) käyttämällä jotkin flavonoliglykosidit, kuten kaempferoli{10}}O-rutinosidi (nikotifloriini) ja isorhamnetiini-3-O-rutinosidi (narsismi) luonnehdittiin Peucedanum aucheri Boissin ilmaosista, jotka on kerätty Marivanin kaupungista Kurdistanin maakunnassa Iranissa [56]. NMR-menetelmä havaitsee ominaisuuden, että yhdisteen tietyt atomiytimet ovat vuorovaikutuksessa magneettikentän kanssa. Tämä ominaisuus, joka on tuottaa magneettista resonanssia tietyllä taajuudella, antaa tietoa molekyylin rakenteesta. Toiseksi valitaan matemaattiset mallit flavonolin uuton tehokkuuden arvioimiseksi, erityisesti jotta ymmärrettäisiin paras tapa saada isorhamnetiini-3-O-rutinosidi [20]. Monimuuttuja-tekijäanalyysi suoritettiin käyttämällä Calendula officinalis -kasvin kukkia. Lineaarisia, neliöllisiä, täyskuutiomaisia ​​ja erikoiskuutiomalleja analysoitiin. Lopullinen täysi kuutio oli sopivin, mikä mahdollisti isorhamnetiini-3-O-rutinosidin uuttamisen tehokkuuden 60 prosenttia. Tässä tutkimuksessa entsyymejä Rapides Maxi Fruit ja Viscozyme käytettiin joissakin tärkeissä entsyymiaktiivisuuteen vaikuttavissa tekijöissä ylikriittisissä CO2-olosuhteissa, kuten paine, lämpötila, pH, aika ja vesipitoinen etanoliliuos. Lopuksi ylikriittisen nesteen uuttomenetelmää käytettiin fenoliyhdisteiden, kuten flavonolien, uuttamiseen. Monia vuosia sitten Eucalyptus globulus -kuoressa käytettiin ensimmäistä kertaa ylikriittistä nesteen uuttomenetelmää, jossa käytettiin puhdasta ja modifioitua CO2:ta veden, etyyliasetaatin ja etanolin kanssa [57]. Kirjoittajat osoittivat, että ylikriittinen CO2 yhdistettynä etanoliin voisi uuttaa merkittäviä määriä fenoliyhdisteitä, mukaan lukien isorhamnetiini. HPLC-MS-kvantifiointi määritti joitakin flavonoleja, kuten isorhamnetiini-heksosidin (0,26 gg-I uutetta) ja yksinkertaista isorhamnetiinia (14,29 mg:gI uutetta). Apuliuottimena käytettiin etanolia. Kvantitointi suoritettiin korkeapainenestekromatografialla, joka oli varustettu fotodiodirividetektorilla. Isorhamnetiini 3-O-glukosyyliramnosyyliramnosidi, isorhamnetiini 3-O-glukosyyliramnosyylipentoksidi, isorhamnetiini 3-O-glukosyyliramnosidi ja isorhamnetiini 3-O-glukosyyli -pentoksidi olivat runsaimmat flavonolit, jotka uutettiin O. ficus-indican superkriittisistä uutteista. Kuten aiemmin mainittiin, korkeapainenestekromatografia tai HPLC on yleisesti käytetty menetelmä fenoliyhdisteiden analysointiin. Omenamehussa ja päärynämehussa havaittiin isorhamnetiini 3-O-glukosidia. Itse asiassa flavonoliglykosidien erottaminen "Brettacher"-omenauutteesta HPLC:llä ja massaspektrometrialla paljasti kahden glykosidimuodon, kuten isorhamnetiini 3-O-glukoosin ja isorhamnetiini 3-O-galaktosidin [ 58].