OSA Ⅰ: SIK1:n rooli akuutin munuaisvaurion siirtymisessä krooniseksi munuaissairaudeksi

Yhteystiedot: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Sähköposti:audrey.hu@wecistanche.com

Jinxiu Hul, JiaoQiaot, Qun Yul, Bing Liu1 ja muut.

Tausta

Akuutti munuaisvaurio(AKI), yleinen sairaus, jolle on tunnusomaista glomerulusten suodatusnopeuden (GFR) lasku ja seerumin kreatiniinin nousu [1], pidetään riskitekijänä kroonisen munuaisten vajaatoiminnan kehittymiselle ja etenemiselle[2,3]. Äskettäin AKI-CKD(Akuutti munuaisvaurio krooniseksi munuaissairaudeksi) siirtymisestä on tullut yksi munuaissairauksien tutkimuksen hotspoteista. Vaikka on raportoitu, että tulehduksella, EMT:llä ja fibroosilla on tärkeä rooli AKI-CKD:n etenemisessä(Akuutti munuaisvaurio krooniseksi munuaissairaudeksi)siirtymä [4,5], AKI-CKD:n tarkka molekyylimekanismi(Akuutti munuaisvaurio krooniseksi munuaissairaudeksi)siirtymä on vielä epäselvä.

cistanche hoitaa munuaissairauksia ja ehkäisee munuaisten vajaatoimintaa

Suolalla indusoituva kinaasi 1(SIK1) kuuluu AMP-aktivoitujen proteiinikinaasien (AMPK) perheeseen, jolla on keskeinen rooli aineenvaihdunnan, solujen selviytymisen ja kasvun säätelyssä [6, 7]. Tutkimukset ovat osoittaneet, että SIK1:n esto(Suolalla indusoituva kinaasi 1)edistää EMT:tä, mikä johtaa kasvainten migraatioon ja etäpesäkkeisiin[8-10]. Lisäksi kerrottiin, että SIK1(Suolalla indusoituva kinaasi 1)säätelee negatiivisesti TLR{0}}indusoitua NF-kB:n aktivaatiota ja heikentää proinflammatoristen sytokiinien ilmentymiä [11]. Lisäksi esiintulevat todisteet osoittivat yhteyden SIK1:n välillä(Suolalla indusoituva kinaasi 1)ja munuaissairaudet [6,12]. Esimerkiksi SIK1:n lisäsääntely(Suolalla indusoituva kinaasi 1)käänsi korkean glukoosin aiheuttaman mesangiaalisolujen proliferaation ja ekstrasellulaarisen matriisin (ECM) kertymisen estämällä FN:n ja PAI:n-1 ilmentymistä, jotka molemmat ovat osallisia fibroottisissa sairauksissa, kuten glomeruloskleroosissa [6,13]. Näin ollen oletamme, että SIK1(Suolalla indusoituva kinaasi 1)saattaa olla osallisena AKI-CKD:n etenemisessä(Akuutti munuaisvaurio krooniseksi munuaissairaudeksi)siirtymä, jolle on ominaista EMT, tulehdus ja munuaisfibroosi.

WNT/-kateniinireitti on monimutkainen, erittäin konservoitunut signalointireitti, joka säätelee erilaisia ​​biologisia prosesseja, kuten elinten kehitystä, kudosten homeostaasia ja karsinogeneesiä [14, 15]. Vaikka se on hiljainen normaalissa aikuisen munuaisessa, sen on havaittu aktivoituvan uudelleen useissa munuaissairauksissa, mukaan lukien akuutti munuaisvaurio, diabeettinen nefropatia, interstitiaalinen fibroosi ja kystiset munuaissairaudet [16]. Lisäksi on raportoitu, että WNT/-kateniinireitin hiljentäminen parantaa munuaisfibroosia ja viivästyttää AKI-CKD:n etenemistä(Akuutti munuaisvaurio krooniseksi munuaissairaudeksi)I/R-indusoidussa vammassa [17]. Mutta onko SIK1(Suolalla indusoituva kinaasi 1)voisi osallistua AKI-CKD:hen(Akuutti munuaisvaurio krooniseksi munuaissairaudeksi)siirtyminen moduloimalla WNT/-kateniinireittiä on vielä selvitettävä.

Uudet todisteet ovat osoittaneet, että Snail ja Twistl, EMT-transkriptiotekijät, ovat tärkeitä munuaisfibroosin patogeneesissä[18-20]. Raportoitiin, että Twistlin tai Snailin ehdollinen deleetio proksimaalisissa tubulaarisissa epiteelisoluissa esti EMT:tä, heikentäen interstitiaalista fibroosia kokeellisesti indusoidussa munuaisfibroosissa hiirillä [21]. Koska Snail ja Twist1 ovat merkittäviä molekyylejä, jotka sijaitsevat alavirtaan WNT/-catenin-reitistä, arvelimme, että niillä voi olla myös tärkeä rooli SIK1:ssä(Suolalla indusoituva kinaasi 1)välittää AKI-CKD(Akuutti munuaisvaurio krooniseksi munuaissairaudeksi)siirtyminen.

Siksi tässä tutkimuksessa pyrimme selventämään SIK1:n roolia ja mekanismiaSuolalla indusoituva kinaasi 1) AKI-CKD:ssä(Akuutti munuaisvaurio krooniseksi munuaissairaudeksi)siirtymä, joka tarjoaa uuden terapeuttisen kohteen munuaisfibroosin kliiniselle ehkäisylle ja hoidolle ja tarjoaa uuden tavan viivyttää AKI-CKD:n etenemistä(Akuutti munuaisvaurio krooniseksi munuaissairaudeksi)siirtyminen.

cistanche munuaissairauksien hoitoon

Materiaalit ja menetelmät

Potilaat ja kudosnäytteet

Tutkimuksen hyväksyi Shandongin yliopistoon kuuluvan Shandongin maakunnan sairaalan kliinisen tutkimuksen etiikkakomitea. Ihmisen munuaisnäytteet otettiin potilailta, joilla oli AKI (Akuutti munuaisvaurio) diagnosoitu munuaisbiopsian perusteella, ja kontrolliryhmien munuaisnäytteet otettiin kirurgisen resektion saaneiden munuaiskasvainpotilaiden parasyöpäkudoksesta. Kudosnäytteet säilytettiin nestetypessä ja kaikki potilaat allekirjoittivat tietoisen suostumuksen Helsingin julistuksen mukaisesti.

AAV{0}}Sik1:n rakentaminen(Suolalla indusoituva kinaasi 1)

Rekombinantin adeno-assosioituneen viruksen (AAV9-Sik1) ja adeno-assosioituneen virusnegatiivisen kontrollin (AAV9-NC) rakensi GENECHEM (Shanghai, Kiina). Rekombinantti AAV9-Sik1-adeno-assosioitunut virusvektori GV467 sisältää promoottorin, vasta-ainetta koodaavan alueen, EGFP:tä vihreää fluoresoivaa proteiinia koodaavan alueen ja 3FLAG-merkkiproteiinia koodaavan alueen. AAV9-vektorin kyky transdusoida munuaisia ​​on varmistettu (lisätiedosto 1).

Eläimet ja mallinnusmenetelmät

Shandongin yliopiston eläinten hoito- ja käyttökomitea on hyväksynyt mallinnus- ja seurantakokeelliset ohjelmat. C57BL/6-hiiret, joiden ikä oli 4-6 viikkoa ja painoi 15-20 g, toimitti Shandongin yliopiston Experimental Animal Center, ja ne jaettiin satunnaisesti 4 ryhmään: kontrolliryhmä (kontrolli), normaalit hiiret, joita hoidettiin AA-ryhmällä ( AA), AA-hiiret, joita hoidettiin AAV9-Sik1-ryhmällä (AAV9-Sik1 plus AA), AA-hiiret, joita hoidettiin AAV{10}}NC-ryhmällä (AAV9-NC plus AA) . AA-ryhmän hiirille injektoitiin AA:ta (10 mg/kg) intraperitoneaalisesti, kun taas kontrolliryhmän hiirille injektoitiin PBS:ää. 3., 7., 14. ja 28. päivänä AA-injektion jälkeen hiirten 24 tunnin virtsa kerättiin aineenvaihduntahäkkiin ja supernatanttia säilytettiin -20 C-asteessa sentrifugoinnin jälkeen. Verta sentrifugoitiin nopeudella 3000 r 10 minuuttia, ja supernatanttia säilytettiin -20 asteessa 0,24 tunnin virtsan proteiini, seerumin kreatiniini (Scr) ja veren ureatyppi (BUN) mitattiin automaattisella biokemiallisella analysaattorilla. ELSA havaitsi seerumin IL-1 ja TNF-. Sitten hiiret tapettiin ja punnittiin. Sen jälkeen munuaiset leikattiin ja punnittiin. Kaikki munuaisnäytteet jaettiin kahteen osaan, joista toinen kiinnitettiin 4-prosenttisessa paraformaldehydissä histologista värjäystä varten, kun taas toista säilytettiin alle -80 asteen reaaliaikaista PCR- ja Western blot -detektiota varten.

Histologia ja immunohistokemia

Kiinnityksen jälkeen 4-prosenttisessa paraformaldehydissä munuaisnäytteet kuivattiin, läpinäkyvät, upotettiin parafiiniin ja leikattiin 4 μm:n paksuisiksi viipaleiksi. Myöhemmin objektilaseilta poistettiin vaha, hydratoitiin ja värjättiin. Munuaisten histologiseen analyysiin käytettiin HE-värjäystä, PAS-värjäystä ja Massonin trikromivärjäystä valmistajan ohjeiden mukaisesti. Immunohistokemiallista analyysiä varten leikkeitä inkuboitiin primaarisen vasta-aineen kanssa SIK1:tä vastaan(Suolalla indusoituva kinaasi 1)(51045-1-AP, Proteintech, USA), E-kadheriini (20874-1-AP, Proteintech, USA), -SMA (ab32575, Abcam, USA), COL1(bs-10423R, Bioss , Peking, Kiina) 4 asteessa yön yli. Sekundaarisen vasta-aineen kanssa inkuboinnin jälkeen DAB lisättiin, mitä seurasi tumavastavärjäys hematoksyliinilla. Lopuksi kuvia tarkkailtiin mikroskoopilla (Leica, Saksa). SIK1:n positiivisen värjäytymisen prosenttiosuus(Suolalla indusoituva kinaasi 1), E-kadheriini, -SMA ja COLl mitattiin käyttämällä kvantitatiivista Image-Pro plus 6.0 -ohjelmistoa (Media Cybernetics, Silver Spring, MD) [22].

Soluviljely ja hoito

Ihmisen proksimaalisia tubulaarisia epiteelisoluja (HK2) viljeltiin DMEM-elatusaineessa (Gibco, USA), jota oli täydennetty 10 prosentilla naudan sikiön seerumilla (FBS) (Gibco, USA) ja 1 prosentilla penisilliini-streptomysiinillä (Sigma, USA) 37 °C:ssa kostutettu ilmakehä, joka sisältää 5 prosenttia CO,. Aristolokkihappoa(AA) (Sigma, USA) liuotettiin DMSO:hon pitoisuuteen 1 mg/ml ja soluja käsiteltiin lopullisella konsentraatiolla 10 μmol/L, 20 μmol/L, 40 μmol/L ja 60 μmol/L, ja kontrolliryhmää käsiteltiin samalla määrällä DMSO:ta.

Lentivirusvektoritransduktio ja siRNA-transfektio Lentivirus-shRNA rakentaa kohde-SIK1:n(Suolalla indusoituva kinaasi 1), -kateniini ja sekoitettu shRNA sekä lentiviruksen yliekspressiovektori SIK1:lle(Suolalla indusoituva kinaasi 1)ja tyhjän kontrollivektorin rakensi Cyagen (Guangzhou, Kiina). Kohdesekvenssit on lueteltu seuraavasti: SIKI shRNA:5'-GCGCGTGCATTGATTACTATC-3';

Desert Citanchen edut: kroonisten munuaissairauksien hoito

Tulokset

SIK1(Suolalla indusoituva kinaasi 1)AKI:ssa säänneltiin alas(Akuutti munuaisvaurio)

Ottaen huomioon, että SIK1(Suolalla indusoituva kinaasi 1)sillä on merkittävä rooli munuaisvauriossa, havaitsimme ensin SIK1:n ilmentymisen(Suolalla indusoituva kinaasi 1)AKI:n munuaiskudoksissa(Akuutti munuaisvaurio)potilaat ja AKI(Akuutti munuaisvaurio)hiiret. Immunohistokemiallinen värjäys paljasti, että ei vain potilailla vaan hiirillä, SIK1(Suolalla indusoituva kinaasi 1)munuaistiehyiden ilmentyminen kontrollissa on korkeampi kuin AKI:ssa(Akuutti munuaisvaurio)ryhmä, joka osoitti, että SIK1(Suolalla indusoituva kinaasi 1)säädeltiin alas AKI:n aikana(Akuutti munuaisvaurio)(Kuva la,b). Lisäksi suoritimme HE- ja Massonin trikromivärjäyksen analysoidaksemme histopatologisia muutoksia AKI:n munuaisnäytteissä(Akuutti munuaisvaurio)potilailla (kuvio 1c). Verrattuna kontrolliin, munuaisten tubulaaristen epiteelisolujen turvotusta, tyhjiödegeneraatiota ja interstitiaalista turvotusta havaittiin AKI-ryhmässä HE-värjäyksellä. Lisäksi verrattuna kontrolliin Massonin trikromivärjäyksellä havaittiin AKI-ryhmässä erityisesti litistyneet putkimaiset solut, irronneet harjan reunat ja suurentuneet putkimaiset liinavaatteet. Yhdessä kaikki nämä havainnot osoittivat, että SIK1(Suolalla indusoituva kinaasi 1)saattaa olla osansa putkivammassa.

Kuva 1 SIK1 säädettiin alas AKI:ssa(Akuutti munuaisvaurio).Edustavia immunohistokemiallisia värjäyskuvia SIK1:stä kontrollissa ja AKI:ssa(Akuutti munuaisvaurio)potilaita. Mittakaavapalkki=50 μm. Kaavio osoitti SIK1:n kvantitatiivisen analyysin immunohistokemiallisesti värjätyissä leikkeissä.b Edustavia immunohistokemiallisia värjäyskuvia SIK1:stä kontrollissa ja AKI:ssa(Akuutti munuaisvaurio)hiiret. Mittakaavapalkki=50 μm. Kaavio osoitti SIK1:n kvantitatiivisen analyysin immunohistokemiallisesti värjätyissä leikkeissä. c Edustavia kuvia HE:n ja Massonin trikromivärjäytymisestä AKI:n munuaiskudoksista(Akuutti munuaisvaurio)potilaita. Mittakaavapalkki=10 μm. Tiedot esitetään muodossa keskiarvo±sd *P<0.05 vs="" control.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">

SIK1(Suolalla indusoituva kinaasi 1)oli alasäädelty AA-indusoidussa AKI-CKD:ssä(Akuutti munuaisvaurio krooniseksi munuaissairaudeksi)siirtymähiiret

AKI-CKD:n hiirimallin saamiseksi(Akuutti munuaisvaurio krooniseksi munuaissairaudeksi)injektoimme AA:ta intraperitoneaalisesti hiiriin. Verrattuna kontrolliin AA:lla käsitellyt hiiret osoittivat lisääntynyttä tulehdustekijöiden, EMT:n ja munuaisfibroosin tuotantoa (kuviot 2a-d). Lisäksi munuaisindeksi, seerumin Scr, BUN ja 24 tunnin virtsan proteiini paranivat AA-hoidossa (kuvio 2e). Lisäksi AA heikensi munuaisten rakennetta, mikä johti munuaisten tubulaaristen epiteelisolujen surkastumiseen, kalkin suurenemiseen ja erilaiseen kollageenikuitujen kertymiseen tubulointerstitiumissa (kuva 2f). Kaikki yllä osoitti, että AA-indusoitu AKI-CKD(Akuutti munuaisvaurio krooniseksi munuaissairaudeksi)siirtymämalli luotiin onnistuneesti. Tutkia SIK1:n roolia(Suolalla indusoituva kinaasi 1)AA-indusoidussa AKI-CKD:ssä(Akuutti munuaisvaurio krooniseksi munuaissairaudeksi) siirtymävaiheessa, arvioimme sen ilmentymisen hiirten munuaisnäytteissä, joihin oli injektoitu AA:ta. Löysimme SIK1(Suolalla indusoituva kinaasi 1)ja p-SIK1(Suolalla indusoituva kinaasi 1)(Thr182) väheni ajasta riippuvalla tavalla AA-injektion jälkeen (kuva 2g), mikä osoittaa SIK1:n mahdollisen roolin(Suolalla indusoituva kinaasi 1)AA:n aiheuttaman AKI-CKD:n säätelyssä(Akuutti munuaisvaurio krooniseksi munuaissairaudeksi)siirtyminen.

Kuvio 2 SIK1 oli alasäädelty AA-indusoidussa AKI-CKD:ssä(Akuutti munuaisvaurio krooniseksi munuaissairaudeksi)siirtymähiiret.ELISA-analyysi IL-1- ja TNF-ilmentymisestä eri hiirryhmissä. b Western blot ja reaaliaikainen PCR-analyysi tulehdus- ja fibroosimarkkerien (kaspaasi1/p20/p10, FN ja COL1) ilmentymisestä; c Western blot ja reaaliaikainen PCR-analyysi EMT-markkerien (E-kadheriini, vimentiini ja -SMA) ilmentymisestä. d Edustavia immunohistokemiallisia värjäyskuvia E-kadheriinista eri hiiriryhmissä. Mittakaavapalkki=50 μm. Kaavio osoitti E-kadheriinin kvantitatiivisen analyysin immunohistokemiallisesti värjätyissä leikkeissä. e Munuaisindeksi, Scr, BUN ja 24 tunnin virtsan proteiinitasot eri hiiriryhmissä. f Edustavia histologisia värjäyskuvia (HE, PAS ja Massonin trikromivärjäys) munuaiskudoksista eri hiiriryhmissä. Mittakaavapalkki=50 μm. g Western blot -analyysi SIK1- ja p-SIK (Thr182) -proteiinitasoista C57BL/6-hiirissä. Tiedot esitetään muodossa keskiarvo±sd *P<0.05 vs="" control.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">

SIK1:n yli-ilmentyminen(Suolalla indusoituva kinaasi 1)lievitti AA:n aiheuttamaa AKI-CKD:tä(Akuutti munuaisvaurio krooniseksi munuaissairaudeksi)siirtyminen

SIK1:n toiminnon määrittäminen(Suolalla indusoituva kinaasi 1)AA-indusoidussa AKI-CKD:ssä(Akuutti munuaisvaurio krooniseksi munuaissairaudeksi)injektoimme AAV{0}}SikI:tä hiirten häntälaskimoon yliekspressoimaan SIK1:tä(Suolalla indusoituva kinaasi 1). Huomasimme, että AAV{0}}Sik1-injektion jälkeen AA:n aiheuttama munuaisten toimintahäiriö parani merkittävästi, mikä on osoituksena munuaisindeksin, Scr:n, BUN:n ja 24 tunnin virtsan proteiinin alentumisesta (kuva 3a). Reaaliaikainen PCR paljasti, että AAV9-Sik1(Suolalla indusoituva kinaasi 1)helpotti AA:n aiheuttamaa tulehdusvastetta (kuvio 3b). Lisäksi AAV9-Sik1(Suolalla indusoituva kinaasi 1)paransi merkittävästi AA:n aiheuttamaa histopatologista vauriota (kuvio 3c). Lisäksi immunohistokemiallisen värjäyksen tulokset viittasivat siihen, että AAV9-Sik1(Suolalla indusoituva kinaasi 1)helpottaa interstitiaalista fibroosia ja EMT:tä AA:n aiheuttaman AKI-CKD:n prosessissa(Akuutti munuaisvaurio krooniseksi munuaissairaudeksi)siirtymä (kuva 3d). Kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittivat, että SIK1(Suolalla indusoituva kinaasi 1)Sillä oli suojaava rooli AA-indusoidussa AKI-CKD:ssä(Akuutti munuaisvaurio krooniseksi munuaissairaudeksi)siirtyminen.

cistanchen terveyshyödyt: parantaa munuaisten toimintaa

SIK1(Suolalla indusoituva kinaasi 1)AA-käsitellyissä HK2-soluissa säädelty alas. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että munuaisten proksimaalinen tubulus on yksi AKI:n päävauriokohteista.(Akuutti munuaisvaurio)ja proksimaalisen tubuluksen vauriolla voi olla tärkeä patofysiologinen rooli AKI-CKD:n kehittymisessä(Akuutti munuaisvaurio krooniseksi munuaissairaudeksi)siirtyminen. Arvioidakseen edelleen, onko SIK1(Suolalla indusoituva kinaasi 1)oli alasäädelty in vitro, keskityimme tässä tutkimuksessa HK2-soluihin. Suorittamalla CCK8-määrityksiä valitsemme 10 μmol/L AA:ta optimaaliseksi pitoisuudeksi seuraaviin kokeisiin (Lisätiedosto 2). Johdonmukaisesti AA-hoito osoitti lisääntynyttä tulehdusta, EMT:tä ja fibroosia HK2-soluissa (kuviot 4a-c), mikä viittaa AA-indusoituun HK2-soluvaurioon in vitro. Myöhemmin tutkimme SIK1:n proteiinitasoja(Suolalla indusoituva kinaasi 1)ja havaitsi huomattavasti alentunutta SIK1:tä(Suolalla indusoituva kinaasi 1)ja p-SIK1(Thr182) HK2-soluissa AA:n läsnä ollessa (kuvio 4d). Lisäksi havaitsimme SIK1:n sijainnin(Suolalla indusoituva kinaasi 1)proteiini HK2-soluissa ennen ja jälkeen altistuksen AA:lle immunofluoresenssivärjäyksellä. Stimuloimattomissa soluissa SIK1(Suolalla indusoituva kinaasi 1)havaittiin sekä tumassa että sytoplasmassa. AA:lla käsiteltynä SIK1:n ilmentyminen(Suolalla indusoituva kinaasi 1)alennettiin ja SIK1(Suolalla indusoituva kinaasi 1)havaittiin vähitellen ytimessä (lisätiedosto 3). Yhdessä nämä tulokset selvensivät, että SIK1 osallistui AA-indusoituun HK2-soluvaurioon.

Kuvio 3 SIK1:n yli-ilmentyminen lievitti AA-indusoitua AKI-CKD:tä(Akuutti munuaisvaurio krooniseksi munuaissairaudeksi)siirtyminen.a. Munuaisindeksi, Scr, BUN ja 24 tunnin virtsan proteiinitasot eri hiiriryhmissä. b Kaspaasi 1:n ja IL-1-mRNA-tasojen reaaliaikainen PCR-analyysi eri hiiriryhmissä. c HE-, PAS- ja Massonin trikromivärjäystä käytettiin arvioimaan histologisia muutoksia ja tubulointerstitiaalisen fibroosin laajuutta. Mittakaavapalkki=50 µm. d Edustavia immunohistokemiallisia värjäyskuvia E-kadheriinista, -SMA:sta ja COLI-proteiinista eri hiiriryhmissä. Mittakaavapalkki=50 µm. Kaaviot osoittivat E-kadheriinin, -SMA:n ja COL1:n kvantitatiivisen analyysin immunohistokemiallisesti värjätyissä leikkeissä. Tiedot esitetään keskiarvona ± sd *P< 0.05="" vs="" control,="">< 0.05="" vs="" aa.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">

cistanche-uute: parantaa munuaisten toimintaa

SIK1:n yli-ilmentyminen(Suolalla indusoituva kinaasi 1)parantunut AA-indusoitu HK2-soluvaurio

Selvittääksesi edelleen SIK1:n roolia(Suolalla indusoituva kinaasi 1)AA-indusoidussa HK2-soluvauriossa rakensimme solulinjoja, jotka säätelevät stabiilisti SIK1:tä(Suolalla indusoituva kinaasi 1)HK2-solujen lentivirusinfektio (Lisätiedosto 4). SIK1:n yli-ilmentyminen johti merkittävästi lisääntyneeseen E-kadheriiniin ja tukahdutti Caspasel/p20/p10:n, Vimentinin, COLI:n ja Fspl:n pelkällä AA:lla stimuloituihin kontrollisoluihin verrattuna (kuvio 4e, f). Lisäksi SIK1:n yli-ilmentyminen(Suolalla indusoituva kinaasi 1)esti AA:n indusoimien HK2-solujen migraatiokykyä (kuvio 4g). Yhdessä nämä havainnot osoittivat, että SIK1(Suolalla indusoituva kinaasi 1)oli suojaava AA:n aiheuttamaa vauriota vastaan ​​HK2-soluissa.

Kuvio 4 SIK1 oli alasäädelty AA-käsitellyissä HK2-soluissa ja SIK1:n yli-ilmentyminen paransi AA-indusoitua HK2-soluvauriota.a. IL{{0}}- ja TNF-tasojen ELISA-detektio HK2-solujen supernatantista, joita on käsitelty 10 μmol/L AA:lla 0 h, 24 h, 48 h ja 72 h. b Western blot -analyysi kaspaasi 1/p20/p10-, E-kadheriini-, ZO-1-, vimentiini- ja -SMA-proteiinitasoista HK2-soluissa, joita on käsitelty 10 μmol/L AA:lla 0 h, 24 h, 48 h, ja 72 tuntia, suurin vaikutus 72 tunnin hoidon jälkeen. -aktiinia käytettiin kontrollina. c Varhaisten fibroosindikaattoreiden (COLI, PAI-1 ja MMP9) mRNA-tasojen reaaliaikainen PCR-analyysi HK2-soluissa, joita käsiteltiin 10 μmol/L AA:lla 72 tunnin ajan. d Western blot -analyysi p-SIK1(Thr182)- ja SIK1-tasoista HK2-soluissa, joita on käsitelty 10 μmol/L AA:lla 0 h, 24 h, 48 h ja 72 h. e Western blot -analyysi Caspase1/p20/p10:stä, E-kadheriinista, Vimentiinistä, Fsp1:stä ja COL1:stä HK2-soluissa, jotka on käsitelty SIK1-vektorilla (SIK1-lentiviruksen yliekspressiovektori) 10 µmol/l AA:n läsnä ollessa tai käsitelty 10 µmol:lla /L AA yksin 72 tuntia. f Edustavia immunofluoresenssikuvia E-kadheriinista ja Vimentinistä HK2-soluissa. Skaalauspalkki=50 μm. g HK2-solujen edustavat migraatiotulokset. Skaalauspalkki=50 μm. Tiedot esitetään muodossa keskiarvo±sd *P<0.05 vs="" control,=""><0.05 vs="" aa.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">

cistanche deserticola -uute: munuaissairauksien hoito

SIK1(Suolalla indusoituva kinaasi 1)säädelty WNT/-kateniinin signalointireitti in vivo ja in vitro

Ottaen huomioon WNT/-kateniinireitin kriittisen roolin AKI-CKD:ssä(Akuutti munuaisvaurio krooniseksi munuaissairaudeksi)siirtymistä, tutkimme, onko SIK1(Suolalla indusoituva kinaasi 1)sääteli WNT/-kateniinireittiä. In vivo -kokeissa havaitsimme, että SIK1:n yli-ilmentyminen(Suolalla indusoituva kinaasi 1)esti WNT1:n, p- -kateniinin (Y654) ja tumakateniinin proteiinitasoja AA-indusoidussa AKI-CKD:ssä(Akuutti munuaisvaurio krooniseksi munuaissairaudeksi)hiiret (kuvio 5a). Voit tutkia tarkemmin, onko SIK1(Suolalla indusoituva kinaasi 1)sääteli WNT/-kateniinireittiä in vitro, hiljentimme SIK1:n ilmentymisen(Suolalla indusoituva kinaasi 1)shRNA:lla HK2-soluissa (lisätiedosto 5). Yhdenmukaisesti in vivo -tulosten kanssa SIK1:n hiljentäminen johti huomattavasti kohonneisiin -kateniini-, TCF4- ja LEF1-mRNA-tasoihin (kuvio 5b). Sitä paitsi SIK1:n pudotus(Suolalla indusoituva kinaasi 1)lisäsi -kateniinin ja p- -kateniinin (Y654) proteiinitasoja (kuvio 5c). Lisäksi SIK1:n pudotus(Suolalla indusoituva kinaasi 1)edisti -kateniinin nukleaarista translokaatiota (kuvio 5d). Yhdessä nämä tiedot viittasivat siihen, että SIK1(Suolalla indusoituva kinaasi 1)sääteli WNT/-kateniinireittiä in vivo ja in vitro.

Kuva 5 SIK1 säätelee WNT/-kateniinireittiä in vivo ja in vitro.a. Western blot -analyysi SIK1-, WNT1-, p- -kateniini- (Y654) ja tuma-kateniiniproteiinitasoista eri hiiriryhmissä. b -kateniinin, TCF4:n ja LEF1:n reaaliaikainen PCR-analyysi HK2-soluissa, jotka on käsitelty SIK1 shRNA:lla tai Scramble shRNA:lla. c Western blot -analyysi -kateniini ja p- -kateniini(Y654) HK2-soluissa, jotka on käsitelty SIK1 shRNA:lla tai Scramble shRNA:lla.d Edustavia immunofluoresenssikuvia -kateniinista HK2-soluissa. Asteikkopalkki=50 um. Tiedot näytetään keskiarvo±sd*P<0.05 ys="" control.=""><0.05 ys="" aa.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">

WNT/-kateniinin signalointireitti liittyy AA-indusoituun HK2-soluvaurioon

Selvittääksemme, oliko WNT/-kateniinireitillä rooli AA-indusoidussa HK2-soluvauriossa, testasimme WNT1:n, tuman kateniinin ja p- -kateniinin (Y654) ekspressiotasoja AA-hoidon jälkeen. Western blot -tulokset osoittivat, että WNT1, ydinkateniini ja p- -kateniini (Y654) lisääntyivät merkittävästi AA-stimulaation jälkeen (lisätiedosto 6a). Lisäksi immunofluoresenssivärjäys paljasti -kateniinin tuman translokaation (lisätiedosto 6b), mikä viittaa siihen, että AA-stimulaatio voi aktivoida WNT/-kateniinin signalointireitin. Koska -kateniini on WNT/-kateniinireitin keskeinen komponentti, ihmettelemme, sääteleekö -kateniinin säätely AA-indusoitua HK2-soluvauriota. Siten katenimme stabiilisti -kateniinin shRNA lentiviruksella HK2-soluissa (lisätiedosto 6c). Ja havaitsimme, että -catenin knockdown heikensi AA-indusoitua Caspasel-, IL-1-, Vimentin-, PAI-1- ja MMP9-ilmentymistä ja edisti E-kadheriinin ilmentymistä (kuvat 6a, b). Lisäksi AA:lla stimuloidut -kateniini-shRNA-solut osoittivat merkittävästi vähentynyttä migraatiota verrattuna -kateniinikontrollisoluihin, jotka oli stimuloitu pelkällä AA:lla (kuvio 6c). Yhdessä nämä havainnot viittasivat siihen, että WNT/-kateniinireitti oli osallisena AA:n aiheuttamassa HK2-soluvauriossa.

Kuva 6 WNT/B-kateniinin signalointireitti liittyy AA-indusoituun HK2-soluvaurioon.HK2-soluja käsiteltiin B-catenin shRNA:lla tai Scramble shRNA:lla Caspase1.L-1BE-cadherin.Vimentin, PA/-1 reaaliaikaisen PCR-analyysin läsnä ollessa 10 umol/LAA. MMP9-mRNA-tasot HK2-soluissa. b Edustavat immunofluoresenssikuvat E-kadheriinista ja Vimentiinistä HK2-soluissa. Skaalauspalkki=50 um.c HK2-solujen edustavat migraatiotulokset. Asteikkopalkki=50 um. Tiedot esitetään muodossa keskiarvo±sd*P<0.05 vs="" control,=""><0.05 vs="" aa.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">

SIK1:lle vaaditaan WNT/-catenin-signalointireitti(Suolalla indusoituva kinaasi 1)AA:n indusoima välitteinen HK2-soluvaurio

Tutkia, onko SIK1(Suolalla indusoituva kinaasi 1)säädellyt AA:n aiheuttamat HK2-solujen vauriot WNT/-catenin-signalointireitin kautta, -kateniini väheni edelleen SIK1:ssä(Suolalla indusoituva kinaasi 1)HK2-solut. Verrattuna SIK1-knockdown-soluihin, -kateniinin lisäknockdown alensi Caspaselin, COLl:n ja Vimentinin mRNA-tasoja samalla kun lisäsi E-kadheriinin mRNA-tasoja (kuvio 7a). West-ern blot -tulokset olivat yhdenmukaisia ​​reaaliaikaisen PCR:n kanssa, mikä osoitti -kateniinin ja SIK1:n hiljentymisen kumoavan SIK1:n indusoiman E-kadheriinin, Caspasel/p20/p10:n ja Vimentinin lisääntymisen.(Suolalla indusoituva kinaasi 1)pudotus (kuva 7b).

Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että -kateniinin esto käänsi SIK1:n välittämän tulehdusvasteen, EMT:n ja fibroosin etenemisen(Suolalla indusoituva kinaasi 1)knockdown, joka paljastaa vahvasti, että WNT/-catenin-reitti vaadittiin SIK1:lle(Suolalla indusoituva kinaasi 1)AA:n indusoima välitteinen HK2-soluvaurio.

Kuvio 7 WNT/-kateniinireitti vaaditaan AA:n indusoimaa SIK1-välitteistä HK2-soluvauriota varten.HK-2-solut kotransfektoitiin SIK1- ja B-kateniini-shRNA:lla tai transfektoitiin pelkällä SIK1- tai -kateniini-shRNA:lla ja käsiteltiin sitten 10 umol/l AA:lla 72 hehtaarin Caspase1:n, COL1:n reaaliaikaiseen PCR-analyysiin. E-kadheriini ja Vimentin ilme. b. Kaspaasi1/p20/p10:n, E-kadheriinin ja vimentiinin ilmentymisen Western blot -analyysi. Tiedot esitetään keskiarvoina ± sd*P<0.05 vs=""><0.05 vs="" sik1="" shrna,=""><0.05vs β-catenin="" shrna.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">

Twist1:n rooli AA:n aiheuttamassa HK2-soluvauriossa

EMT-TF:inä toimiva Twistl voi edistää EMT:tä ja munuaisfibroosia. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että AA edisti Snail- ja Twist1-proteiinin ja Twist1:n proteiini- ja mRNA-ilmentymistä, kun taas knockdown -kateniini esti AA:n indusoimaa Snail- ja Twist1-ilmentymistä (kuva 8a). rooli AA:n aiheuttamassa HK2-soluvauriossa. Hypoteesimme vahvistamiseksi tyrmäsimme Twist1:n siRNA:lla (lisätiedosto 7) ja suoritimme reaaliaikaisen PCR- ja Western blot -analyysin. Kuten odotettiin, verrattuna kontrollisoluihin, joita stimuloitiin pelkällä AA:lla, Vimentinin ja COLI:n ilmentyminen väheni, kun taas ZO-1 lisääntyi Twist1 siRNA -soluissa AA:n läsnä ollessa, mikä viittaa siihen, että Twist1:n hiljaisuus lievitti EMT:n esiintymistä. ja AA:n indusoiman munuaisfibroosin eteneminen (kuviot 8b ja c).

Kuvio 8 Twistin rooli AA-indusoidussa HK2-soluvauriossa.Western blot ja reaaliaikainen PCR-analyysi Snail- ja Twist1-tasoista HK2-soluissa. b Twist1-, COL1-, ZO-1- ja Vimentin-tasojen reaaliaikainen PCR-analyysi HK2-soluissa, jotka on käsitelty Twist1 siRNA:lla tai NC siRNA.c:llä. Western blot -analyysi Twist1-, ZO-1- ja vimentiinitasoista HK2-soluissa, jotka on käsitelty Twist1 siRNA:lla tai NC siRNA:lla. Tiedot esitetään muodossa keskiarvo±sd*P<0.05 ys="" control.=""><0.05 ys="" aa.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">

NAPSAUTA TÄSTÄ OSASIAKSI Ⅱ