Osa 3: Magnesiumin ulosvirtaus Drosophila Kenyon -soluista on kriittistä normaalille ja ruokavaliolla tehostetulle pitkäkestoiselle muistille

lisätietoja:ali.ma@wecistanche.com

Pls napsauta tästä päästäksesi osaan 2

NapsautaCistanchen hyödyt ja sivuvaikutukset muistille

oli rajoitettu aikuisiin kärpäsiin, mikä viittaa siihen, että UEX:llä on kestävämpi rooli hermosolujen fysiologiassa. Sitä vastoin uex-ilmaisun kumoaminen abs- tai a{0}}b0-hermosoluissa ei heikentänyt LTM:ää. A0 b0 hermosolujen aktiivisuutta tarvitaan harjoituksen jälkeen, jotta se vahvistaa ruokahaluista LTM:ää (Krashes ja Waddell, 2008), kun taas abc- ja abs-KC-lähtö, yhdessä ja erikseen, on tarvitaan sen ilmaisuun (Krashes ja Waddell, 2008; Perisse et al., 2013). Siksi normaalin LTM-suorituskyvyn havainnointi kärpäsissä, joilla on uex-funktion menetys abs- ja a0b0-hermosoluissa, vastustaa yleistä ab-hermosolujen toiminnan puutetta uex:ää manipuloitaessa.

Ruokavalion Mg2 plus ei voinut parantaa viallista LTM-suorituskykyä perhoissa, jotka olivat konstitutiivisesti uex-mutantteja tai joissa oli ab KC-rajoitettu uex-funktion menetys. Kuitenkin uex:n ilmentäminen uex-mutanttikärpästen ab KC:issä palautti Mg2 plus:n kyvyn parantaa suorituskykyä. Siksi ab KC:t ovat Mg2 plus -parannetun solun lokusmuistilennossa.

Vaikuttaa ehkä intuitiiviselta, että UEX-ohjattu magnesiumin virtaus vaaditaan KC:ssä tukemaanmuisti- Mg2 plus ruokinnan tehostavat vaikutukset, kun ravinnon Mg2 plus nostaa KC [Mg2 plus ]i . Tässä vaiheessa voimme vain arvailla, miksi näin on. Oletamme, että erityisesti aivojen ja ab KC:iden on sopeuduttava tasapainoisesti korkeampiin solunsisäiseen ja solunulkoiseen Mg2 plus -tasoihin, jotka johtuvat ravintolisästä. KC [Mg2 plus]i:n elävä kuvantaminen villityypin ja uex-mutanttien aivoissa viittaa siihen, että UEX-suunnattu ulosvirtaus on todennäköisesti olennainen tekijä näiden kohonneiden tasojen aktiivisessa ja ehkä ärsykkeen aiheuttamassa homeostaattisessa ylläpidossa.

Useat nisäkässolutyypit pursottavat Mg2 plus:ta cAMP-riippuvaisella tavalla muutaman minuutin kuluttua altistumisesta b-adrenergiselle stimulaatiolle (Romani ja Scarpa, 2000; Vormann ja Gu¨nther, 1987; Jakob et al., 1989; Romani ja Scarpa, 1990b; Romani ja Scarpa, 1990a; Vormann ja Gu¨nther, 1987; Gu¨nther et ai., 1990; Howarth et ai., 1994). CNBH-domeenin läsnäolo viittaa siihen, että cAMP voisi säädellä suoraan UEX:ää ja CNNM:ää. Testasimme CNBH:n tärkeyden ottamalla käyttöön R622K-aminohapposubstituution, jonka pitäisi estää cAMP:n sitoutuminen UEX CNBH:ssa. Tämä hienovarainen mutaatio poisti uexR622K-siirtogeenin kyvyn palauttaa LTM-suorituskyky uex-mutanttiperhoille. Käytimme myös CRISPR:ää CNBH:n mutatoimiseen alkuperäisessä uex-lokuksessa. Vaikka CNBH:n poistaminen CNNM4:stä poisti Mg2- ja effluksiaktiivisuuden (Chen et al., 2018), uexT626NRR-leesion suhteen homotsygoottiset kärpäset olivat elinkelpoisia, mikä osoitti, että ne säilyttävät riittävän UEX-toiminnon. Nämä kärpäset olivat kuitenkin heikentyneet välittömästi ja pitkällä aikavälillämuisti. Lisäksi Mg2 plus -ruokinta ei voinut parantaa uexT626NRR-perhojen suorituskykyä. Nämä tiedot osoittavat, että ehjä CNBH on kriittinen elementtimuisti- relevantti UEX-toiminto. Klatriiniadapteriproteiinien sitoutuminen CNNM4 CNBH:hen on osallisena basolateraalisessa kohdistuksessa (Hirata et al., 2014), mikä viittaa siihen, että UEXT626NRR saattaa olla epäasianmukaisesti lokalisoitunut KC:ihin. Lisäksi CNNM2 E122K -mutanttivariantin KC-ekspressio, joka säilyttää jäännösfunktion

mutta sillä on salakuljetusvirhe (Arjona et al., 2014), ei palauttanut uex LTM -virhettä.

Vaikka on kyseenalaistettu, sitovatko CNNM2/3 CNBH-domeenit syklisiä nukleotideja (Chen et al., 2018), havaitsimme, että FSK aiheutti lisääntymisen ab KC [Mg2 plus ]i:ssä, joka oli herkkä uex-mutaatiolle, ja että UEX: :HA lokalisoitiin väärin rut2080-adenylaattisyklaasissa (Han et ai., 1992) ja dnc1-fosfodiesteraasissa (Dudai et ai., 1976), jotka oppivat viallisia mutanttikärpäsiä. Kun UEX::HA-leima jakautui tasaisesti g-, abc- ja abs-KC:issä villityypin kärpäsissä, UEX::HA-leima väheni g- ja abs-KC:issä ja oli vahvempi abc-hermosoluissa rut2080- ja dnc1-mutanteissa. CAMP:n krooniset manipulaatiot mutanteissa ovat siksi yhdenmukaisia ​​cAMP:n kanssa, joka vaikuttaa UEX:n lokalisaatioon, ehkä vuorovaikutuksessa CNBH:n kanssa. Lisäksi muuttunut UEX-lokalisointi voi vaikuttaamuistiviat rut2080- ja dnc1-perhoissa.

Fysiologiset tietomme käyttämällä Magnesium Greeniä nisäkässoluviljelmässä ja geneettisesti koodattua MagIC-reportteria ab KC:ssä osoittavat, että kärpäsen UEX helpottaa Mg2:ta ja ulosvirtausta. Kärpästen aivojen stimulointi FSK:lla sai aikaan suuremman ab KC [Mg2 plus]i:n kasvun uex-mutanttiaivoissa kuin villityypin kontrolleissa, mikä tarjoaa ensimmäisen todisteen siitä, että UEX rajoittaa [Mg2 plus]i:n nousua Drosophilan KC:issä. MagIC-tallenteet paljastivat myös ab KC [Mg2 plus ]i:n hitaan värähtelyn (keskipisteenä 0,015 Hz, noin kerran minuutissa), joka oli riippuvainen UEX:stä. Emme vielä ymmärrä tämän [Mg2 plus ]i-vaihtelun fysiologista toimintaa, vaikka se todennäköisesti heijastaa solujen homeostaattista järjestelmätason ominaisuutta. Biokemiallisella värähtelyaktiivisuudella on ratkaiseva rooli monissa solufysiologian näkökohdissa (Nova´k ja Tyson, 2008). Merkittävin [Mg2 plus ]i:n vuorokausiaikainen vaihtelu yhdistää solujen dynaamisen energia-aineenvaihdunnan kellon ohjattuun translaatioon Mg2 plus herkän mTOR-reitin (rapamysiinin mekaaninen kohde) kautta (Feeney et al., 2016). Siksi on mahdollista, että hitaat Mg2 plus värähtelyt voisivat yhdistää cAMP:n, UEX:n, energiavirran (Plac¸ais et al., 2017) ja mTOR-riippuvaisen translaation, joka on LTM:n kannalta merkityksellisen synaptisen plastisuuden taustalla (Casadio et al., 1999). Huber et ai., 2000; Beaumont et ai., 2001; Hou ja Klann, 2004; Hoeffer et ai., 2008).

Ota yhteyttä reagenssien ja resurssien jakamiseen

Täydellinen luettelo reagensseista on nähtävissä Key Resources -taulukossa.

Lisätiedot ja resursseja ja reagensseja koskevat pyynnöt tulee lähettää pääyhteyshenkilölle Scott Waddellille (scott.waddell@cncb.ox.ac.uk), ja hän vastaa ne.

Kokeellinen malli ja aihetiedot

Kärpäsen kannat

Ellei toisin mainita, kärpäsiä kasvatettiin tavallisella maissijauho-ruoalla 12 tunnin valo-pimeä-syklissä 60 prosentin kosteudessa ja 25 ˚C:ssa. GAL80ts-kokeiden testi- ja kontrollikärpäset nostettiin 18 ˚C:een. Kokeissa käytettiin 1–7-päivän ikäisiä sekakärpäsiä.

Canton-S oli villityypin kanta. Tässä tutkimuksessa käytetyt GAL4-ohjainlinjat ovat c739-GAL4 (McGuire et al., 2001), c305a-GAL4 (Krashes et al., 2007), NP7175-GAL4 (Tanaka et al., 2004), 0770-GAL4 (Gohl et al., 2011), MB247-GAL4 (Zars et al., 2000), nSyb-GAL4 (Bloomington Drosophila Stock Centre, BDSC 51635), elav-GAL4 (BDSC, 8765) ja uex-GAL4 (Kvon et ai., 2014); Wienin Drosophila Resource Center, VDRC, VT23256-GAL4). Varastokeskuksesta saadut UAS-linjat ovat UAS-CD8::GFP (BDSC, 5136), UAS-NmdarRNAi (BDSC, 25941) ja UAS-uexRNAi (BDSC, 36116). Erilaiset mutantti- ja siirtogeeniset linjat on kuvattu, uexMI01943 (Venken et ai., 2011; BDSC, 32805), uexNC1 (BDSC, 7167), rut2080 (Han et ai., 1992) ja dnc1 (Dudai et ai., 1976). tubP-GAL80ts (McGuire et ai., 2003) ja PhsILMiT (BDSC, 24613). UexMI01943.ex1 ja uexMI01943.ex2 Minos-leikkauslinjat luotiin käyttämällä menetelmää, joka on kuvattu julkaisussa Arc et ai., 1997. Yksityiskohtainen parituskaavio on esitetty kuvassa 2 – kuvan lisäys 2A. Mahdolliset leikkauslinjat muodostettiin yksittäisistä kärpäsistä, joilla oli keltaisen rungon värin fenotyyppi. Genominen DNA uutettiin kuudesta tällaisesta linjasta ja uexMI01943 MiMIC:n vieressä oleva DNA monistettiin PCR:llä ja sekvensoitiin. Linjojen uexMI01943.ex1 ja uexMI01943.ex2 havaittiin sisältävän tarkat leikkaukset, kun villityypin genominen sekvenssi oli palautettu. Katso PCR- ja sekvensointialukesekvenssit resurssitaulukosta. Kaavio uexMI01943 MiMIC -lisäyksen ja leikkausten sekvenssin yksityiskohdista on esitetty kuvassa 2 – kuvan lisäys 2B. UAS-uex-siirtogeenisten kärpästen rakentamiseksi täyspitkä uex-koodaussekvenssi (CDS) kloonattiin RT-PCR:llä. Kokonais-RNA eristettiin villityypin kärpäsistä käyttämällä TRIZOLia (Thermo Fisher, 15596018) ja käänteistranskriptoitiin cDNA:ksi käyttämällä SuperScript III -ensimmäisen juosteen synteesijärjestelmää (Invitrogen, 18080400). Tätä kokonais-cDNA-seosta käytettiin templaattina uex CDS:n monistamiseen. Katso alukesekvenssit resurssitaulukosta. PCR-tuote digestoitiin SacII:lla ja Xhol:lla ja ligoitiin sitten pUAST:n komplementaarisiin kohtiin (Brand ja Perrimon, 1993). pUAST-kloonattu uex-CDS sekvensoitiin täysin ja varmistettiin edustavan villityypin uex-cDNA-lukukehyksen 2505 bp:tä (huomaa, että kaikki neljä mahdollista uex-mRNA-isoformia, FlyBase Release 6, koodaavat samaa 834 aminohapon proteiinia). UAS-uex-siirtogeeniset kärpäset tuotettiin kaupallisesti (Bestgene) transformoimalla pUAST-uex-vektorilla. Kartoimme 10 itsenäisen siirtogeenisen linjan UAS-uex-kromosomi-insertion ja testasimme käyttäytymisessä kolme linjaa, jotka merkitään UAS-uex3M, UAS-uex5M ja UAS-uex8M, insertillä kolmannessa kromosomissa. UAS-uex3M-perhoja käytettiin koko tutkimuksen ajan ja joihin viitattiin käsikirjoituksessa nimellä UAS-uex.

UAS-uexR622K-siirtogeeniset kärpäset tuotettiin samalla tavalla kuin UAS-uex-perhot. Missense-mutaatio lisättiin UEX:n kodoniin 622 CNBH-domeeniin, jäljitellen sitä, joka oli aiemmin muokattu proteiinikinaasi A:n säätelyalayksikön cAMP:tä sitovassa domeenissa (Bubis et ai., 1988). Mutaatio muuttaa Arg:ta koodaavan CGT-kodonin Lys:ää koodaavaksi AAA:ksi. Mutaatio vietiin villityypin uex-CDS:ään käyttämällä Gibson Assembly Master Mixiä (New England Biolabs, E2621S), kuten on kuvattu kohdassa "Parannetut menetelmät kohdennetulle mutageneesille käyttäen Gibson Assembly Master Mixiä" (NEB Application Note). Käytetyt alukesarjat on kuvattu yksityiskohtaisesti resurssitaulukossa. Gibsonin kokoonpanon tuotetta monistettiin edelleen PCR:llä ja saatu tuote kloonattiin pUAST-vektoriin ja sekvensoitiin. Siirtogeeniinsertiot kartoitettiin kuten UAS-uex:lle ja yhtä kahdesta kolmanteen kromosomiin kartoitetusta insertiosta käytettiin käyttäytymiskokeissa.

Siirtogeeniset UAS-CNNM2-, UAS-CNNM2E122K-, UAS-CNNM2E357K-, UAS-CNNM2S269W- ja UAS-CNNM2T568I-perholinjat luotiin transformoimalla pUAST-konstrukteilla, jotka sisälsivät villityypin tai pistemutatoidut versiot hiiren CNNM2:lla merkityn CNNM2:n kanssa. HA), kuvataan julkaisussa Arjona et ai., 2014. CNNM2:n villityypin tai mutatoidut versiot monistettiin alkuperäisistä mCNNM2::HA-klooneista pCiNEO_IRES_GFP-plasmideissa (Arjona et al., 2014). Alukkeet on esitetty yksityiskohtaisesti resurssitaulukossa. PCR-tuotteet digestoitiin Xhol:lla ja Xbal:llä ja ligoitiin komplementaarisiin kohtiin pUAST:ssa. Kunkin konstruktin lisäykset kolmanteen kromosomiin tunnistettiin kartoittamalla edellä kuvatulla tavalla ja niitä käytettiin käyttäytymiskokeissa. Huomaa, että kaikki tutkimuksessa käytetyt CNNM2-koodauskonstruktit on HA-merkitty, vaikka merkintä on usein jätetty pois lyhyyden vuoksi.

Siirtogeeniset UAS-MagFRET-1-perholinjat luotiin transformoimalla pJFRC-MUH-konstrukteilla, jotka sisälsivät MagFRET-1 CDS:n, joka alakloonattiin pCMVMagFRET-1-plasmidista, jotka on kuvattu julkaisussa Lindenburg et ai. , 2013. Pohjusteet on kuvattu yksityiskohtaisesti resurssitaulukossa. PCR-tuotteet digestoitiin Xhol:llä ja Xbal:llä ja ligoitiin komplementaarisiin kohtiin pJFRC-MUH:ssa. Rakenteen insertio välitti paikkaspesifinen siirtogeneesijärjestelmä ja laskeutumiskohta on attP2 (kolmannessa kromosomissa).

Siirtogeeniset UAS-MagIC- ja UAS-MARIO-perholinjat luotiin transformoimalla pTW-konstrukteilla, jotka sisälsivät MagIC/MARIO CDS:t, jotka alakloonattiin plasmideista MagIC/pcDNA3 ja MARIO/pcDNA3, jotka T. Nagai ystävällisesti toimitti: (Maeshima et al., 2018 ja Koldenkova et ai., 2015). MagIC/MARIO CDS:t monistettiin ensin PCR:stä MARIO/pcDNA3:sta ja vastaavasti MagIC/pcDNA3:sta ja kloonattiin pENTR/D-TOPO-vektoriin. Alukkeet on esitetty yksityiskohtaisesti resurssitaulukossa. Huomaa, että MARIO sense -aluke suunniteltiin limittymään pcDNA3:n sekvenssin kanssa MARIO:n insertiokohdassa. MagIC/MARIO CDS kloonattiin edelleen Gateway-kohdevektoriin pTW (Drosophila Gateway Vector Collection).

CRISPR/Cas9-muokatun uexD-lokuksen generoi kaupallisesti GenetiVision. Muokkauskaavio on esitetty kuvassa 2 – kuvan liite 2C. Uex-lokus sijaitsee käänteisessä suunnassa kromosomissa 2R ja kattaa 49 141 bp:n alueen paikkojen 3 900 285 ja 3 949 425 välillä (FlyBase, julkaisu 6). Seuraava kuvaus koskee näitä koordinaatteja uex-lokuksessa. UexD:n muodostamiseksi konstruoitiin kaksi gRNA-plasmidia ja yksi kaksijuosteinen DNA-luovuttaja (dsDNA) -plasmidi ja injektoitiin nos-Cas9-alkioihin (BDSC, 54591). Kuten kuvassa 2 - kuvan lisäys 2C on osoitettu ja resurssitaulukossa on yksityiskohtaisesti esitetty, ylävirran gRNA1 sijaitsee eksonissa 6 ja sen kohteena on sekvenssi 30 930 30 952. Vastaava alavirran gRNA2 sijaitsee eksonin 7 ja eksonin 8 välillä 33 988 ja 34 010 välillä. Molemmat gRNA:t kloonattiin yksitellen pCFD3-dU63gRNA:han (Addgene, 49410). gRNA1:n leikkauskohdan tulisi olla välillä 30 946 - 30 947, kun taas gRNA2:n pitäisi johtaa katkaisuun välillä 33 993 - 33 994. 795 emäsparin ylävirran homologiahaara (30 152 30 946) ja 977 emäsparin alavirran homologiahaara (33 994 34 970) kloonattiin luovuttaja-DNA-plasmidiin. Lopetuskodoni (STOP, kaikissa kolmessa lukukehyksessä) insertoitiin kahden homologiahaaran väliin ja sitä seurasi GFP-kasetti, jota ohjasi 3xP3-promoottori. Luovuttajan DNA-rungon suunnitteli GenetiVision, ja täydellinen luovuttajasekvenssi uexD-linjalle on saatavilla pyynnöstä. Onnistunut muokkaus tunnistettiin GFP:n ekspressiolla kärpäsen silmissä ja varmistettiin genomisella PCR:llä ja sekvensoinnilla. UexD-perhoissa 3047 bp:n fragmentti 30 947 - 33 993 korvattiin luovuttajaplasmidin kahden homologiahaaran välisellä sekvenssillä, pääasiassa STOP-signaalilla ja GFP-kasetilla. uexD-alleeli katkaisee uex ORF:n. Genomisen PCR-varmentamiseen käytetyt alukkeet on kuvattu yksityiskohtaisesti resurssitaulukossa. Nos-Cas9-siirtogeeni (X-kromosomissa) poistettiin risteyttämällä.

CRISPR/Cas{0}}muokatut uex::HA-perhot on luonut WellGenetics käyttämällä Kate O'Connor-Gilesin laboratorion kehittämää ScarlessDsRed-järjestelmää (julkaisematon, alkuperäinen plasmidi lahjoitettu Addgenelle, #80822). 6XHA-merkki fuusioitiin kehyksessä UEX:n karboksipäähän liittämällä 6XHA:ta koodaava sekvenssi välittömästi ennen natiivia STOP-kodonia uex-lokuksessa (kuvio 3 - kuvan lisäys 1A). Prosessi sisälsi kaksi päävaihetta. Vaiheessa 1 6XHA-merkki yhdessä pBAC-transposonin kanssa, joka sisälsi DsRed-kasetin, lisättiin kehykseen uex:n STOP-kodonin kanssa käyttämällä CRISPR/Cas{11}}välitteistä genomieditointia homologia-ohjatulla korjauksella (HDR) käyttäen 1 gRNA:ta ja yksi dsDNA-plasmidin luovuttaja. gRNA sijaitsee 50 emäsparia uex STOP -kodonista ja sen pitäisi ohjata leikkaus välillä 48 587 ja 48 588. gRNA kloonattiin pCFD3-dU63gRNA-plasmidiin. 1 200 emäsparin ylävirran haara (47 438,48 637) ja 1 033 emäsparia alavirtaan (48 641 49 673) kloonattiin luovuttaja-DNA-plasmidiin, jossa oli pUC57-Kan (2579 bp) runko. Katso gRNA- ja alukesekvenssit resurssitaulukosta. Protospacer Adjacent Motif (PAM) -mutaatio (TCC to TCG, 48 581 48 583) lisättiin luovuttajaan HDR:n edistämiseksi. 6XHA-leima, jota seurasi pBAC-transposoni, joka sisälsi 3XP3-promoottorin ohjaaman DsRed-kasetin, insertoitiin kahden homologiahaaran väliin. pBAC-tunnistusmotiivi TTAA on upotettu 6XHA:n STOP-kodoniin. Täydellinen luovuttajasarja on saatavilla pyynnöstä. Luovuttaja- ja gRNA-plasmidit injektoitiin nos-Cas9-alkioihin (NIG-FLY, CAS0002). Onnistunut muokkaus tunnistettiin DsRed:n ekspressiolla kärpäsen silmissä ja varmistettiin genomisella PCR:llä ja sekvensoinnilla. Tunnistettiin kuusi itsenäistä positiivista linjaa ja neljä läpäisi PCR-validoinnin. Näistä neljästä rivistä yksi läpäisi edelleen sekvensoinnin validoinnin ja on väliviiva, joka on esitetty kuvassa 3 – kuvan lisäys 1A. Tästä linjasta muodostettiin neljä isogenisoitua ja tasapainotettua kantaa. Vaiheessa 2 DsRed-valintamarkkeri leikattiin pois PiggyBac (PBac) -transpositiolla Tub-PBac-auttajalinjalla (BDSC, 8285). Viisi homotsygoottista elinkelpoista linjaa, joissa oli onnistunut leikkaus, validoitiin genomisella PCR:llä ja sekvensoinnilla. Käsikirjoituksen kokeissa käytettiin yhtä nimettyä uex::HA:ta.

CRISPR/Cas{{0}}muokattujen uexT626NRR-perhojen rakentamiseksi suunnittelimme ja kloonasimme gRNA:n ja suunnittelimme ja tilasimme (Sigma) yksijuosteisen oligodeoksinukleotidin (ssODN). gRNA- ja ssODN-sekvenssit on esitetty yksityiskohtaisesti resurssitaulukossa. Koska suunnittelimme tekevämme yhden aminohapon substituution R622K UEX CNBH -domeenissa, 120 bp:n ssODN-luovuttaja keskittyi kodoniin R622 ja kantaa kodoninmuutoksen CGT:ksi AAA:ksi (kohdassa 31 179, 31 181), joka vastaa R622K:ta. gRNA:n odotettu leikkauskohta (välillä 31 192 ja 31 193) on vain 11 emäsparin päässä odotetusta mutaatiopisteestä. Parantaaksemme HDR:n todennäköisyyttä, jonka kerrotaan olevan alhainen käytettäessä ssODN:ää luovuttajana, injektoimme kaupallisesti (GenetiVision) editointimateriaalia 250 lig4 KO vasa-Cas -alkioon (Zimmer et al., 2016). Saimme 37 elinkelpoista G0-perhoa injektoiduista alkioista. Yhteensä 224 G1-perholle suoritettiin yhden kärpäsen genominen PCR ja sekvensointi odotetun mutaation seulomiseksi. Pohjusteet on kuvattu resurssitaulukossa. Tunnistamme 59 oletettua muokattua riviä ensimmäisen kierroksen seulonnasta, ja näistä 12 vahvistettiin. Huolimatta lig4 KO vasa-Cas9:n käytöstä, havaitsimme vain ei-homologiset pään liitostapahtumat (NHEJ) HDR-välitteisten pistemutaatioiden sijaan. 12 muokatusta rivistä kuusi oli homotsygoottisia tappavia ja muut kuusi elinkelpoisia. Neljässä homotsygoottisessa elinkelpoisessa linjassa löysimme G:n korvauksen T:llä kohdassa 31 192 sekä 6 bp:n ATCTTC:n lisäyksen kehykseen välillä 31 192 ja 31 193. Tämä NHEJ-editointi vastaa T626 ! NRR-muutos UEX:n proteiinisekvenssissä (kuvio 5A). X-kromosomi vasa-Cas9 poistettiin näistä linjoista ristiin ja yhtä linjaa, jota kutsutaan nimellä uexT626NRR, käytettiin käsikirjoituksen käyttäytymiskokeissa.

Menetelmän tiedot

Käyttäytymiskokeet

Käyttäytymisperusteisiin T-sokkelokokeisiin käytettiin 1–7-vuorokauden ikäisiä sekasukupuolisia kärpäsiä. Hajuina olivat 4-metyylisykloheksanoli (MCH) ja 3-oktanoli (OCT), laimennettuna ~1:103 (erityisesti 9 ml MCH tai 7 ml OCT 8 ml:ssa mineraaliöljyä). Kaikki kokeet suoritettiin 23 °C:ssa ja 55–65 prosentin suhteellisessa kosteudessa.

Ruokahaluinen heti ja myöhemminmuistikokeet suoritettiin pääosin kuvatulla tavalla (Krashes ja Waddell, 2008; Perisse et al., 2013). 100–120 kärpäsen eriä nälkiinnettiin 21–23 tuntia ennen harjoittelua 35 ml:n nälkäpulloissa, jotka sisälsivät ~2 ml 1-prosenttista agaria (vesilähteenä) ja 2 cm 4 cm:n suodatinpaperia. Sokeripaperit (5 cm 7,5 cm) harjoittelua varten valmistettiin liottamalla 4 ml:ssa 2 M sakkaroosia ja kuivaamalla yön yli. Samankokoiset vesipaperit liotettiin vedellä ja jätettiin yön yli. Ruokahaluista harjoittelua varten kärpäset siirrettiin nälkäputkesta harjoitusputkeen kuivalla "vesipaperilla" ja kiinnitettiin välittömästi T-sokkelon harjoitusvarteen ja altistettiin CS-hajulle 2 minuutin ajan, minkä jälkeen seurasi 30 s. puhdas ilma. Perhot siirrettiin sitten toiseen harjoitusputkeen kuivalla sokeripaperilla, kiinnitettiin T-sokkeloon ja altistettiin CS plus -hajulle 2 minuutin ajan. Välitönmuistitestattiin kuljettamalla kärpäsiä T-valintapisteeseen ja antamalla niille 2 minuuttia aikaa valita kahden hajuvirran välillä. Määrittää 24 tuntiamuisti, kärpäset poistettiin harjoitusputkesta ja siirrettiin normaaleihin maissijauho-ruokapulloihin 1 tunniksi, sitten siirrettiin takaisin nälkäpulloihin 23 tunniksi testaukseen asti. Suorituskykyindeksi laskettiin perhojen lukumääränä CS plus -varressa miinus CS-haaran lukumäärä jaettuna kärpästen kokonaismäärällä. MCH:ta ja OCT:tä käytettiin vuorotellen CS plus tai CS, ja yksi näyte tai n edustaa keskimääräistä suorituskykyindeksiä kahdesta vastavuoroisesti koulutetusta ryhmästä.

Mg2:n ja ruokinnan jälkeisiä käyttäytymiskokeita varten 1–2-vuorokauden ikäisiä kärpäsiä pidettiin injektiopulloissa, joissa oli Mg2:ta ja lisäravintoa 1–5 päivän ajan, ennen kuin niitä nälkiinnettiin ruokahaluiseen harjoitteluun ja testaukseen edellä kuvatulla tavalla. 80 mM [Mg2 plus ] -ruoan valmistamiseksi 40 ml 1 M MgCl2-liuosta lisättiin 460 ml:aan normaalia nestemäistä kärpäsenruokaa; 1 mM [Mg2 plus] ruoka valmistettiin laimentamalla 0,5 ml 1 M MgCl2:ta 39,5 ml:aan MilliQ-vettä ja lisäämällä se 460 ml:aan nestemäistä ruokaa. Ruoka jaettiin eriin ja jäähdytettiin kiinteytymään. MgSO4:lla ja CaCl2:lla täydennetty ruoka valmistettiin samalla tavalla.

Aversiivinen välitön ja 24 hmuistikokeet suoritettiin aiemmin kuvatulla tavalla (Hirano et ai., 2013; Perisse et ai., 2016; Tully ja Quinn, 1985). 100–120 kärpäsen ryhmiä koulutettiin joko yhdellä vastenmielisellä harjoittelujaksolla tai viidellä jaksolla 15 minuutin koevälin välein (väliharjoittelu). Aversiiviseen välittömäänmuisti, kärpäset testattiin yhden syklin harjoittelun jälkeen. Aversiivinen 24 tuntiamuistitestattiin kahdella eri protokollalla. Paasto-ohjatussa protokollassa kärpäsiä nälkiinnettiin 16 tuntia ennen yhden syklin harjoittelua (Hirano et al., 2013). Väliharjoittelussa kärpäsiä ei näytetty nälkään ennen harjoittelua. Perhoja ruokittiin normaalilla kärpäsruoalla 24 tunnin ajan paasto-ohjatun ja väliharjoittelun jälkeen, ennen kuin ne testattiinmuistiesitys. Jokaisen vastenmielisen harjoitusjakson aikana kärpäset altistettiin 1 minuutiksi ensimmäiselle hajulle (CS plus ), joka yhdistettiin kahdellatoista 90 V sähköiskulla 5 sekunnin välein. 45 sekunnin puhtaan ilman jälkeen toinen haju (CS ) esiintyi 1 minuutin ajan ilman iskua. Suorituskykyindeksi laskettiin siten, että CS-varren kärpästen määrä miinus CS plus:n lukumäärä

käsivarsi, jaettuna kärpästen kokonaismäärällä. MCH:ta ja OCT:tä käytettiin vuorotellen CS plus tai CS, ja yksi näyte tai n edustaa keskimääräistä suorituskykyindeksiä kahdesta vastavuoroisesti koulutetusta ryhmästä.

Aistitarkkuuden testit (kuva 2 – lähdetiedot 1) suoritettiin kuvatulla tavalla (Keene et al., 2004; Keene et al., 2006; Schwaerzel et al., 2003) modifikaatioin. Hajutarkkuuden testaamiseksi kouluttamattomille kärpäsille annettiin 2 minuuttia aikaa valita hoidossa käytetyn laimennetun hajun ja mineraaliöljyn läpi kuplitetun ilman välillä T-sokkelossa. Välttämisindeksi laskettiin ilmavarren kärpästen lukumäärästä vähennettynä hajuvarren lukumäärällä jaettuna kärpästen kokonaismäärällä. Sähköiskun välttäminen suoritettiin ja laskettiin samalla tavalla. Kouluttamattomat kärpäset valitsivat 1 min kahden sähköverkot sisältävän putken väliltä, ​​mutta vain yksi oli kytkettynä virtalähteeseen. Välttämisindeksi laskettiin siten, että sähköistymättömän käsivarren kärpästen lukumäärä miinus sähköistetyn varren lukumäärä jaettuna kärpästen kokonaismäärällä. Sokerin tarkkuuden arvioimiseksi nälkiintyneille kärpäsille annettiin 2 minuuttia aikaa valita T-sokerin varren, joka sisälsi kuivatun sokeripaperin, ja toisen, joka sisälsi kuivattua "vesi" suodatinpaperia, välillä. Molemmat paperit valmistettiin kuten ruokahalussamuistimääritykset. Preference Index laskettiin siten, että sokerihaarassa olevien kärpästen määrä miinus toisen haaran määrä jaettuna kärpästen kokonaismäärällä. Havaitsimme, että valon pitäminen päällä käyttäytymishuoneessa ja ilmavirran kulkeminen koeputkien läpi paransi suuresti villityypin kärpästen preferenssiindeksiä ja sovelsi siksi näitä ehtoja kaikkiin sokerien mieltymystestauksiin.

Anti-UEX-vasta-aine ja Western blot

Eurogentec kehitti kaupallisesti polyklonaalisen UEX-vasta-aineen. Kaksi peptidiä syntetisoitiin antigeeneinä: peptidi 1 H-CLPKLDDKFESKQSKP-OH (16aa) ja peptidi 2H-CVDNRTK TRRNRYKKA-NH2 (16aa) ja injektoitiin kaneihin. Vain peptidi 2 indusoi vahvan immuunivasteen ja sitä prosessoitiin edelleen. Lopullinen seerumi puhdistettiin peptidiä 2 vastaan ​​ja käytettiin Western blot -analyysiin laimennoksena 1:2000.

Jokaisesta Western blot -näytteestä proteiinit uutettiin 20 kärpäsenpäästä homogenoimalla perusteellisesti 120 ml:ssa proteiininäytepuskuria, joka sisälsi seosta, jossa oli 30 ml 2-merkaptoetanolia (Bio-Rad), 270 ml 4 Laemmli-näytepuskuri (BioRad) ja 900 ml nukleaasivapaata vettä (Invitrogen). Näytteitä keitettiin sitten 100 ˚C lämpölohkossa 3 minuuttia ja sentrifugoitiin 10 minuuttia ennen lataamista. Näytetilavuus, joka vastaa neljää päätä, ladattiin kuhunkin SDS-PAGE-geeliväylään. Proteiinit siirrettiin PVDF-kalvolle ja blokattiin 5-prosenttisessa rasvattomassa maidossa 1 tunnin ajan 25 °C:ssa 35 rpm:n sekoituksella. Tämän jälkeen kalvoa inkuboitiin anti-UEX-liuoksessa (1:2000 kanin anti-UEX 5 % rasvattomassa maidossa) yön yli 4 °C:ssa 35 rpm:ssä sekoittaen. Kalvo pestiin nopeasti kolme kertaa, mitä seurasi 3 10 min pesut TBST-liuoksessa (100 ml TBS 10 -liuosta, BioRad, laimennettu 900 ml:aan MilliQ-vettä, 0,1 % Tween 20:tä) ja sitten inkuboitiin HRP-konjugoidun kanssa. sekundäärinen vasta-aineliuos (1:5 000 vuohen anti-kania 5-prosenttisessa rasvattomassa maidossa) 1–2 tuntia 25 ˚C:ssa 35 rpm:n sekoituksella. Kalvo pestiin jälleen nopeasti kolme kertaa, mitä seurasi 3 10 min pesu TBST:ssä. Proteiinijuovat visualisoitiin käyttämällä Pierce ECL Western blot -substraattia (Life technology, 32134). Sitten kalvo irrotettiin käyttämällä Millipore ReBlot Plus Mild -liuosta (Merck, 2502), blokattiin uudelleen 5-prosenttisella rasvattomalla maidolla ja tutkittiin hiiren primäärisellä anti-tubuliinivasta-aineella (1:2000, Sigma, T6199) ja vastaavalla HRP-konjugoidulla vuohen anti-vasta-aineella. hiiren sekundaarinen vasta-aine (1:5000) yllä kuvatun protokollan mukaisesti.

Immunovärjäys

Immunovärjäys suoritettiin kuvatulla tavalla (Wu ja Luo, 2006). Aivot 1- - 5-päiväikäisiä aikuisia kärpäsiä leikattiin PBS:ssä ja kiinnitettiin 20 minuuttia PBS:ssä, jossa oli 4 prosenttia paraformaldehydiä huoneenlämpötilassa. Sitten ne pestiin kahdesti lyhyesti 0,5-prosenttisessa PBT:ssä (2,5 ml Triton-X100 497,5 ml:ssa PBS:a) ja kolme 20 minuutin pesua. Aivoja blokattiin sitten 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa PBT:ssä, joka sisälsi 5 prosenttia normaalia vuohen seerumia, ja sitten niitä inkuboitiin primääristen ja sekundaaristen vasta-aineiden kanssa miedolla kierrolla (35 rpm) 4 °C:ssa 1 tai 2 päivää. Primääriset vasta-aineet olivat kanin anti-GFP (1:250; Invitrogen A11122) ja kanin anti-HA (1:250, NEB 3724T). Alexa 488 -konjugoitu vuohen anti-kani (1:250; Invitrogen, A11034) oli sekundäärinen vasta-aine. Ennen sekundaarista vasta-aineinkubaatiota ja sen jälkeen aivoille tehtiin kaksi nopeaa pesua, joita seurasi kolme 20 minuutin pesua 0,5-prosenttisessa PBT:ssä. Värjätyt aivot kiinnitettiin lasilevyille Vectashieldissä (Vector Labs H1000) ja kuvattiin käyttämällä Leica TCS SP5 konfokaalimikroskooppia 40 suurennuksella (HCX PL APO 40, 1,3 CS öljyimmersioobjektiivi, Leica). Kuvapinot kerättiin 1024 1024-resoluutiolla 1 mm:n askelin ja käsiteltiin Fidžin avulla (Schindelin et al., 2012). Kuvan 3G ja H kvantifiointia varten piirrettiin manuaalisesti yhdelle lohkolle suorakaiteen muotoiset ROI:t, joiden koko on noin 40 25 mm maapallolle tai pyöreät ROI:t, joiden halkaisija on 15 mm ab:lle, a'b:lle ja EB:lle. kärpäsen aivojen z-pinokuvauksesta. Vastaavat ROI:t piirrettiin myös ylimmälle mediaaliselle protocerebrumille (SMP) taustakontrollialueeksi, ja keskimääräinen fluoresenssi laskettiin käyttämällä ImageJ:tä. MB-lohkojen ja EB:n ROI-intensiteetti normalisoitiin vastaavan SMP-intensiteetin mukaiseksi. Vasemman ja oikean aivojen keskiarvoa käytettiin yhdelle datapisteelle. Kuvioiden 7C ja D kvantifiointia varten ROI:t on esitetty kuvissa ja ROI-intensiteetti laskettiin samalla tavalla kuin tulokset kuviossa 3H. Kuvassa 7C viiva piirrettiin a-lohkon kärjen leveimmän osan läpi. Tämän linjan intensiteettiprofiili saatiin ImageJ:n kautta. Kullekin viivaprofiilille poimittiin 30 datapistettä sellaisen profiilin keskeltä, jotka ulottuvat noin 15 mm:n viivalle. Profiili normalisoitiin edelleen viiden ensimmäisen datapisteen (F0) keskiarvoon ja laskettiin (F F0)/F0. Näiden eri aivoista saatujen normalisoitujen profiilien keskiarvot piirrettiin (kuvio 7C, keskipaneeli). Aivojen vasen ja oikea profiili laskettiin ja ne näytetään erikseen. Kuviossa 7D suhteelliset intensiteetit eri alueita edustavista eri ROI:ista on laskettu yhteen kokonaisintensiteetin mittauksen muodostamiseksi MB:lle.

Ihmisen CNNM4-cDNA-ekspressiokonstrukti, jota käytettiin Mg2:n plus ulosvirtauksen tutkimiseen soluviljelmässä, on aiemmin kuvattu (Yamazaki et ai., 2013). Drosophila uex:ää ilmentävä konstruktio luotiin lisäämällä FLAG-merkki uex CDS:n STOP-kodonin eteen. FLAG-merkityt CNNM4- ja uex-cDNA:t liitettiin tämän jälkeen pCMV-tagiin-4A (Agilent) ekspressiota varten HEK293-soluissa. HEK293-soluja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eagle-elatusaineessa (Nissui), jota oli täydennetty 10 prosentilla fetal Bovine Serum -seerumilla (FBS) ja antibiooteilla. Ekspressioplasmidit transfektoitiin Lipofectamine 2000:lla (Invitrogen).

Immunovärjäystä varten solut kiinnitettiin 3,7-prosenttisella formaldehydillä PBS:ssä 2 0 min ja sitten permeabilisoitiin 0,2-prosenttisella Triton X-100:lla PBS:ssä 5 minuutin ajan, molemmat huoneenlämpötilassa. Seuraavaksi ne blokattiin PBS:llä, joka sisälsi 3 prosenttia FBS:ää ja 10 prosenttia naudan seerumialbumiinia (estopuskuri) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Sitten soluja inkuboitiin yön yli 4 °C:ssa kanin anti-FLAG-vasta-aineen (F7425, Sigma-Aldrich) kanssa, joka oli laimennettu estopuskuriin, pestiin 3 ui PBS:llä ja inkuboitiin 1 tunti huoneenlämpötilassa Alexa-konjugoidun anti-FLAG-vasta-aineen kanssa. kanin IgG (Invitrogen) ja rodamiini-falloidiini (F-aktiinin visualisointiin, Invitrogen) laimennettuna estopuskuriin. Kolmen PBS-pesun jälkeen peitinlasit kiinnitettiin objektilaseille ja kuvattiin konfokaalimikroskoopilla (FluoView FV1000; Olympus).

Mg2 plus -kuvaus Magnesium Greenillä suoritettiin kuvatulla tavalla (Yamazaki et ai., 2013), pienin muutoksin. [Mg2 plus]i:n mahdollisen pienenemisen välttämiseksi ilmentyneiden proteiinien kanssa, transfektoituja HEK293-soluja viljeltiin kasvatusalustassa, jota oli täydennetty 40 mM MgCl2:lla kuvantamiseen asti. Sitten soluja inkuboitiin Mg2 plus -latauspuskurilla (78,1 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 40 mM MgCl2, 5,5 mM glukoosia ja 5,5 mM HEPES-KOH [pH 7,4]), mukaan lukien 2 mM magnesiumia. (Invitrogen), 30 minuuttia 37 °C:ssa. Sitten solut huuhdeltiin kerran latauspuskurilla ja niitä tarkasteltiin Olympus IX81 -mikroskoopilla, joka oli varustettu ORCA-Flash 4.0 CMOS -kameralla (Hamamatsu) ja SHI-1300L-elohopealampulla (Olympus). Fluoresenssi mitattiin 20 sekunnin välein (viritys aallonpituudella 470–490 nm ja emissio 505–545 nm) Metamorph-ohjelmiston (Molecular Devices) ohjauksessa. Puskuri vaihdettiin sitten Mg2:ksi plus vapaa puskuri (MgCl2 latauspuskurissa korvattiin 60 mM NaCl:lla). Tiedot esitetään viivakaavioina (10 solun keskiarvo). Kuvauksen jälkeen solut kiinnitettiin PBS:llä, joka sisälsi 3,7 prosenttia formaldehydiä, ja alistettiin immunofluoresenssimikroskopialle proteiinin ilmentymisen varmistamiseksi.

FRET-pohjaiset Mg2 plus -pitoisuusmittaukset kiinteissä kärpäsaivoissa

1-2 päivän ikäiset kärpäset, joiden genotyyppi on c739; UAS-MagFRET{5}} pidettiin pulloissa, joissa oli 1 mM tai 80 mM [Mg2 plus ] ruokaa 4 päivän ajan ennen keräämistä. Kärpästen aivot leikattiin PBS:ssä ja kiinnitettiin 2 0 minuuttia PBS:ssä, jossa oli 4 prosenttia paraformaldehydiä huoneenlämpötilassa. Sitten ne pestiin kahdesti lyhyesti 0,5-prosenttisessa PBT:ssä (2,5 ml Triton-X100:aa 497,5 ml:ssa PBS:ää) ja kolme 10 minuutin pesua. Aivot asennettiin sitten lasilevyille Vectashieldissä (Vector Labs H1000) ja kuvattiin käyttämällä laajakenttäistä Scientifica Slicescopea, jossa oli 40 um, 0,8 NA:n vesiimmersioobjektiivi ja Andor Zyla sCMOS -kamera Andor Solis -ohjelmistolla (v4.27). Ab-hermosolun Mg2 plus -pitoisuutta ilmaisevan FRET-suhteen saamiseksi aikasarjat hankittiin vuorotellen cerulean-kanavan ja sitriinikanavan välillä 3 Hz:llä 512 512 pikselillä ja 16 bitillä. Molempien kanavien viritysaallonpituus on 436 nm, ceruleanin emissiosuodatin on 460–500 nm ja citriinin 520–550 nm. Sarjan hankinta alkaa cerulean-kanavasta ja kestää 5 s, sitten vaihtuu sitriinikanavaan ja kestää vielä 5 s, ja tämä sykli toistetaan vielä kaksi kertaa. Näin ollen jokaiselle aivolle hankittiin yhteensä 30 s (90 ruutua) kuvapino. Kuvapinot analysoitiin myöhemmin käyttämällä ImageJ:tä ja räätälöityjä Matlab-skriptejä. Lyhyesti sanottuna suorakaiteen ROI:t (kuva 1E, vasen paneeli) piirrettiin manuaalisesti ab-keilan päälle (yksi keilaan ja yksi b-keilaan kutakin pallonpuoliskoa varten) ja ab-keilan ulkopuolelle (yksi kummallekin puolipallolle) taustakontrollina. Cerulean-kanavan fluoresenssin intensiteetti laskettiin jakamalla kukin pysty- tai vaakasuora keilan ROI tausta-ROI:lla ja laskettiin keskiarvo kunkin keilan kahden pallonpuoliskon välillä ja laskettiin keskiarvo 15 kehykseltä jokaiselle jaksolle. Se sitriinikanavasta saatiin samalla tavalla. FRET-suhde saatiin yllä olevista intensiteetistä, keskiarvoistettuna edelleen kolmen hankintajakson kesken, kuvattuna yhtenä datapisteenä kuviossa 1E (oikea paneeli).

Konfokaalinen Mg2 plus -kuvaus kärpäsen aivoissa

c739-GAL4-ohjattua UAS-MagIC:tä ilmentävät eksplanttiaivot asetettiin 35 mm:n lasipohjaisen mikrokuoppalevyn (osanumero P35G-1.5–14 C, MatTek Corporation) pohjalle solunulkoisen solun alle. suolapuskuriliuos (103 mM NaCl, 3 mM KCl, 5 mM N-Tris, 10 mM trehaloosi, 10 mM glukoosi, 7 mM sakkaroosi, 26 mM NaHC03, 1 mM NaH2PO4, 1,5 mM CaCl2, 4 mM MgCl2, 2 mM MgCl2 pH 7,3]) kalsiumvapaassa puskurissa leikkaamisen jälkeen (Barnstedt et al., 2016). UAS-MagIC:n Mg2 plus -herkkyyden sekä UAS-MagIC:n vasteen muille kemikaaleille, kuten EDTA:lle, EGTA:lle ja CaCl2:lle (kuva 8B) määrittämiseksi (kuva 8B), aivoja inkuboitiin suolaliuospuskuriliuoksessa, jossa oli 20 mg/ml digitoniinia. 6 minuuttia ennen kuvantamista (Koldenkova et al., 2015). Mg2 plus -vaihtelun tutkimiseksi vasteena Forskolin (FSK) -sovellukselle (kuva 8C–I), aivot laitettiin suolaliuospuskuriliuokseen ilman digitoniinia tai inkubaatiota. Molemmissa tilanteissa suolaliuos viittaa puskuriin (joko digitoniinin kanssa tai ilman), johon aivot on upotettu.

Kuvaus suoritettiin LSM780 konfokaalimikroskoopilla (Zeiss), jossa oli 20 ilmaobjektiivi ZEN 2011 -ohjelmistolla. MagIC:n Venus-osa viritettiin 488 nm laserilla ja sen emissio kerättiin 520–560 nm:n alueella. mCherry viritettiin 561 nm laserilla ja sen emissio kerättiin 600-640 nm alueella. Aikasarjat hankittiin 0,5 Hz:llä 512 512 pikselillä ja 16 bitillä. 60 s perusviivan Venus/mCherry-mittauksen jälkeen 2–20 ml suolaliuosta tai muuta asiaankuuluvaa kemiallista liuosta lisättiin mikropipetin kautta maljaan jatkuvalla kuvankaappauksella. Käytettyjen aineiden vaikutukset Venus/mCherry-emissioon mitattiin sitten 15–20 minuutin ajan.

Kuvapinot analysoitiin myöhemmin käyttämällä ImageJ:tä ja mukautettuja Python-skriptejä. Lyhyesti sanottuna suorakaiteen ROI:t piirrettiin manuaalisesti ab-hermosoluille (yksi jokaiselle pallonpuoliskolle, kuva 8A), ja toinen samankokoinen ROI piirrettiin keskelle, mutta MB:iden ulkopuolelle taustakontrolliksi. Fluoresenssin intensiteetti Venus-kanavasta (tai mCherry-kanavasta) laskettiin vähentämällä tausta-ROI verhiön ROI:ista, vastaavasti, ja laskettiin keskiarvo kahden pallonpuoliskon välillä. Tätä kutsutaan nimellä "Rel. Intensiteetti (au)' kuvissa 8D ja E. Venuksen ja mCherryn intensiteetin välinen suhde laskettiin 'MagIC Ratio':na kuvassa 8B ja C sekä kuviossa 8F ja G. Kuvaa 8H varten näiden kahden kanavan intensiteetti laskettiin erikseen. Tässä tapauksessa 'Rel. Intensiteetti (DF/F0)' viittaa suhteelliseen fluoresenssin intensiteettiin normalisoituna perusjakson F0 keskimääräiseen intensiteettiin, laskettuna (FF0)/F{{9} }. Venuksen suhteellista intensiteettiä DF/F0 käytettiin PSD:n laskemiseen (kuva 8I) python-funktiolla psd (alla matplotlib.pyplot), joka käytti Welchin keskimääräistä periodogrammimenetelmää (Bendat et al., 2000).

Käänteistranskriptio ja kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR

Jokaista näytettä kohden 120 kärpästä jäädytettiin nestetypessä ja niiden päät homogenisoitiin kokonaan TRIzol-reagenssissa (Invitrogen). Kokonais-RNA uutettiin käyttämällä Direct-zol RNA MiniPrep (R2050) -pakkausta noudattaen valmistajan ohjeita. cDNA syntetisoitiin käyttämällä SuperScript III First-Strand -synteesijärjestelmää (Invitrogen). Kullekin eri hoidolle tai genotyypille valmistettiin viisi riippumatonta näytettä. Kvantitatiivinen PCR suoritettiin kolmena rinnakkaisena kullekin cDNA-näytteelle LightCycler 480 Instrumentilla (Roche) käyttämällä SYBR Green I Master Mixiä (Roche). Sulamiskäyrät analysoitiin monistamisen jälkeen ja amplikonit visualisoitiin agaroosigeelielektroforeesilla alukkeen spesifisyyden varmistamiseksi. Suhteelliset transkriptitasot laskettiin 2-DDCt-menetelmällä (Livak ja Schmittgen, 2001), ja normalisointiin käytettiin kolmen vertailugeenin (Gapdh, Tbp ja Ef1a 100E) Ct-arvojen geometrista keskiarvoa. Alukkeet on esitetty yksityiskohtaisesti resurssitaulukossa.

Käänteinen PCR

Käänteistä PCR:ää käytettiin MiMIC-insertiokohdan kartoittamiseen uexMI01943-perhoissa. Genominen DNA valmistettiin 15 aikuisesta kärpästä. DNA:ta, joka vastaa kahta kärpästä, digestoitiin sitten 25 ml:n restriktioreaktiossa Mbo I:llä ja 10 ml tuotetta ligoitiin yön yli 4 °C:ssa yön yli fragmenttien kiertämiseksi; 5 ml ligaatiotuotetta käytettiin käänteis-PCR:ään. PCR-tuote puhdistettiin käyttämällä Exo/SAP-reaktiota (Thermo Fisher, 78201) ennen sekvensointia. Sekvenssiä verrattiin D. melanogasterin genomiin (FlyBase, Release 6) BLAST:lla ja se sovitettiin tasaisesti 2R:n alueelle 3 882 886.3 882 641, mikä on yhdenmukainen FlyBasen raportoidun uexMI01943-insertion kanssa. Alukkeet on esitetty yksityiskohtaisesti resurssitaulukossa.

Proteiinialueen ennustaminen ja kohdistus

Proteiinisekvenssin rinnastus suoritettiin käyttämällä Geneious R10.2.2:ta. Proteiinidomeenin ennustus suoritettiin InterProlla (Finn ym., 2017; Jones et al., 2014) ja Phyre2:lla (Kelley et al., 2015). Proteiinialueen ja rakenteen kohdistus suoritettiin käyttämällä TM-alignia (Zhang ja Skolnick, 2005). Proteiinirakenteen visualisointi suoritettiin Chimera 1.11.2:ssa (Pettersen et ai., 2004).

Kvantitointi ja tilastolliset analyysit

Käyttäytymistiedot analysoitiin Excelillä ja Prism 6:lla. Kuvantamistiedot analysoitiin käyttämällä ImageJ:tä ja räätälöityjä MATLAB- tai Python-skriptejä. Parittomia kaksisuuntaisia ​​t-testejä käytettiin kahden ryhmän vertaamiseen, ja yksisuuntaista ANOVAa, jota seurasi Tukeyn post-hoc -testi, käytettiin useiden ryhmien vertailuun. Tilastollisen merkitsevyyden kynnys asetettiin p<>

Kiitokset

Kiitämme FJ Arjonaa ja JGJ Hoenderopia hiiren CNNM2-klooneista ja käsikirjoituksen kommenteista. Olemme kiitollisia T Nagaille MagIC- ja MARIO-klooneista sekä Bloomington Stock Centerille ja VDRC:lle kärpäsistä. Kiitämme P Cognignia, Y Huangia, R Brainia, R Szoke-Kovacsia ja M Goodwinia teknisestä tuesta ja muita Waddell-ryhmän jäseniä keskustelusta. Annamme tunnustusta N Halidille, C Monicolle ja Micron Advanced Bioimaging Unit -yksikölle (Wellcome Strategic Awards 091911/B/10/Z ja 107457/Z/15/Z) heidän tuestaan ​​ja avusta tässä työssä. EM rahoitettiin pitkäaikaisesta EMBO-apurahasta (ALTF 184-2109). KDJ tunnustaa Rhodes Trustin tuen. SW:tä rahoittivat Wellcome Principal Research Fellowship (200846/Z/16/Z) ja ERC Advanced Grant (789274).