Osa 3: Cistanche Tubulosasta eristetty ekinakosidi oletettavasti stimuloi kasvuhormonin eritystä greliinireseptorin aktivoinnin kautta

Cistanche tubulosasta eristetty ekinakosidi oletettavasti stimuloi kasvuhormonin eritystä greliinireseptorin aktivoinnin kautta

Chieh-Ju Wu 1, Mei-Yin Chien 2, Nan-Hei Lin 1, Yi-Chiao Lin 1, Wen-Ying Chen 3, Chao-Hsiang Chen 2,4* ja Jason TC Tzen 1,*

1 Graduate Institute of Biotechnology, National Chung-Hsing University, Taichung 402, Taiwan; baby159357520@gmail.com (C.-JW); CMNHEI@mohw.gov.tw (N.-HL); s9755702@gmail.com (Y.-CL)

2 Ko Da Pharmaceutical Co. Ltd., Taoyuan 324, Taiwan; rd1@koda.com.tw

3 Eläinlääketieteen laitos, National Chung-Hsing University, Taichung 402, Taiwan; wychen@dragon.nchu.edu.tw

4 Graduate Institute of Pharmacognosy, Taipei Medical University, Taipei 110, Taiwan

* Kirjeenvaihto: gm@koda.com.tw (C.-HC); TCTZEN@dragon.nchu.edu.tw (JTCT); Puh.: plus 886-4-22840328 (alanumero 776) (JTCT); Faksi: plus 886-4-22853527 (JTCT)

Akateeminen toimittaja: Pinarosa Avato

Vastaanotettu: 22. tammikuuta 2019; Hyväksytty: 14. helmikuuta 2019; Julkaistu: 17.2.2019

Ottaa yhteyttä:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Abstrakti:Cistanchelajilla, aavikon ginsengillä, on perinteisessä kiinalaisessa farmakopeassa todettu olevan monia biologisia vaikutuksia, ja sitä on käytetty ikääntymistä estävänä lääkkeenä. Kolme fenyylietanoidiglykosidia -ekinakosidi, tubulosidi A ja akteosidi – havaittiin vesiuutteestaCistanche tubulosa(Schenk) R. Wight ja pääosatekijä,ekinakosidi, puhdistettiin edelleen.Ekinakosidipitoisuudella yli 10_6 M osoitti merkittävää aktiivisuutta stimuloida kasvuhormonin eritystä rotan aivolisäkesoluissa. Samoin kuin kasvuhormonia vapauttava hormoni-6, greliinin synteettinen analogi, ekinakosidin aiheuttamaa kasvuhormonin erityksen stimulaatiota esti [D-Arg1, D-Phe5, D-Trp7,9, Leu11]-aine P greliinireseptorin käänteinen agonisti. Molekyylimallinnus osoitti, että kaikki kolme fenyylietanoidiglykosidia olivat riittävästi vuorovaikutuksessa greliinireseptorin sitoutumistaskun kanssa, ja ekinakosidilla oli hieman parempi vuorovaikutus reseptorin kanssa kuin tubulosidi A ja akteosidi. Tulokset viittaavat siihen, että fenyylietanoidiglykosidit, erityisesti ekinakosidi, ovat aktiivisia aineosia, joiden oletetaan olevan vastuussa C. tubulosan ikääntymistä ehkäisevistä vaikutuksista, ja niiden voidaan katsoa kehittyvän greliinin ei-peptidyylianalogeina.

Avainsanat: cistanchetubulosa;ekinakosidi; greliini; kasvuhormonin eritys;fenyylietanoliglykosidit

ekinakosidisisääncistancheon monia vaikutuksia

Pls napsauta tästä päästäksesi osaan 2

4. Materiaalit ja menetelmät

4.1. Kemikaalit ja kasvimateriaalit

Cistanchedeserticola YC Ma hankittiin paikalliselta markkinoilta ja todisti tohtori Nan-Hei Lin.Cistanchetubulosa (Schenk) R. Wight ostettiin yhtiöltä Sinopharm Tian-Li Pharmaceutical Co., Ltd., (Hangzhou, Kiina). HPLC-luokan asetonitriili, muurahaishappo ja metanoli ostettiin yhtiöltä ECHO Chemical Co., Ltd, (Miaoli, Taiwan). Dulbeccon modifioitu Eagle's medium (DMEM), dialysoitu naudansikiön seerumi (DFBS) ja trypsiini-EDTA ostettiin Invitrogenilta (Carlsbad, CA, USA). DNaasi I ostettiin Worthington Biochemicalilta (Lakewood, NJ, USA). Kasvuhormonia vapauttava hormoni-6 (GHRP-6) hankittiin yhtiöltä Gen Way Biotech, Inc. (San Diego, CA, USA). Tyypin I kollagenaasi ja [D-Arg1, D-Phe5, D-Trp7,9, Leu11]-aine P ostettiin Sigma-Aldrich Co.:lta (St. Louis, MO, USA). Rotan kasvuhormonin ELISA-pakkaus ostettiin Sunred Biological Technology Corporationilta (Shanghai, Kiina).

4.2. HPLC/UV- ja LC_MSn-analyysit Cistanche spp.

Kuivattu varsi (25 g)Cistanchedeserticola YC Ma orCistanchetubulosa (Schenk) R uutettiin kolme kertaa 500 ml:lla tislattua vettä 60 minuutin ajan 50 asteessa vesihauteessa. Liuos suodatettiin 13 mm:n Syyrian Filter -suodattimen läpi, jossa oli 0,45 um PP-kalvosuodatin (Pall Corporation, Glen Cove, NY, USA), ja sille suoritettiin seuraavat analyysit. Uutteiden kemialliset aineosat analysoitiin

käyttämällä Syncronis C18 -kolonnia (sisähalkaisija 4,6 × 250 mm, 5 um, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) HPLC-järjestelmässä yhdistettynä mallin 600E fotodiodirividetektoriin (Waters Corporation,

Milford, MA, Yhdysvallat). Liikkuva faasi koostui (A) vedestä, joka sisälsi {{0}},1 % muurahaishappoa ja (B) asetonitriiliä. Eluointigradientti oli seuraava: 0-60 min, lineaarinen gradientti 14 prosentista B; 0–3 min, 14 prosentista 17 prosenttiin B; 3–4 min, 17 prosenttia B; 4–15 min, 17–20 prosenttia B; 15–20 min, 20 prosenttia B; 20–50 min, 20–14 prosenttia B; 50–60

min, 14 prosenttia B. Ultraviolettisäteilyn (UV) absorbanssin ilmaisuaallonpituus asetettiin 330 nm:iin. Lineaarinen trap kvadrupoli (LTQ) tandem-massaspektrometri (Thermo Electron, San Jose, CA, USA), joka oli varustettu sähkösumutusionisaatiolla (ESI) -liitännällä, yhdistettiin Surveyor LC -järjestelmään (Thermo Electron).

5 ul:n näytesilmukalla. Eluointigradientti oli seuraava: 0-90 min, lineaarinen gradientti 14 prosentista B; 0–24 min, 14–17 prosenttia B; 24–25 min, 17 prosenttia B; 25–36 min, 17–20 prosenttia B; 36–37 min, 20 prosenttia B; 37-80 min,

20% to 14% B; 80–90 min, 14% B. The heated capillary temperature was set at 300℃ with a spray voltage of 4.5 kV. Negative ESI mode was firstly scanned ranging from m/z 400–1000. Data-dependent MSN was obtained using the high purity helium (>99,99 prosenttia) törmäyskaasuna.

4.3. Ekinakosidin eristäminen

Vesiuute C. tubulosan kuivatusta varresta (25 g) konsentroitiin alennetussa paineessa, jolloin saatiin syvänruskeaa siirappia. Raakauutto suspendoitiin tislattuun veteen ja lyofilisoitiin pakastekuivaimella. 100 mg:n jauhe liuotettiin 5 ml:n tislattuun veteen ja puhdistettiin käyttämällä Sephadex LH-20 -kolonnia (100 ml; GE Healthcare Bio-Sciences AB, Ruotsi), eluoitiin 10-prosenttisella metanolin vesiliuoksella ja tarkkailtiin HPLC:llä. . Ekinakosidia sisältävät fraktiot havaittiin lukemalla absorbanssi aallonpituudella 245 nm ja kerättiin käyttämällä automaattista näytteenottolaitetta.

4.4. Eläimet

Kokeet hyväksyi National Chung{0}}Hsingin yliopiston Institutional Animal Care and Use Committee, jonka hyväksyntänumero on IACUC 106-079. Urospuoliset Sprague_Dawley-rotat, jotka painoivat 250_300 g, ostettiin yhtiöltä BioLASCO, Taiwan Co., Ltd. (Taipei, Taiwan). Kahta eläintä häkkiä kohden pidettiin kontrolloidussa ympäristössä, jonka lämpötila oli 23 o2, kosteus 60 o 10 prosenttia ja 12 tunnin valo/pimeä-sykli. Rotat ruokittiin tavanomaisella chow-ruokavaliolla (kalorit mukana

28,7 prosenttia proteiinia, 13,4 prosenttia rasvaa ja 57,9 prosenttia hiilihydraatteja, 5001 Rodent LabDiet, St. Louis, MO, USA) ja tislattua vettä ad libitum.

4.5. Primaarinen aivolisäkkeen soluviljelmä

Aivolisäkesolut eristettiin Yamazakin et ai. kehittämän modifioidun entsymaattisen dispersiomenetelmän mukaisesti. [29]. Lyhyesti sanottuna urospuoliset Sprague Dawley -rotat nukutettiin Zoletil 50:llä (40 mg/kg, IP; Virbac Laboratories, Carros, Ranska), ja aivolisäkkeen eturauhaset poistettiin ja dispergoitiin aivolisäkkeen solujen viljelyyn suspensiossa, kuten aiemmin on kuvattu [30].

4.6. Kasvuhormonin eritysmääritys

Primaarisia aivolisäkkeen etuosan soluja, joissa oli 4 x 104 solua/kuoppa, viljeltiin 37 asteessa 5 prosentin CO2:n alla 2 päivää ennen kasvuhormonin eritysmääritystä aiemmin kuvatun protokollan mukaisesti [30].

Viljelyalustan poistamisen jälkeen soluja nälkiinnettiin seerumittomassa Dulbecco's Modified Eagle's -elatusaineessa (DMEM) 90 minuutin ajan perushormonin erityksen stabiloimiseksi. Nälkäravintoaine korvattiin tuoreella DMEM:llä, joka sisälsi ekinakosidia (10_8 - 10_5 M) tai GHRP:tä-6 (ihmisen greliinireseptorin agonisti, GHSR, 10_7 M) positiivisena kontrollina ja soluja inkuboitiin 15 ja 30 minuuttia 37 asteessa 5 % C02:ssa. Antagonistivaikutuksen havaitsemiseksi soluja inkuboitiin GHSR:n kanssa

käänteisagonisti [D-Arg1, D-Phe5, D-Trp7,9, Leu11]-aine P (0,5 uM) ja sitten käsitelty DMEM:llä, joka sisältää ekinakosidia (10_5 M) tai GHRP-6 (10_7 M) 30 minuutin ajan. Elatusaine kerättiin varten

kasvuhormonin erityksen määritys rotan kasvuhormonin ELISA-sarjalla (Shanghai Sunred Biological Technology Corporation).

4.7. Tilastollinen analyysi

Tiedot esitettiin keskiarvoina o SD. Erot analysoitiin T-testillä. Tilastolliset laskelmat suoritettiin GraphPad Prism 6:lla (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA). Tasoa p < 0,05="" pidettiin="" tilastollisesti="">

4.8 Homologian mallinnus ja telakointi

Homologiamallinnus ja telakointi ihmisen greliinireseptoriin, kasvuhormonin eritystä lisäävään reseptoriin (GHSR, talletusnumero AAI13548), perustettiin noudattamalla aikaisempaa rakennustamme [21,24]. Lyhyesti sanottuna 1- ja 2-adrenergisen reseptorin (PDB 2YCY ja 3PDS) kiderakenteita, joissa oli sitoutuneita ligandeja, syanopindololia ja FAUC50:tä, käytettiin templaatteina GHSR-rakenteen rakentamiseen [31,32]. GHSR-rakenne, jolla on pienin PDF-kokonaisenergia, valittiin lisätelakointia varten GHRP:llä-6, ekinakosidilla, tubulosidi A:lla ja akteosidilla. Kaikki mallinnusprosessit suoritettiin käyttämällä Discovery Studio 2.1 -alustaa (http://accelrys.com/).

GHRP:n-6 3D-rakenne ladattiin Pub-Chem-yhdistetietokannasta NCBI:n verkkosivustolta (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Ekinakosidin, tubulosidi A:n ja akteosidin 3D-rakenteet rakennettiin Chem3D-ohjelmalla (http://www.cambridgesoft.com/). GHSR:n ligandia sitova kohta määriteltiin telakointisimulaatiossa pallomaiseksi tilaksi, jonka säde oli 14 Å sitoutumistaskun keskustasta. GHRP-6, ekinakosidi, tubulosidi A tai akteosidi telakoitiin GHSR:n sitoutumiskohtaan in silico käyttämällä Discover Studio 2.1 -paketin LibDock-moduulia ja minimoitiin edelleen älykkäällä minimointialgoritmilla CHARMm-voimakentällä. Tutustu Studio 2.1 -pakettiin [33]. Ekinakosidin, tubulosidi A:n ja akteosidin suhteellisten sitoutumisaffiniteettien vertaamiseksi GHSR:ssä telakointiin käytettiin aktiivista keskusta-aluetta, joka oli rakennettu GHRP:llä-6 GHSR:ssä, ja sitoutumisenergian laski GEMDOCK (The Institute of Bioinformatics). , National Chiao Tungin yliopisto, Taiwan).

Tekijän panokset: Eläinkokeet, C.-JW, Y.-CL ja W.-YC; Tunnistaminen ja puhdistus: MY.C., N.-HL ja C.-HC; Molekyylimallinnus: C.-JW, Y.-CL ja JTCT; Projektin suunnittelu ja kirjoittaminen: C.-HC ja JTCT

Rahoitus: Työtä tuettiin osittain apurahalla Jason TC Tzenille National Chung-Hsing Universitystä (NCHU-102D604).

Kiitokset: Kirjoittajat kiittävät Tian-Shun Wengiä ammatillisen kokemuksensa jakamisesta Cistanche-lajien käytöstä.

Eturistiriidat: Kaikki kirjoittajat ilmoittavat, että ne eivät ole eturistiriitoja.

Viitteet

1. Wang, T.; Zhang, X.; Xie, W. Cistanche deserticola YC Ma, "Desert ginseng": Arvostelu. Olen. J. Chin. Med. 2012, 40, 1123–1141. [CrossRef] [PubMed]

2. Wang, T.; Chen, C.; Yang, M.; Deng, B.; Kirby, MG; Zhang, X. Cistanche tubulosa etanoliuute välittää rotan sukupuolihormonitasoja indusoimalla kivesten steroidogeenisiä entsyymejä. Pharm. Biol. 2016, 54, 481–487. [CrossRef] [PubMed]

3. Lin, WY; Chun, Y.; Jack, C.; Kao, ST; Tsai, FJ; Liu, HP Cistanche tubulosan pitkäikäisyyden edistämiseen ja kognitiiviseen parantamiseen liittyvät molekyylireitit Drosophilassa. Phytomedicine 2017, 26, 37–44. [CrossRef]

4. Wu, CR; Lin, HC; Su, MH Cistanche tubulosan vesiuutteiden poistaminen käyttäytymispuutteista Alzheimerin taudin kaltaisessa rottamallissa: Relevanssi amyloidin kertymisen ja keskushermoston toiminnan kannalta. BMC-täydennys. Altern. Med. 2014, 14, 202. [CrossRef]

5. Xuan, GD; Liu, CQ Tutkimus Cistanche deserticolan fenyylietanoidiglykosidien (PEG) vaikutuksesta D-galaktoosin indusoimaan ikääntymisen estoon iäkkäillä hiirillä. Zhong Yao Cai 2008, 31, 1385–1388. [PubMed]

6. Jiang, Y.; Tu, PF Cistanche-lajin kemiallisten ainesosien analyysi. J. Chromatogr. 2009, 1216, 1970–1979. [CrossRef] [PubMed]

7. Gao, C.; Wang, C.; Wu, G. Cistanche yhteensä glykosidit vaikutuksesta verisuoni dementia rottien oppimisen ja muistin ja mekanismin tutkimus. Leuka. Yrtti. Med. 2005, 36, 1852–1855.

8. Li, F.; Yang, Y.; Zhu, P.; Chen, W.; Qi, D.; Shi, X.; Zhang, C.; Yang, Z.; Li, P. Echinacoside edistää luun uusiutumista lisäämällä OPG/RANKL-suhdetta MC3T3-E1-soluissa. Fitoterapia 2012, 83, 1443–1450. [CrossRef]

9. Shimoda, H.; Tanaka, J.; Takahara, Y.; Takemoto, K.; Shan, SJ; Su, MH Cistanche tubulosa -uutteen, perinteisen kiinalaisen raakalääkkeen, hypokolesteroleemiset vaikutukset hiirillä. Olen. J. Chin. Med. 2009, 37, 1125–1138. [CrossRef]

10. Tang, F.; Hao, Y.; Zhang, X.; Qin, J. Vaikutus ekinakosidin munuaisfibroosiin estämällä TGF- 1/Smads-signalointireittiä diabeettisen nefropatian DB/DB-hiirimallissa. Drug Des. Devel. Siellä. 2017, 11 2813–2826. [CrossRef]

11. Xiong, WT; Gu, L.; Wang, C.; aurinko, HX; Liu, X. Cistanche tubulosan anti-hyperglykeemiset ja hypolipideemiset vaikutukset tyypin 2 diabeettisissa DB/DB-hiirissä. J. Ethnopharmacol. 2013, 150, 935–945. [CrossRef] [PubMed]

12. Bao, XX; Ma, HH; Ding, H.; Li, WW; Zhu, M. Kiinalaisen kasviperäisen lääkevalmisteen alustava optimointi, joka perustuu neuroprotektiivisiin vaikutuksiin rotenonin aiheuttaman Parkinsonin taudin rottamallissa. J. Integr. Med. 2018, 16, 290–296. [CrossRef] [PubMed]

13. Kojima, M.; Hosoda, H.; Päivämäärä, Y.; Nakazato, M.; Matsuo, H.; Kanagawa, K. Ghrelin on kasvuhormonia vapauttava asyloitu peptidi mahalaukusta. Nature 1999, 402, 656–660. [CrossRef] [PubMed]

14. Zigman, JM; Jones, JE; Lee, CE; Saper, CB; Elmquist, JK. Greliinireseptorin mRNA:n ilmentyminen rotan ja hiiren aivoissa. J. Comp. Neurol. 2006, 494, 528–548. [CrossRef] [PubMed]

15. Castaneda, TR; Tong, J.; Datta, R.; Culler, M.; Tschop, MH Ghrelin kehon painon ja aineenvaihdunnan säätelyssä. Edessä. Neuroendokrinoli. 2010, 31, 44–60. [CrossRef] [PubMed]

16. Rudman, D.; Feller, AG; Nagra, HS; saksalaiset, GA; Lalitha, PY; Goldberg, AF; Schlenker, RA; Cohn, L.; Rudman, IW; Mattson, DE Ihmisen kasvuhormonin vaikutukset yli 60-vuotiailla miehillä. N. Engl. J. Med. 1990, 323, 1–6. [CrossRef] [PubMed]

17. Liu, H.; Bravata, DM; Olkin, I.; Nayak, S.; Roberts, B.; Garber, AM; Hoffman, AR Systemaattinen katsaus: Kasvuhormonin turvallisuus ja tehokkuus terveillä vanhuksilla. Ann. Harjoittelija. Med. 2007, 146, 104–115. [CrossRef] [PubMed]

18. Giordano, R.; Bonelli, L.; Marinazzo, E.; Ghigo, E.; Arviat, E. Kasvuhormonihoito ihmisen ikääntyessä: hyödyt ja riskit. Hormones 2008, 7, 133–139. [CrossRef] [PubMed]

19. Sattler, FR Kasvuhormoni ikääntyvällä miehellä. Paras käytäntö. Res. Clin. Endokrinol. 2013, 27, 541–555. [CrossRef]

20. Lo, YH; Chen, YJ; Chang, CI; Lin, YW; Chen, CY; Lee, MR; Lee, VS; Tzen, JTC Teaghreliinit, ainutlaatuiset asyloidut flavonoiditetraglykosidit Chin-shin oolong-teetissä, ovat oletettuja greliinireseptorin oraalisia agonisteja.

J. Agric. Food Chem. 2014, 62, 5085–5091. [CrossRef]

21. Hsieh, SK; Katso, YH; Wu, CC; Chung, TY; Tzen, JTC Teaghreliinien ja teaghreliinin kaltaisten yhdisteiden biosynteettisten välituotteiden tunnistaminen oolong-teetistä ja niiden molekyylinen kiinnittyminen greliinireseptoriin.

J. Food Drug Anal. 2015, 23, 660–670. [CrossRef]

22. Hsieh, SK; Chung, TY; Li, YC; Katso, YH; Lin, NH; Kuo, PC; Chen, WY; Tzen, JTC Ginkgoghrelins, ainutlaatuiset asyloidut flavonoidiglykosidit Folium Ginkgossa, stimuloivat kasvuhormonin eritystä aktivoimalla greliinireseptoria. J. Ethnopharmacol. 2016, 193, 237–247. [CrossRef]

23. Han, L.; Mavis, BY; Liu, E.; Zhang, Y.; Li, W.; Song, X.; Fu, F.; Gao, X. Cistanches deserticola YC Ma:n fenyylietanoidiglykosidien rakenteellinen karakterisointi ja tunnistaminen UHPLC/ESI-QTOF-MS/MS:llä. Phytochem. Anaali. 2012, 23, 668–676. [CrossRef]

24. Lu, D.; Zhang, J.; Yang, Z.; Liu, H.; Li, S.; Wu, B.; Ma, Z. Cistanches Herban kvantitatiivinen analyysi käyttämällä korkean suorituskyvyn nestekromatografiaa yhdistettynä diodirivitunnistukseen ja korkearesoluutioiseen massaspektrometriaan yhdistettynä kemometrisiin menetelmiin. J. Sep. Sei. 2013, 36, 1945–1952. [CrossRef]

25. Moon, M.; Kim, HG; Hwang, L.; Seo, JH; Kim, S.; Hwang, S.; Kim, S.; Lee, D.; Chung, H.; Voi, MS; et ai. Greliinin neuroprotektiivinen vaikutus Parkinsonin taudin 1-metyyli-4-fenyyli-1, 2, 3, 6-tetrahydropyridiinihiirimallissa estämällä mikrogliaaktivaation. Neurotox. Res. 2009, 15, 332–347. [CrossRef]

26. Lupien, SJ; Isabelle, OM; Hupbach, A.; Tu, MT; Buss, C.; Walker, D.; Pruessner, J.; Mcewen, BS Stressikonseptin lisäksi: Allostaattinen kuormitus – Biologinen ja kognitiivinen kehitysnäkökulma. Teoksessa Developmental Psychopathology: Osa 2: Developmental Neuroscience; John Wiley & Sons, Inc.: New York, NY, USA, 2015; s. 578–628.

27. Rizzo, M.; Rizvi, AA; Sudar, E.; Soskic, S.; Obradovic, M.; Montalto, G.; Boutjdir, M.; Mikhailidis, DP; Isenovic, ER Katsaus greliinin sydän- ja verisuoni- ja aterogeenisistä vaikutuksista. Curr. Pharm. Des. 2013, 19, 4953–4963. [CrossRef]

28. Holst, B.; Lang, M.; Brandt, E.; Bach, A.; Howard, A.; Frimurer, TM; Beck-Sickinger, A.; Schwartz, TW Ghrelin-reseptorin käänteisagonistit: Aktiivisen peptidiytimen ja sen vuorovaikutteisten epitooppien tunnistaminen reseptorilla. Mol. Pharmacol. 2006, 70, 936–946. [CrossRef]

29. Yamazaki, M.; Nakamura, K.; Kobayashi, H.; Matsubara, M.; Hayashi, Y.; Kanagawa, K.; Sakai, T. Greliinin säätelyvaikutus kasvuhormonin erittymiseen perfusoiduista rotan aivolisäkkeen eturauhassoluista. J. Neuroendocrinol. 2002, 14, 156–162. [CrossRef]

30. Lo, YH; Chen, YJ; Chung, TY; Lin, NH; Chen, WY; Chen, CY; Lee, MR; Chou, CC; Tzen, JTC Emoghrelin, ainutlaatuinen emodiinijohdannainen Heshouwussa, stimuloi kasvuhormonin eritystä aktivoimalla greliinireseptoria. J. Ethnopharmacol. 2015, 159, 1–8. [CrossRef]

31. Moukhametzianov, R.; Warne, T.; Edwards, PC; Serrano-Vega, MJ; Leslie, AG; Tate, CG; Schertler, GF Kaksi erillistä helix 6:n konformaatiota havaittu beeta1-adrenergisen reseptorin antagonisteihin sitoutuneissa rakenteissa. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2011, 108, 8228–8232. [CrossRef]

32. Rosenbaum, DM; Zhang, C.; Lyons, JA; Holl, R.; Aragao, D.; Arlow, DH; Rasmussen, SG; Choi, HJ; Devree, BT; Sunahara, RK; et ai. Irreversiibelin agonisti-beeta(2)-adrenoseptorikompleksin rakenne ja toiminta. Nature 2011, 469, 236–240. [CrossRef]

33. Brooks, BR; Bruccoleri, RE; Olafson, BD; osavaltiot, DJ; Swaminathan, S.; Karplus, M. CHARMM – Ohjelma makromolekyylienergian, minimoinnin ja dynamiikan laskemiseen. J. Comput. Chem. 1983, 4, 187-217. [CrossRef]