Osa 3: Ainutlaatuinen varhaiselämän harjoituksen hiirimalli mahdollistaa hippokampuksen muistin ja synaptisen plastisuuden

lisätietoja:ali.ma@wecistanche.com

Pls klikkaa tästä päästäksesi osaan 2

Materiaalit ja menetelmät

Eläimet. Villityypin hiiret olivat C57Bl6J-emojen jälkeläisiä, jotka saatiin alun perin Jackson Laboratoriesilta ja jalostettiin edelleen eläintiloissamme. Hiirillä oli vapaa pääsy ruokaan ja veteen, ja valot pidettiin 12 tunnin valo/pimeä-syklissä. Synnytyksen jälkeisenä päivänä (P) 21 vieroituksen jälkeen hiiret sijoitettiin joko tavallisiin kuivikehäkkeihin tai juoksupyörällä varustettuihin häkkeihin. Sekä uros- että naarashiiriä käytettiin kaikissa harjoitus- ja käyttäytymiskokeissa. Sähköfysiologisiin tutkimuksiin käytettiin vain uroshiiriä. Kaikki käyttäytymistestit suoritettiin valosyklin aikana. Kokeet suoritettiin Yhdysvaltain kansallisten terveysinstituuttien eläinten hoitoa ja käyttöä koskevien ohjeiden mukaisesti, ja Kalifornian yliopiston Irvinen Institutional Animal Care and Use Committee hyväksyi ne.

NapsautaCistanche-efektit parantavat muistia

Juoksevan pyörän paradigma. Vieroitettaessa P21:llä hiiret pidettiin pareittain joko tavallisissa häkeissä ilman pyörää tai varustettiin joko liikkuvalla tai kiinteällä ruostumattomasta teräksestä valmistetulla juoksupyörällä (halkaisija 4,5 cm, 112 grammaa, Starr Life Sciences). Juoksupyörillä pidetyillä eläimillä oli vapaa pääsy ennalta määrätyn ajan: joko yksi viikko nuorisokaudella (P21–27; juv ELE), yksi viikko murrosiässä (P35–41; Adol ELE) tai kolme peräkkäistä viikkoa (P21– 41; juv-adol ELE). Toinen ryhmä hiiriä pidettiin paikallaan pysyvällä pyörällä P21–41:n (sta) aikana ympäristön rikastumisen valvomiseksi häkissä olevan pyörän vuoksi. Jokainen pyörä varustettiin kevyellä polyuretaaniverkolla estämään vieroitushiirien pieniä raajoja liukumasta pyörien puolasta. Juoksutoimintaa seurattiin digitaalisesti valvotuilla sensoreilla, jotka oli liitetty tietoporttiin ja tietokoneeseen reaaliaikaista tiedonkeruuta varten (Vital View -ohjelmisto) pyörän kierrosten magneettisen havaitsemisen avulla. Jokainen digitaalisesti valvottu pyörä seurasi häkin juoksumatkaa (kaksi hiirtä oli sijoitettu häkkiin, joten häkkiä kohti kuljettu matka edustaa kahden hiiren välistä kokonaismatkaa). Kierrokset kvantifioitiin minuutteina päivittäin juoksun keston ajan ja muunnettiin juoksetuksi matkaksi häkkiä kohti (km).

Objektin sijaintimuisti(OLM) protokollaa. Objektin sijaintimuistitässä tutkimuksessa käytetty protokolla on mukautettu ja muokattu aiemmista protokollista44. Synnytyksen jälkeisenä päivänä 36 hiiret tuotiin testaushuoneeseen, jossa huoneen kirkkaus oli vähentynyt. Hiiriä käsiteltiin noin 2 minuuttia kutakin, yhteensä 5 peräkkäistä päivää ennen OLM-harjoitusta (kahdesti päivässä ensimmäisten 2 päivän ajan ja sen jälkeen kerran päivässä seuraavien 3 päivän ajan). Totutusistunnot olivat 5 minuuttia, kahdesti päivässä 3 päivän ajan (P38-P40) ja ne tapahtuivat kammioissa, joissa oli neljä ainutlaatuista tilavihjettä kammion jokaisella seinällä (vaakaviivat, musta X, pystysuora nauha ja tyhjä seinä). . Tottuminen meni päällekkäin kahden viimeisen käsittelypäivän kanssa. Harjoitusvaiheen (P41) aikana hiiret sijoitettiin samoihin kammioihin kahdella identtisellä esineellä ja altistettiin joko kynnyksen alaiselle (3 min) tai kynnykselle (10 min) harjoitusjaksolle; aiemman työn perusteella tehty tutkimussuunnitelma, joka osoittaa, että 3 minuutin harjoittelu ei tyypillisesti riitä pitkällä aikavälillämuistimuodostuminen45. Harjoitushäkeissä oleville hiirille juoksupyörät lukittiin välittömästi OLM-harjoittelun jälkeen, jotta harjoituksen akuutit vaikutukset poistuivat.muistikonsolidointi. Testauspäivänä (P42; 24 tuntia harjoituksen jälkeen) yksi kohteista siirrettiin uuteen paikkaan kammion sisällä, ja sitten hiirten annettiin tutkia kohteita 5 minuutin ajan. Kunkin kohteen kanssa vietetyt ajat määritettiin sokkoanalyysillä käsin pisteyttämällä, ja sekä koulutus- että testauspäivinä saadut arvot muunnettiin erotteluindeksiksi (DI), joka perustui kohteen uuteen sijaintiin testauksen aikana: [(käytetty aika) uuden kohteen tutkiminen – tutun kohteen tutkimiseen käytetty aika)/(kokonaisaika molempien esineiden tutkimiseen) × 100 prosenttia ]. Siinä ei ollut merkittäviä erojamuistisuorituskyky istuvien eläinten ja kiinteällä pyörällä pidettyjen eläinten välillä, joten nämä ryhmät yhdistettiin ja esitettiin "ei ELE" kaikissa OLM-analyyseissä. Tottumiskokeet analysoitiin istuntojen välillä kuljetun matkan suhteen käyttämällä ANY-labyrintti käyttäytymisanalyysiohjelmistoa (Stoelting Co). Analyysistä suljettiin pois hiiret, joilla oli epätasaiset tutkimusajat kahden kohteen välillä harjoitusvaiheen aikana (DI > 20) tai jotka eivät osoittaneet pienenemistä totutusistuntojen aikana kuljetussa kokonaismatkassa.

Cistanche voi auttaa parantamaan muistia

elektrofysiologiset tutkimukset. Elektrofysiologiset kokeet suoritettiin aiemmin kuvatulla tavalla, ja näiden menetelmien lähde on julkaistu muualla66. Sähköfysiologisiin kokeisiin käytettiin vain uroshiiriä. Lyhyesti sanottuna uroshiiret kaikista ELE-ryhmistä tapettiin välillä P42–51, ja viipaleita kerättiin rostraalisesta hippokampuksesta. Koronaaliset viipaleet leikattiin (Leica VT1000 S) 320 um:n paksuudella ja asetettiin rajapinta-tallennuskammioon, jossa oli esilämmitetty (31 ± 1 astetta) keinotekoinen aivo-selkäydinneste (124 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,25 mM KH2P04, 1,5 mM MgS04, 2,5 mM CaCl2, 26 mM NaHC03 ja 10 mM d-glukoosi). Viipaleita perfusoitiin jatkuvasti nopeudella 1,75–2 ml minuutissa samalla, kun viipaleiden pinta altistettiin lämpimälle, kostutetulle 95 prosentin O2/5 prosentin CO2:lle. Tallentaminen aloitettiin vähintään 2 tunnin inkuboinnin jälkeen. Kentän eksitatoriset postsynaptiset potentiaalit (fEPSP:t) tallennettiin CA1b stratum radiatumista käyttämällä yhtä lasipipettiä (2–3 MΩ), joka oli täytetty 2 M NaCl:lla. Stimulaatiopulssit (0,05 Hz) toimitettiin Schaferin sivu-komissuraalisiin projektioihin käyttämällä bipolaarista stimuloivaa elektrodia (kierretty nikromilanka, 65 μm), joka oli sijoitettu CA1c:hen. Virran voimakkuus säädettiin siten, että saavutettiin 50 prosenttia maksimaalisesta fEPSP-vasteesta. Sen jälkeen kun vakaa perusviiva oli saatu aikaan, LTP indusoitiin yhdellä viiden theta-purskeen sarjalla, jossa jokainen purske (neljä pulssia 100 Hz:llä) välitettiin 200 ms:n välein (eli theta-taajuudella). Stimuloinnin intensiteetti ei lisääntynyt TBS:n aikana. Tiedot kerättiin ja digitoitiin NAC 2.0 Neurodata Acquisition System -järjestelmällä (Teta Burst). LTP-luvun tiedot normalisoitiin lähtötason viimeiseen 10 minuuttiin ja esitettiin keskiarvona ± SE. I/O-käyrien, paripulssin fasilitoinnin ja LTP:n perusmittaukset analysoitiin käyttämällä kaksisuuntaista ANOVA- ja lineaarista regressioanalyysiä (Graphpad Prism 8 -ohjelmisto).Cistanche voi auttaa parantamaan muistia.

Tilastolliset analyysit. Yksisuuntaisia ​​ANOVA-tutkimuksia käytettiin analysoimaan varhaisen elämän harjoituksen ajoituksen vaikutusta OLM-hankinta-DI:ihin (kuva 2d, g), OLM-testauksen DI:ihin (kuva 2e, h) ja OLM-testauksen kokonaistutkimusaikoihin (kuva 2f). , i) kummankin sukupuolen sisällä. Dunnettin moninkertaisia ​​post-hoc-vertailuja käytettiin spesifisten vertailujen tekemiseen "ei ELE" (istuva) -ryhmään, kun havaittiin merkittäviä ANOVA-tuloksia. Kaksisuuntaista ANOVAa käytettiin hiiren ELE-jakson aikana nousseen painon analysoimiseen (kuvio 1b, ELE-ryhmän ja sukupuolen tekijät). Kaksisuuntaisia ​​toistuvia mittauksia (RM)-ANOVA:ita käytettiin päivittäisen juoksumatkan (kuvio 1c–e, synnytyksen jälkeisen päivän ja sukupuolen tekijät), tottumisistuntojen (kuvat 2b, c) analysoimiseen ja OLM:n hankinnan DI:n ja testauksen DI:n vertaamiseen. jokaiselle hiirelle ryhmän sisäisiä vertailuja varten. Sidakin post hoc -testejä käytettiin erityisten vertailujen tekemiseen, kun havaittiin merkittäviä vuorovaikutuksia tai juoksuryhmän tai OLM-istunnon päävaikutuksia. Lisäksi OLM-testauksen DI:ille suoritettiin kolmisuuntainen ANOVA kaikkien kolmen nimellisen muuttujan (OLM-harjoittelun kesto, ELE-ryhmä ja sukupuoli) välisten merkittävien vuorovaikutusten määrittämiseksi. Harvinaisissa tapauksissa, joissa 24 tunnin juoksutietoja ei kirjattu tietyltä päivältä, arvot laskettiin kolmen edellisen päivän keskimääräisen juoksumatkan perusteella tilastollisten analyysien suorittamiseksi. Parittomia Studentin t-testejä käytettiin analysoimaan kokonaisjuoksumatkoja kullekin ELE-ryhmälle (kuvat 1f–h) sekä vertaamaan OLM-testin DI-arvoja 3-min ja 10-min koulutettujen istuvien hiirten välillä. Kumulatiiviset juoksumatkat ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SD. Kaikkien ANOVA-analyysien tärkeimmät vaikutukset ja vuorovaikutukset on kuvattu teksti- ja kuvaseliteissä sekä kussakin kokeessa käytettyjen kutakin sukupuolta olevien eläinten määrä. Kaikki analyysit olivat kaksisuuntaisia ​​ja vaativat arvon 0,05 merkitsevyyden vuoksi. Virhepalkit kaikissa kuvissa edustavat SEM:ää. Kaikissa kokeissa arvoja ±2 standardipoikkeamaa ryhmän keskiarvosta pidettiin poikkeavina ja ne poistettiin analyyseistä. Kaikki tilastot suoritettiin GraphPad Prism 8 -ohjelmistolla. Käyttäytymiskokeissa käytettyjen hiirten kokonaismäärä=152.

Cistanche voi auttaa parantamaan muistia

Vastaanotettu: 16. tammikuuta 2020; Hyväksytty: 13.5.2020;

Julkaistu: xx xx xxxx

Kiitokset

Tätä tutkimusta tukivat National Institute of Neurological Disorders and Stroke of National Institutes of Health, tunnusnumero K12NS098482 (myönnetty ASI:lle) ja UC Irvine School of Medicine, Pediatrics Department. Haluamme myös kiittää tohtori Marcelo Woodia heidän tieteellisistä keskusteluistaan ​​ja kriittisestä panoksestaan ​​projektiin.

Tekijän panokset

ASI, TY, SP, FS ja TV suorittivat harjoitus- ja käyttäytymiskokeita ja analysoivat dataa; EK suoritti kaikki sähköfysiologiset kokeet, analysoi tiedot ja muokkasi käsikirjoituksen; ASI suunnitteli tutkimuksen, analysoi tiedot, tulkitsi tuloksia ja kirjoitti käsikirjoituksen.

kilpailevat kiinnostuksen kohteet

Kirjoittajat eivät ilmoittaneet kilpailevia etuja.

Lisäinformaatio

Kirjeenvaihto ja materiaalipyynnöt tulee osoittaa ASI:lle

Uusintapainoksia ja käyttöoikeuksia koskevat tiedot ovat saatavilla osoitteessa www.nature.com/reprints.

Kustantajan huomautus Springer Nature pysyy neutraalina julkaistujen karttojen ja institutionaalisten yhteyksien suhteen.