Ottaa yhteyttä:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Pls napsauta tästä päästäksesi osaan 1

Cistanche-yrtillä on erittäin hyvä hermostoa suojaava vaikutus

2.6. Kaspaasi-3/7 aktiivisuusmittauksilla määritettyjen sytokiniinien anti-apoptoottiset vaikutukset

Kuten yllä kuvatut PI-värjäysmääritykset osoittavat, SAL aiheutti nousua SH-SY5Y-solujen kuolleisuusasteessa. Koska SAL liittyy sekä apoptoosiin että nekroosiin [51], tutkimme myös kaspaasin-3 ja 7:n (casp-3/7) aktivaatiota apoptoosin (suoritusvaiheen) spesifisenä markkerina [52]. sen jälkeen, kun solut on altistettu CK:ille. Kullakin testiyhdisteellä käsittelyn jälkeen kirjatut kaspaasi-3/7-aktiivisuudet normalisoitiin suhteessa 50{{30}} uM SAL-hoidon jälkeen kirjattuihin aktiivisuuksiin (asetettu 100:ksi prosenttia). Kuten kuvasta 4 näkyy, tunnettu kaspaasin estäjä Ac-DEVD-CHO (sisältyy spesifisenä, apoptoosiin liittyvänä kontrollina) esti voimakkaasti kaspaasi-3/7-aktiivisuutta submikromolaarisilla pitoisuuksilla (36,3 ± 2,66 ja 25,2). ± 2,69 prosenttia tasoista soluissa, joita on käsitelty pelkällä SAL:lla 0,05 ja 0,5 uM, vastaavasti). Samanlaisia ​​eston tasoja on havaittu aiemmin [53] erilaisissa in vitro SH-SY5Y-solupohjaisissa neurodegeneraatiomalleissa. Positiivinen kontrolli NAC vähensi myös merkittävästi kaspaasi-3/7 aktiivisuutta, 88,7 ± 1,87 prosenttiin ja 78,5 ± 2,56 prosenttiin SAL:n aiheuttamista tasoista 100 uM ja 1 000 uM, vastaavasti. Testatuilla CK:illa oli laaja valikoima vaikutuksia kaspaasi{50}}/7-aktiivisuuteen. Mielenkiintoista on CK-ribosideista, että vain cZR:llä oli merkittäviä vaikutuksia aktiivisuuksiin 0,1 uM:lla (vähentäen ne vastaavasti 83,3 ± 4,33 prosenttiin SAL:n aiheuttamista tasoista), kun taas iPR 1 uM:lla ei vähentänyt merkittävästi casp-3 ,7. Lopuksi K3G vähensi kaspaasi-3/7-aktiivisuutta maksimivaikutuksen ollessa 10 uM (81,7 ± 4,31 prosenttiin SAL:n aiheuttamasta tasosta). Kaiken kaikkiaan SAL indusoi 16-kertaisen kasvun kaspaasi-3/7-aktiivisuudessa terveisiin kontrollisoluihin verrattuna (CTR, kuva 4) aikaisemman tutkimuksen tulosten mukaisesti, jossa samanlainen Käytettiin SAL-konsentraatiota (400 uM) ja samaa solulinjaa [54]. NAC:n tiedetään vaikuttavan kaspaasi-3/7-aktiivisuuteen useissaneuronaalinenkuolema [55-58]. Tässä esitetyt tulokset tarjoavat kuitenkin ensimmäisen osoituksen niiden kaspaasista-3/7 SH-SY5Y-solupohjaisessa SAL-indusoidussa mallissa.neuronaalinenkuolema. Positiivinen kontrolli vähensi 500 uM SAL:n indusoimaa kaspaasi-3/7-aktiivisuutta samalla tavalla kuin CK:t, mutta cZR ja K3G olivat tehokkaita jopa submikromolaarisilla tai mikromolaarisilla pitoisuuksilla. Muut tutkimukset stressimalleilla, jotka liittyvät PD:hen (proteasomi-inhibiittori MG 132- tai H2O2--indusoitu toksisuus SH-SY5Y-soluissa [17] ja fibroblasteissa [15]) ja Huntingtonin tautiin (seerumin nälkämalli PC12-solut [19]) ovat myös osoittaneet, että CK:illa K ja tZR:llä voi olla anti-apoptoottista (kaspaasi-3) aktiivisuutta [17] ja että sekä K:lla että tZR:llä voi olla vanhenemista estäviä vaikutuksia [17,19] . Lisäksi yhteydet vähenevän casp-3,7-aktivoinnin jahermoja suojaavaaktiivisuus raportoitu SAL:lle ja SAL:iin liittyville malleille [54,59,60].

Kuva 4. Kaspaasi-3/7-aktiivisuus SAL-indusoidussa PD-mallissa. Kolminkertaistuu vähintään neljässä itsenäisessä päivässä. * P verrattuna ajoneuvoon, jossa on 500 uM SAL, # P verrattuna ajoneuvoon, jossa ei ole 500 uM SAL.

2.7. Sytokiniinin neuroprotektiivisen aktiivisuuden tunnistaminen glutamaatin aiheuttamassa solukuolemamallissa

Koska SH-SY5Y-solut eivät ilmennä kaikkia NMDA-reseptorin alayksiköitä [61], todennäköisin glutamaatti (Glu) toksisuuden mekanismi on kystiini/glutamaatti Xc-antiporterin tukkeutuminen ja massiivinen oksidatiivisen stressin induktio [62]. Aiemmat kirjoittajat ovat jo osoittaneet yhteyden glutamaatin aiheuttaman solukuoleman ja nekroptoosin välillä SH-SY5Y-soluissa [63] ja kaspaasin -3 aktivoitumisen merkityksen glutamaatin aiheuttamassa toksisuudessa niitä kohtaan [62,64]. Useat tutkimukset ovat osoittaneet myös raudan aiheuttaman solukuoleman (ferroptoosi) esiintymisen glutamaattimyrkytysten jälkeen [62, 65, 66] ja osoittaneet kolmen tyyppisen solukuoleman (nekroptoosi, apoptoosi ja ferroptoosi) esiintymisen Xc:n salpauksen jälkeen. -antiporter-järjestelmä. Saadakseen valmiiksi kattavan arvioinninhermoja suojaavatestattavan potentiaaliasytokiniinit, glutamaatin aiheuttama solukuoleman määritysjärjestelmä sisällytettiin analyyttiseen paneeliin, jossa tunnetaanhermoja suojaavarautakelaattori deferoksamiini (DFO) ja nekroptoosin estäjä nekrostatiini-1 (NEC-1) [67] positiivisina kontrolleina. Tässä SH-SY5Y-soluja erilaistettiin 48 tunnin ajan, minkä jälkeen niitä käsiteltiin 160 mM Glu:lla tai niiden yhteiskäsittelyssä erilaisillasytokiniinipitoisuuksilla ({{0},1–10 uM) 24 tunnin ajan ja värjättiin PI:llä. Tässä mallissa Glu:n vaikutus solukuolemaan oli 100-prosenttinen PI-signaali, joten testiyhdisteiden aiheuttama solukuoleman väheneminen arvioitiin. Glu aiheutti lähes 4--kertaisen kasvun solukuolemassa terveisiin SH-SY5Y-kontrolleihin verrattuna (26,1 ± 0,42 prosenttia). Positiivisten kontrollien seulonta jasytokiniinitpaljasti, että molemmat positiiviset kontrollit NEC-1 (50 uM, 76,6 ± 2,51 prosenttia) ja DFO (10 uM, 84,2 ± 4,54 prosenttia) vähensivät glutamaatin aiheuttamaa solukuolemaa. Kuten kuvassa 5A näkyy, paneelistasytokiniinit, vain kolmesytokiniinitpystyivät suojelemaanneuroni-kuten SH-SY5Y-soluja samalla tavalla kuin positiiviset kontrollit. Aktiivisinsytokiniinitolivat trans-zeatiini (tZ) (0,1 uM, 79,5 ± 2,91 prosenttia ; 1 uM, 81,3 ± 2,77 prosenttia) ja cis-zeatiini (CZ) (0,1 uM, 82,1 ± 3,29) prosenttia ; 1 uM, {{20}},2 ± 2,89 prosenttia ) ja kinetiini (K) (1 uM, 88.0 ± 3,76 prosenttia ; 10 uM, 79,9 ± 3,44 prosenttia). Niiden lupaavan aktiivisuuden vahvistamiseksi käytettiin ortogonaalista määritystä, jossa selvitettiin yksityiskohtaisemmin CK:iden biologisia vaikutuksia tässä mallissa: Laktaattidehydrogenaasin (LDH) vapautumismääritys [68], joka osoitti myös dramaattisen (4--kertaisen) toksisuuden lisääntyminen Glu-hoidon jälkeen. Mielenkiintoista on, että LDH:n vapautumisen määrittäminen antoi meille mahdollisuuden erottaa CK:iden ja positiivisten kontrollien (NEC-1 ja DFO) aktiivisuudet. CK:illa oli kohtalainen mutta merkittävä suojaava aktiivisuus (tZ vähensi kuolleisuutta 91,9 ± 1,40 prosenttiin 0,1 uM:lla; cZ laski ne 92,3 ± 1,15 prosenttiin 0,1 uM:lla ja 91,7 ± 1,56 prosenttiin 1 uM:lla; 2 alensi niitä 1 uM:iin; 2.2. 1,06 prosenttia 1 uM:ssa). Positiivisilla kontrolleilla NEC-1 ja DFO:lla oli voimakkaammat suojaavat vaikutukset, mutta ne olivat tehokkaita paljon korkeammilla pitoisuuksilla (pienensi nopeudet 76,9 ± 2,94 prosenttiin ja 81,6 ± 3,74 prosenttiin vastaavasti 50 ja 10 uM:lla) (kuva 5B). LDH-määritys validoi PI-värjäyksellä saadut indikaatiot ja positiivisten kontrollien havaitut vaikutukset olivat yhdenmukaisia ​​julkaistujen tietojen kanssa [69,70]. Havainnot K:n vaikutuksista Glu-indusoidussa solukuolemamallissa HT22-soluissa [18] ja havainnot edustavien CK:iden, kuten tZ:n, cZ:n ja K:n vaikutuksista osoittavat, että CK:t ovat lupaavia ehdokkaita oksidatiiviseen stressiin liittyvien neurodegeneratiivisten sairauksien hoidossa. 71]. Lopuksi tZ ja cZ olivat suositeltavia, koska ne olivat tehokkaita pienemmillä pitoisuuksilla ja valittiin yhdessä K:n kanssa lisätutkimuksiin niiden vaikutuksista oksidatiivisen stressin ja kaspaasin -3,7-aktivaatioon.

cistanchearvostelutvaikutuksistahermosolujen suojaus

2.8. Sytokiniinien vaikutukset Glu:n aiheuttamaan oksidatiiviseen stressiin SH-SY5Y-soluissa

Toisin kuin edellinen malli, Glu voi aiheuttaa oksidatiivista stressiä SH-SY5Y-soluissa eri reiteillä. Yksi perustuu kystiini/glutamaatti (Xc-) antiportterin tukkeutumiseen, mikä johtaa glutationin (GSH) ehtymiseen ja negatiivisiin vaikutuksiin superoksididismutaasin (SOD) aktiivisuuteen [62]. Glu-välitteiseen solukuolemaan liittyy oletettavasti myös Rac-NADPH-oksidaasin ohjaama ROS- (erityisesti superoksidiradikaali) muodostuminen SH-SY5Y-soluissa [72]. Nämä havainnot osoittavat, että ensisijainen solukuoleman syy Glu-indusoidussa mallissa on käyttöjärjestelmä. Mallin sisällä,neuroni-kaltaisia ​​soluja käsiteltiin yhdessä Glu:lla ja testatuilla yhdisteillä, värjättiin DHE:llä ja tarkkailtiin fluoresenssimikroskopialla. Kuten kuviosta 6A voidaan nähdä, punaisen DHE-fluoresenssin dramaattinen nousu havaittiin Glu-käsitellyissä soluissa, jota positiiviset kontrolliaineet ja testatut CK:t paransivat. Mikroskooppihavainnon perusteella superoksiditasojen kvantifiointi suoritettiin Glu-indusoiduissa soluissa samalla tavalla, DHE-määrityksellä, kuin SAL-indusoiduissa soluissa. Tulokset normalisoitiin pelkän Glu:n aiheuttamiin tasoihin (asetettu 100 prosentiksi), mikä aiheutti dramaattisen, lähes 3-kertaisen nousun superoksiditasoissa vain 4 tunnissa.neuroni-kuten SH-SY5Y-soluja verrattuna tasoihin terveissä kontrollisoluissa (CTR: 33,79 ± 1,45 prosenttia). Kuten kuvasta 6B näkyy, CK:t, kuten tZ, cZ ja K, vähensivät merkittävästi superoksiditasoa Glu-myrkytyksissä soluissa: 0,1 uM tZ, 0,1 uM cZ, 1 uM ja 10 uM K alensi sen arvoihin 81,0 ± 4,03, 80,6 ± 3,89, 81,8 ± 3,39 ja 83,8 ± 2,32 prosenttiin pelkällä Glu:lla käsiteltyjen solujen tasoista. Nämä tasot ovat verrattavissa nekroptoosi-inhibiittorilla NEC-1 (80,5 ± 3,19 prosenttia 5 uM:lla ja 80,4 ± 2,70 prosenttia 50 uM:lla) ja rautakelaattorilla DFO:lla (80,2 ± 3,80 prosenttia 10 uM:lla) saatuihin tasoihin. Glu-indusoidulla solukuolemamallilla saadut tulokset, erityisesti positiivisten kontrollien vaikutukset, ovat yhdenmukaisia ​​aiempien raporttien kanssa [70,73]. Aiemmat todisteet siitä, että CK:illa on OS-vähentäviä vaikutuksia Glu-indusoiduissa tai vastaavissa malleissa, rajoittuvat osoittamaan, että K on voimakas OS:tä vähentävä aine (noin 23 uM) HT22-solupohjaisessa Glu-indusoidussa solukuolemamallissa [18 ]. Havaitsimme, että K:lla oli OS-vähentävä vaikutus pienemmillä pitoisuuksilla (1–10 uM) SH-SY5Y-soluissamme. Lisäksi on havaittu tZ:n hyödyllisiä pitkän aikavälin vaikutuksia ihmisen fibroblasteihin, mukaan lukien vetyperoksidia hajottava aktiivisuus [15], mikä viittaa siihen, että tZ:llä ja cZ:llä voi olla epäsuoria OS-vähentäviä vaikutuksia Glu-indusoiduissa solukuolemamalleissa. Lisäksi muut raportit huomauttivat CKs-välitteisen käyttöjärjestelmää vähentävän vaikutuksen ja suojaavan vaikutuksen väliset yhteydet [22,74–76]. Yhdessä tZ, cZ ja K osoittivat yllättävän voimakkaita käyttöjärjestelmää vähentäviä vaikutuksia, jotka olivat verrattavissa positiivisten kontrollien vaikutuksiin, huolimatta kokonaisvahvuuksista.hermoja suojaavavaikutus.

Kuva 5. (A) Kuolleisuusasteneuroni-kuten SH-SY5Y-solut glutamaatin (Glu) indusoimassa solukuoleman mallissa; (B) Glu:n aiheuttama toksisuus (LDH-vapautus).neuroni-kuten SH-SY5Y-solut. Kolminkertaistuu vähintään kolmessa itsenäisessä päivässä.* P verrattuna ajoneuvoon, jossa on 160 uM Glu:ta, # P verrattuna ajoneuvoon, jossa ei ole 160 uM Glu:ta.

Kuva 6. (A) Glu:n aiheuttama oksidatiivinen stressi (OS) ja osoitettujen yhdisteiden OS:tä vähentävä aktiivisuus ihmiselläneuroni-kaltaiset SH-SY5Y-solut visualisoituina fluoresenssimikroskopialla dihydroetidium (DHE) -leimauksen jälkeen. Baarit=50 um. Kuvat näyttävätneuroni-kuten SH-SY5Y-soluja, joita on käsitelty DMSO:lla (Control), 160 mM glutamaattilla (Glu) yksinään ja yhdessä seuraavien kanssa: 10 uM deferoksamiinia (plus DFO), 50 uM nekrostatiinia{{6} } ( plus NEC-1), 0,1 uM tZ (plus tZ) ja 0,1 uM cZ ( plus cZ) 4 tunnin ajan, sitten värjättiin DHE:llä. (B) Glu-indusoitu superoksidiradikaalin muodostuminenneuroni-kuten SH-SY5Y-soluja 4 tunnin kuluttua. Kaavio näyttää DHE-värjäytyneiden solujen kvantifioinnin käyttämällä Infinite M200 Pro -mikrolevylukijaa (Tecan, Itävalta). Kolminkertaistuu viidessä itsenäisessä päivässä.

* P verrattuna ajoneuvoon, jossa on 160 uM Glu, # P verrattuna ajoneuvoon, jossa ei ole 160 uM Glu:ta.

2.9. Sytokiniinien vaikutukset kaspaasi-3/7-aktiivisuuteen glukoosi-indusoidussa solukuolemamallissa

Glu:lla on samanlaiset toksiset vaikutukset SH-SY5Y-soluihin kuin aiemmin raportoidut HT22-soluihin kohdistuvat vaikutukset, jotka liittyvät Xc-antiporter-tukkoon. Siten ei-apoptoottiset solukuolemamekanismit (ferroptoosi, nekroptoosi jne.) ovat mukana molemmissa tapauksissa [62], vaikka kaspaasin-3 ja jossain määrin NR1:n NMDA-alayksikön ilmentyminen saattaa esiintyä voimakkaammin SH:ssa -SY5Y-solut [61]. Tästä syystä solukuoleman loppuvaiheet näissä kahdessa solulinjassa voivat vaihdella. Kaspaasi-3-aktiivisuuden myötävaikuttava rooli on havaittu monissa tutkimuksissa SH-SY5Y-solujen glukoosi-indusoidussa solukuoleman mallissa [62,77–79]. Tässä määrityksessäneuroni-kaltaisia ​​SH-SY5Y-soluja käsiteltiin täällä 160 mM Glu:lla, mikä johti kaspaasi-3/7-aktiivisuuden nousuun. Yritettiin selvittää apoptoosin roolia SH-SY5Y-solujen Glu-indusoidussa kuolemassa spesifistä kaspaasi-3/7-inhibiittoria, Ac-DEVD-CHO:ta, ja sen havaittiin olevan voimakas estävä vaikutus: 50 °C:ssa nM se vähensi kaspaasi-3,7-aktiivisuutta 23,70 ± 1,01 prosenttiin käsiteltyjen solujen tasosta

pelkällä Glu:lla ja 0,5 uM:lla se esti aktiivisuuden lähes kokonaan (vähensi sen normalisoidulle tasolle, joka on vain 7,22 ± 1,05 prosenttia; verrattavissa terveissä soluissa havaittuun tasoon:

7,8 ± 0,39 prosenttia ), kuten kuvassa 7 näkyy. Positiivisten kontrollien käyttö johti asteittaiseen annoksesta riippuvaiseen kaspaasi-3,7-aktiivisuuden laskuun. Mielenkiintoista on, että NEC-1:lla oli lievä vaikutus maksimivaikutuksen ollessa 50 uM ja DFO:lla oli voimakkaampi estävä aktiivisuus pitoisuudella 10 uM (pienensi aktiivisuuden arvoon 80,5 ± 1,85 ja 75,8 ± 3). .00 prosenttia ). Toisaalta vain vähäisiä, mutta merkittäviä vaikutuksia casp-3,7 saavutettiin tZ:llä pitoisuudella 1 uM (89,5 ± 2,50 prosenttia), cZ:llä 0,1 uM:lla (87,4 ± 1,62 prosenttia) ja K:lla 1 uM:lla ( 91,0 ± 2,06 prosenttia). Yhteenvetona tulokset osoittavat, että molemmilla positiivisilla kontrolleilla oli voimakkaampi kaspaasi-3/7 aktiivisuutta alentava aktiivisuus kuin testatuilla CK:illa, mutta CK:illa oli vaikutuksia paljon pienemmillä pitoisuuksilla. Kaiken kaikkiaan tulokset osoittavat, että kaspaasi-3/7-toiminnan modulaatiolla on keskeinen roolihermoja suojaavaaineiden, kuten DFO:n [58] aktiivisuus Glu-indusoidussa solukuoleman mallissa [79,80]. Kuitenkin, kuten tässä osiossa näkyy, myös NEC{4}} olihermoja suojaavaaktiivisuus, mikä viittaa siihen, että muun tyyppinen solukuolema saattaa olla osallisena hermosolujen kaltaisten SH-SY5Y-solujen Glu:n aiheuttamaan kuolemaan [63, 67, 81]. Viitteitä siitä, että kaspaasista riippumattomat mekanismit osallistuvat Glu:n aiheuttamaan solukuolemaan, on saatu myös analysoitaessa NEC-1 [70], DFO [69] ja K [18] vaikutuksia HT22-soluihin.

Kuva 7. Kaspaasi-3/7-aktiivisuus hapettumisvaurion Glu-mallissaneuroni-kuten SH-SY5Y-solut. Kolminkertaistuu vähintään neljässä itsenäisessä päivässä. * P verrattuna ajoneuvoon, jossa on 160 uM Glu, # P verrattuna ajoneuvoon, jossa ei ole 160 uM Glu:ta.

3. Johtopäätökset

Yhteenvetona tutkimuksemme paljasti, että CK:illa ja niiden metaboliiteilla onhermoja suojaavaSAL-indusoidussa mallissaParkinsonin tautija Glu:n aiheuttama oksidatiivinen vaurio ihmisen erilaistuneessa SH-SY5Y:ssäneuronaalinensoluja. K3G:llä, cZR:llä ja iPR:llä havaittiin olevan biologisesti merkittäviähermoja suojaavatoimintaa. Lisäksi aktiiviset CK:t olivat tehokkaita pienemmillä (submikromolaarisilla ja mikromolaarisilla) pitoisuuksilla kuin positiivinen kontrolliaine NAC. K3G:llä, cZR:llä ja iPR:llä oli myös positiivisia vaikutuksia elinkelpoisuuteen, sytotoksisuuteen, oksidatiiviseen stressiin ja kaspaasi-3,7-aktiivisuuteen (paitsi iPR). Ortogonaaliset esitykset osoittavat vahvasti, että antioksidanttisella stressiaktiivisuudella on keskeinen rooli CK:iden suojaavissa vaikutuksissa SAL-indusoidussa solukuolemamallissa. Vain kolme metaboliittia testatussa CK-paneelissa (tZ, cZ ja K) suojattiinneuroni-kuten SH-SY5Y-solut Glu-indusoidussa oksidatiivisen vaurion mallissa samalla tavalla kuin rautakelaattori NEC1 ja nekroptoosi-inhibiittori DFO. Vahvistaaksemme niiden lupaavan aktiivisuuden testasimme niiden vaikutuksia ortogonaalisessa laktaattidehydrogenaasin (LDH) vapautumismäärityksessä. CK:illa oli kohtalainen, mutta merkittävä suojaava aktiivisuus. Tämä oli heikompaa kuin vertailuaineiden vastaavat aktiivisuudet, mutta huolimatta eroista modulaatiossaneuronaalinenterveydelle, kaikki kolme testattua CK:ta stimuloivat superoksidiradikaalien muodostumisen voimakasta vähenemistä, samoin kuin positiiviset kontrolliaineet. CK:illa oli myös vertailukelpoisia vaikutuksia Glu:n aiheuttamaan oksidatiiviseen stressiin SH-SY5Y-soluissa NEC1:n ja DFO:n vaikutuksiin, mutta näillä yhdisteillä oli voimakkaampi estovaikutus kaspaasi-3/7-aktiivisuuteen kuin CK:illa. Koska Glu:n aiheuttama solukuolema ei ole riippuvainen kaspaasista riippuvaisesta reitistä, kuten on osoitettu tutkimuksissa DFO:n ja NEC{8}}:n vaikutuksista HT-22-soluihin [70], CK:t voivat ilmeisesti moduloida molempia kaspaasi- riippuvainen ja riippumaton solukuolema vähentämällä oksidatiivista stressiä [18,82]. Käynnissä olevissa tutkimuksissa CK:iden yksityiskohtainen vaikutusmekanismi ja/tai niiden mitokondriovaikutuksetneuronaalinentai astrosyyttisoluja tutkitaan.

cistanchekokeavartenPDjamuisti

4. Materiaalit ja menetelmät

4.1. Kemikaalit ja reagenssit

Sytokiniinistandardit hankittiin OlChemIm:ltä (Olomouc, Tšekki). Calcein AM (1 mg/ml liuos) ja LDH:n vapautuspakkaus ja neuriitin kasvupakkaus ostettiin ThermoFisheriltä. Propidiumjodidi, dihydroetidium, kaspaasi- 3/7-määrityspuskurin komponentit, DMEM/F12 1:1-elatusaine, naudan sikiön seerumi, trypsiini, ATRA, salsolinolihydrobromidi, glutamaattimononatriumsuola, deferoksamiini, N-asetyylikysteiini Ac-DEVD-CHO ja DMSO soluviljelmiä varten hankittiin Sigma Aldrichilta (Merck). Ac-DEVD-AMC-substraatin toimitti Enzo Life Science.

4.2. ORAC Radical Scavenging Activity Assays

Yhdisteiden kyky siepata vapaita radikaaleja in vitro määritettiin Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC) -määrityksellä. Lyhyesti sanottuna fluoreskeiinia (100 ul, 500 mM) ja 25 ul testattua yhdisteliuosta lisättiin 96-kuoppamikrolevylle, jota oli esi-inkuboitu 37 °C:ssa. Seuraavaksi 25 ul 250 mM 2,2<-azobis(2-amidino-propane)dihydrochloride (aaph)="" was="" quickly="" added,="" the="" microplate="" was="" shaken="" for="" 5="" s="" and="" red="" fluorescence="" (with="" 485="" and="" 510="" nm="" excitation="" and="" emission="" wavelengths,="" respectively)="" was="" measured="" every="" 3="" min="" over="" 90="" min="" using="" an="" infinite="" 200="" microplate="" reader="" (tecan,="" männedorf,="" switzerland).="" nauc="" (net="" area="" under="" curve)="" values="" were="" used="" to="" express="" antioxidant="" activities="" relative="" to="" that="" of="" trolox="" (a="" synthetic="" hydrophilic="" analog="" of="" α-tocopherol,="" vitamin="" e).="" substances="" with="" orac="" values="" greater="" than="" zero="" are="" deemed="" to="" actively="" trap="" free="">

4.3. SH-SY5Y -soluviljelmä

ATCC:ltä (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) ostettu ihmisen neuroblastoomasolulinja SH-SY5Y kasvatettiin Dulbeccon modifioidussa Eagle's Medium- ja Ham's F12 -ravinneseoksessa (DMEM: F-12, 1:1). ), jota on täydennetty 10 prosentilla fetal bovine seerumilla (FBS) ja 1 prosentilla penisilliiniä ja streptomysiiniä 37 oC:ssa kosteutetussa 5 prosentin CO2-ilmakehässä. Solut siirrostettiin jopa 20 kertaa ja väliaineet vaihdettiin kahdesti tai kolmesti viikossa. Solutiheys asetettiin sopivaksi suunniteltua määritystä varten (5000, 7000, 10 000 tai 20 000 solua per kuoppa) 96-monikuoppalevyillä 100 ul:n elatusaineen kokonaistilavuuksissa kutakin kohden. koe. Ympätyksen jälkeisenä päivänä ATRA 1-prosenttisessa FBS DMEM/F12-elatusaineessa lisättiin soluihin lopulliseen pitoisuuteen 10 uM, ja inkubaatiota jatkettiin vielä 48 tuntia erilaistumisen indusoimiseksi, pitkien neuriittien muodostumisen mahdollistamiseksi ja leviäminen.

4.4 Mikroskooppi

Mikrokuvat kohteestaneuroni-kaltaiset SH-SY5Y-solut saatiin käyttämällä DM IL LED -fluoresenssimikroskooppia (Leica Microsystems, Mannheim, Saksa) ja sopivalla virityssuodattimella määritystä varten tai kirkaskenttäasetuksella korkean suorituskyvyn digitaalikameralla DP73 (Olympus, Tokio, Japani). ). Koska värjäyksen signaali-kohinasuhde oli kohtalainen, kontrastia säädettiin hieman ImageJ-ohjelmistossa (Fidži) vaikuttamatta tuloksena saatuun havaintoon. Alkuperäiset kuvat sisältyvät lisämateriaaleihin.

4.5. Solukalvon värjäys (Neurite Outgrowth Kit, Invitrogen™)

Neuroni-kaltaiset SH-SY5Y-solut (5000 solua per kuoppa), jotka oli saatu 48 tunnin erilaistumismenettelyllä, värjättiin Neurite outgrowth -pakkauksella (Invitrogen™) valmistajan suositusten mukaisesti pienin muutoksin. Solut pestiin PBS:llä, leimattiin pakkauksen mukana toimitetulla kalvovärjäysväriliuoksella (96 monikuoppalevyn protokollaa noudattaen) PBS:ssä 20 minuutin ajan 37 oC:ssa, pestiin uudelleen PBS:llä ja tarkasteltiin fluoresenssimikroskoopilla ( viritys- ja emissioaallonpituuksilla 533 ja 585 nm).

4.6. Solujen hoito

Erilaistumismenettelyn jälkeen erilaistumisväliaine vaihdettiin 1 prosenttiin DMEM/F12-elatusaineeseen, jota oli täydennetty testiyhdisteillä pitoisuuksilla 0,1 ja 10 uM (7000). soluja per kuoppa sytotoksisuustestejä varten) tai yhdessä toksiinin SAL:n kanssa pitoisuudella 500 uM (7000–10 000 solua per kuoppa) tai 160 mM Glu:lla (20 000 solua per kuoppa) sopivan ajan määritystyypille (elinkykyisyys, solukuolema jne.). Kontrollisoluja käsiteltiin alustalla, joka sisälsi 0,0,1 prosenttia DMSO:ta.

4.7. Solujen elinkelpoisuus ja solukuolema

Elinkelpoisuusneuroni-kaltaiset SH-SY5Y-solut, jotka kasvavat 96-kuoppamikrolevyillä (noin 7000 solua per kuoppa) 24 tunnin käsittelyn jälkeen arvioitiin Calcein AM -määrityksellä pienellä modifikaatiolla [31]. Käytetyn Calcein AM -liuoksen PBS:ssä konsentraatio oli 0,75 uM ja inkubaatioaika asetettiin 50 minuuttiin. Elävien solujen lukumäärä kussakin kuopassa määritettiin käyttämällä Infinite M200 Pro -mikrolevylukijaa (Tecan, Itävalta) 495 ja 517 nm:n viritys- ja emissioaallonpituuksilla, vastaavasti.

solukuolemaneuroni-kaltaiset solut (SAL-malli: 10,000 solua per kuoppa; Glu-malli: 20,000 solua per kuoppa) määritettiin PI-määrityksellä Stone et ai. 2003 pienellä muutoksella [83]. Lyhyesti sanottuna SAL-indusoidun mallin alusta imettiin ja vaihdettiin 1 ug/ml PI:n liuokseen PBS:ssä, mutta Glu-induktiolle altistetut solut tarttuvat heikommin, joten 1 mg/ml PI-liuosta PBS:ssä lisättiin antaa lopulliseksi pitoisuudeksi 1 ug/ml. Molemmissa tapauksissa soluja inkuboitiin vielä 15–25 minuuttia huoneenlämmössä, minkä jälkeen PI-fluoresenssi mitattiin Infinite M200 Pro -lukijalla (Tecan, Grödig, Itävalta) viritys- ja emissioaallonpituuksilla 535 ja 617. Tuloksena saatu PI-fluoresenssi, joka saatiin pelkillä toksiineilla, asetettiin 100-prosenttiseksi solukuolemaksi.

4.8 Oksidatiivisen stressin mittaus dihydroetidium (DHE) -määrityksellä

Solut erilaistettiin ja niitä käsiteltiin edellisessä SAL-induktion osiossa kuvatulla tavalla (10,000 solua per kuoppa, 24 h tai Glu-induktio (20,000 solua per kuoppa, 4 h). käsittelyjen jälkeen soluja sentrifugoitiin 500 xg:llä 330 s, sitten viljelyalusta korvattiin (aspiraation jälkeen) 10 uM DHE-liuoksella PBS:ssä. 96-Monikuoppalevyjä, joissa oli soluja, inkuboitiin pimeässä 30 minuuttia huoneessa DHE-fluoresenssi mitattiin Infinite M200 Pro -mikrolevylukijalla (Tecan, Grödig, Itävalta) viritys- ja emissioaallonpituuksilla 500 nm ja emissioaallonpituuksilla 580 nm. Tuloksena saatu DHE-fluoresenssi, joka saatiin pelkällä SAL- tai Gluoxidical-prosentilla Kuvaavia fluoresenssimikrovalokuvia DHE-värjätyistä soluista saatiin DHE-mittauksen jälkeen mikrolevylukijalla.

Cistanche-kasvilla on erittäin hyvä hermostoa suojaava vaikutus

4.9. Kaspaasi-3/7-aktiivisuuden mittaaminen

Yksivaiheiset kaspaasi-3/7-määritykset suoritettiin aiemmin julkaistun menettelyn mukaisesti [84]. SAL-induktiolle ja Glu-induktiolle altistetuissa viljelmissä reaktioseoksia (kaspaasi-3,7-puskuri ja soluja sisältävät komponentit 96-monikuoppalevyillä) inkuboitiin 2 tuntia ja 3 tuntia 37 oC:ssa, vastaavasti. Kaspaasi-3/7-aktiivisuus mitattiin sitten Infinite M200 Pro -mikrolevylukijalla (Tecan, Itävalta) 346 ja 438 nm:n viritys- ja emissioaallonpituuksilla, vastaavasti.

4.10. Tilastollinen analyysi

Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja toistettiin kolmesta viiteen (n {0}}-5) itsenäiseen päivään. Kaikki tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM. Kaikkien mitattujen muuttujien arvot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SEM, jotka laskettiin käyttämällä Prism 8.4.3:a (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA), jota käytettiin myös lukujen luomiseen. Tilastollinen analyysi suoritettiin PAST (ver. 1.97) -ohjelmistopaketilla [85]. Erilaistumiskokeessa käytettiin Studentin t-testiä. Loput kokeet arvioitiin ei-parametrisella Kruskal-Wallis-testillä Mann-Whitneyn post hoc -testillä peräkkäisellä Bonferroni-korjauksella. Arvoa p < 0,05="" pidettiin="">

Lisämateriaalit: Alkuperäiset kuvat ovat saatavilla verkossa.

Tekijän panokset: Kirjoittajien panokset olivat seuraavat: Tutkimus, metodologia, validointi, data-analyysi, GG, CWD ja JG; kirjoittaminen – alkuperäisen luonnoksen valmistelu GG, CWD ja MS; tietojen kuratointi, rahoituksen hankinta, valvonta, kirjoittaminen – arvostelu ja editointi, CWD, MS ja PK Kaikki kirjoittajat ovat lukeneet käsikirjoituksen julkaistun version ja hyväksyneet sen.

Rahoitus: Tätä työtä tuettiin osittain taloudellisesti Tšekin tasavallan Olomoucissa sijaitsevan Palackyn yliopiston sisäisen apurahatoimiston (IGA{{0}}PrF_2020_021) ja Tšekin apurahatoimiston ({{) 2}}S) ja Euroopan aluekehitysrahasto – Project ENOCH (nro CZ.02.1.01/0.0/0.0/ 16_019/ 0000868) ja opiskelija-apuraha Palacky Universityn Endowment Fundilta.

Institutionaalisen arviointilautakunnan lausunto: Ei sovelleta.

Ilmoitettu suostumus: Ei sovelleta.

Tietojen saatavuusilmoitus: Tiedot sisältyvät artikkeliin tai lisämateriaaliin.

Kiitokset: Tekijät kiittävät Dita Jordovdia, Jana Hrubešovdia ja Lucie Koplikovdia erinomaisesta teknisestä avusta. Lisäksi kirjoittajat kiittävät Sees-editing Ltd.:tä, Iso-Britanniaa käsikirjoituksen englanninkielisestä toimituksesta.

Eturistiriidat: Kirjoittajat ilmoittavat, että ne eivät ole eturistiriitoja.

Näytteiden saatavuus: Näytteitä yhdisteistä ei ole saatavilla kirjoittajilta.