OSA 2 Fenyylietanoidiglykosidien eristäminen ja tunnistaminen Aloysia Polystachyasta ja sen toiminta monoamiinioksidaasin estäjinä

Mikä on syy siihen, miksi Cistanche Actosides voi estää entsyymiaktiivisuutta?

Cistanchen antioksidanttivaikutuksen periaate

Lisätietoja saat ottamalla yhteyttä:joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticolalla on monia vaikutuksia, napsauta tästä saadaksesi lisätietoja

Ainesosien erottaminen ja tunnistaminen ultra-suorituskykyisellä nestekromatografia-massaspektrometrialla

Kromatografiset analyysit suoritettiin käyttämällä Waters Acquity UPLC H-Class -järjestelmää, joka oli varustettu diodirividetektorilla (DAD) ja Waters Xevo TQ-S tandemkvadrupolimassaspektrometrillä, jossa Z-suihkulähde toimii negatiivisessa ionitilassa. Kantaliuokset, jotka sisältävät 1.0mg/ml uutetta tai standardejaakteosidi, isoakteosidi, 6'-asetyylilakteosidija 4',4''',5,5''-tetrahydroksi-6,6'',3'''-trimetoksi-[C7-O-C7'']-biflavonin LC-luokan metanolissa valmistettiin erikseen, sonikoitiin 30minuuttia tarvittaessa ja suodatettiin 0.45 μm Millipore-suodattimien läpi (Merck Millipore). Liuokset laimennettiin pitoisuuteen 10µg/ml metanolilla ja alikvootit (5 µL) injektoitiin Sigma-Aldrich Ascentis Express C18 -kolonniin (1{{30}}0 × 4,6 mm id; 2,7 µm hiukkaskoko). Liikkuva faasi koostui vedestä, joka sisälsi 0,1 % muurahaishappoa (liuotin A) ja metanolia, joka sisälsi 0,1 % muurahaishappoa (liuotin B), jota toimitettiin virtausnopeudella 0,5 ml/min eluointiprofiilin mukaan: isokraattinen, 3 % B välillä 0 - 4 minuuttia, jota seurasi lineaariset gradientit 3 prosentista 60 prosenttiin B välillä 4 ja 19 minuuttia ja 60 prosentista 90 prosenttiin B välillä 19 ja 23 minuuttia, ja lopulta palasi 3 prosenttiin B välillä 23 ja 28 minuuttia. Poistovirtaa tarkkailtiin DAD:lla alueella 210 - 720 nm ja MS:llä optimoiduilla lähteillä ja toimintaparametreilla seuraavasti: kapillaarijännite 2,50 kV, Z-suihkulähteen lämpötila 150 astetta, desolvataatiolämpötila (N2) 350 astetta, desolvatointikaasun virtaus 600 l/h ja massaalue m/z 150 - 600 täydessä skannaustilassa.

Tunnistettujen aineosien puhdistus

Raaka hydroetanoliuute (10 g) liuotettiin veteen: etanoliin (50:50; tilavuus/tilavuus) ja jaettiin peräkkäin heksaania, etyyliasetaattia ja n-butanolia vastaan. Butanolifraktio väkevöitiin pyöröhaihduttimella ja 3 g:n näyte fraktioidusta uutteesta laitettiin lasikolonniin (10 × 3 cm od), joka oli täytetty C-18 RP -silikageelillä (230-400 mesh; Sigma). -Aldrich) ja eluoitiin vedellä, mitä seurasi peräkkäiset seokset vesi:metanoli (90:10, 50:50 ja 10:90; v/v). Alafraktio, joka saatiin eluoimalla vedellä: metanolilla (90:10; tilavuus/tilavuus) puhdistettiin edelleen RP-HPLC:llä käyttäen Shimadzu LC-20AP-järjestelmää, joka oli kytketty SPD-20A UV/Vis-detektoriin. ja varustettu Phenomenex Luna® C-18 -kolonnilla (sisähalkaisija 250 × 10 mm; hiukkaskoko 5 μm). Liikkuva faasi oli vesi: metanoli, joka alkoi suhteesta 90:10 (v/v) ja muuttui suhteeksi 30:70 (v/v) 100 minuutissa, jolloin saatiin neljä tunnettua yhdistettäakteosidi(750 mg), eristetty puoli (430 mg), 6'-asetyylilakteosidi(42 mg) ja 4',4''',5,5''-tetrahydroksi-6,6'',3'''-trimetoksi-[C7-O-C7'']-biflavonin ( 13 mg). Liikkuvan faasin virtausnopeus oli 1 ml/min, injektiotilavuus 500 µl, kromatogrammi tallennettiin aallonpituudella 340 nm ja UV-spektrit saatiin alueella 240-400 nm. Puhdistettujen ainesosien identiteetit varmistettiin niiden 1H- (500 MHz) ja 13C-NMR (125 MHz) spektreistä, jotka on tallennettu Bruker model DPX 500 spektrometrillä, sekä tietojen vertailusta kirjallisuudesta saataviin [18, 19, 41]. Eristettyjen yhdisteiden puhtaudet varmistettiin UPLC-DAD-MS:llä (▶Kuva. 1b–d) ja NMR (▶Kuva. S1–S12, Tuki informaatio).

Määrällinen määritysakteosidiHPLC-diodirividetektorilla

Näyte (1 mg) kuivatusta hydroetanoliuutteesta liuotettiin uudelleen 1 ml:aan metanolin (JT Baker HPLC-laatu) ja Milli-Q:n seosta (80:20; tilavuus/tilavuus). Ultrapuhdas vesi (Merck Millipore), sonikoitu 30 minuuttia ja suodatettu 0.45-μm Millipore-suodattimen läpi. Tämän liuoksen alikvootit (20 µl) analysoitiin Shimadzu LC-10APvp-järjestelmällä, joka oli kytketty SPD-M10Avp DAD:iin ja varustettu Phenomenex Luna C18 -kolonnilla (250 × 4,6 mm id, 5 µm), joka oli suojattu Phenomenilla C18-esikolonni (4,0 × 3,0 mm sisähalkaisija, 5 um). Erotukset suoritettiin huoneenlämpötilassa (22 ± 1 aste) käyttämällä liikkuvaa faasia, joka sisälsi etikkahappoa 0,1 % vedessä (liuotin A) ja metanolia (liuotin B;

JT Baker HPLC grade) toimitetaan vakiovirtausnopeudella 1.0 ml/min ohjelman mukaan: lineaarinen gradientti 10 - 70 prosenttia B välillä 0 - 32 min, 70 - 10 prosentti B välillä 32 ja 35 min ja lopullinen isokraattinen eluutio 10 prosentilla B välillä 35 ja 40 min. Havaitsemisaallonpituus asetettiin 330 nm:iin.

Sisältöakteosidiotteessa arvioitiin käyttäenakteosidi(Sigma-Aldrich; CAS-nro 61276-17-3) ulkoisena standardina. Valmistettiin liuokset, jotka sisälsivät 500, 250, 125, 62,5, 31,2 ja 15,6 ug/ml vertailustandardia, ja kalibrointikäyrät muodostettiin suorittamalla jokaiselle liuokselle HPLC-analyysi kolmena rinnakkaisena [42]. Standardin piikin pinta-alan suhdeakteosidivastaava analyytin pitoisuus määritettiin standardikäyrien lineaarisella regressiolla (▶Kuva. S13, Tuki informaatio). Analyyttiset tiedot validoitiin lineaarisuuden, tarkkuuden ja tarkkuuden suhteen Agência Nacional de Vigilância Sanitárian [42] ohjeiden mukaisesti. Havaitsemisrajat (LoD) ja kvantitointirajat (LoQ).akteosidiolivat {{0}},30 ja 0,92 µg/ml, vastaavasti.

Monoamiinioksidaasi-A:n estomääritykset

Rekombinantti ihmisen MAO-A, tyramiini, klorgyliini, vanilliinihappo, 4-aminoantipyriini ja piparjuuriperoksidaasi ostettiin Sigma-Aldrichilta. MAO-A:n estomääritykset suoritettiin käyttämällä 96-kuoppalevyjä noudattaen modifioitua versiota menetelmästä, jonka ovat kuvanneet López et ai. [43]. Kuhunkin kuoppaan ladattiin 50 μl kromogeenistä liuosta (0,8 mM vanilliinihappoa, 2,5 mM 4-aminoantipyriiniä ja 4 U/ml piparjuuriperoksidaasia fosfaattipuskurissa pH:ssa 7,6), 100 µl 3:a. mM tyramiinia ja 50-μl:n alikvootti raa'asta hydroetanoliuutteesta tai jostakin puhdistetuista fenyylietanoleista liuotettuna metanoliin. Lopuksi kuhunkin kuoppaan lisättiin 50 µl:n alikvootit 8 U/ml MAO-A:ta ja levyä inkuboitiin 37 asteessa 30 minuuttia, jona aikana absorbanssit rekisteröitiin 5 minuutin välein mikrolevylukijalla. Klorgyliini (suurempi tai yhtä suuri kuin 97 prosenttia GC:tä; Sigma-Aldrich) ja metanoli sisällytettiin positiivisina ja negatiivisina kontrolleina, vastaavasti, jokaiselle määrityslevylle.

Tilastollinen analyysi

MAO-A:ta inhiboivista aktiivisuuksista suoritettiin kolme riippumatonta arviointia ja saadut tiedot analysoitiin Graph-Pad Prism -ohjelmistolla. IC₅₀hydroetanoliuutteen, puhdistettujen fenyylietanoidien ja positiivisen kontrollin arvot laskettiin epälineaarisella regressiolla, simuloimalla logaritmia (inhibiittorikonsentraatio) verrattuna normalisoituun prosenttiosuuteen.

Tuki informaatio

H- ja13C-NMR-spektritakteosidi, isoakteosidi, 6'-asetyylilakteosidi ja 4,4,5,5-tetrahydroksi-6,6,3-trimetoksi-[C7–O–C7'']-biflavonin ja HSQC/HMBC-korrelaatioanalyysit kolme fenyylietanolia ovat saatavilla tukitietoina.

Viitteet

[1] Maailman terveysjärjestö. Masennus ja muu yleinen mielenterveys

Häiriöt: maailmanlaajuiset terveysarviot. Geneve: WHO; 2017

[2] Ferguson JM. SSRI-masennuslääkkeet: haittavaikutukset ja siedettävyys. Prim Care Companion J Clin Psychiatry 2001; 3: 22–27

[3] van der Watt G, Laugharne J, Janca A. Täydentävä ja vaihtoehtoinen lääketiede ahdistuksen ja masennuksen hoidossa. Curr Opin Psychiatry 2008; 21: 37–42

[4] Sarris J, McIntyre E, Camfield DA. Kasvipohjaiset lääkkeet ahdistuneisuushäiriöihin, osa 1: Katsaus prekliinisistä tutkimuksista. CNS Drugs 2013; 27: 207–219

[5] Sarris J, McIntyre E, Camfield DA. Kasvipohjaiset lääkkeet ahdistuneisuushäiriöiden hoitoon, osa 2: Katsaus kliinisistä tutkimuksista ja niitä tukevista prekliinisistä todisteista. CNS Drugs 2013; 27: 301-319

[6] Del Vitto LA, Petenatti EM, Petenatti ME. Recursos herbolarios de San Luis (Argentiinan tasavalta). Ensimmäinen osa: Plantas Nativas. Multequina 1997; 6: 49–66

[7] González Y, Arrúa RD, Rojas GD, García MG. Etnofarmacobotánica foliar de "burrito",Aloysia polystachya (Griseb.) Moldenke (Verbenaceae), cultivado en Paraguay. Rojasiana 2014; 13: 31–41

[8] Mora S, Díaz-Véliz G, Millán R, Lungenstrass H, Quirós S, Coto-Morales T, Hellión-Ibarrola MC. Vesialkoholiuutteen anksiolyyttiset ja masennuslääkettä muistuttavat vaikutuksetAloysia polystachyarotissa. Pharmacol Biochem Behav 2005; 82: 373-378

[9] Hellión-Ibarrola MC, Ibarrola DA, Montalbetti Y, Kennedy ML, Heinichen O, Campuzano M, Tortoriello J, Fernández S, Wasowski C, Marder M, De Lima TCM, Mora S. Anksiolyyttiset vaikutuksetAloysiapolystachya(Griseb.) Moldenke (Verbenaceae) hiirissä. J Ethnopharmacol-col 2006; 105: 400–408

[10] Hellión-Ibarrola MC, Ibarrola DA, Montalbetti Y, Kennedy ML, Heinichen O, Campuzano M, Ferro EA, Alvarenga N, Tortoriello J,

De Lima TCM, Mora S. Masennuslääkkeen kaltaiset vaikutuksetAloysiapolystachya(Griseb.) Moldenke (Verbenaceae) hiirissä. Phytomedicine 2008; 15: 478–483

[11] Herraiz T, González D, Ancín-Azpilicueta C, Arán VJ, Guillén H.

- Karboliinialkaloidit Peganum harmalassa ja ihmisen monoamiinioksidaasin (MAO) esto. Food Chem Toxicol 2010; 48: 839-845

[12] Herraiz T, Guillén H, Arán VJ, Salgado A. Kinatsoliinialkaloidien tunnistaminen, esiintyminen ja aktiivisuus Peganum harmalassa. Food Chem Toxicol 2017; 103: 261-269

[13] Herraiz T, Guillén H. Monoamiinioksidaasi-A:n esto ja siihen liittyvä antioksidanttiaktiivisuus kasviuutteissa, joilla on potentiaalisia masennuslääkkeitä. Bio-Med Res Int 2018; 1018: 4810394

[14] Carrador S, D'Ascenzio M, Chimenti P, Secci D, Bolasco A. Selektiiviset MAO-B:n estäjät: oppitunti luonnontuotteista. Mol Divers 2014; 18: 219–243

[15] Fajemiroye JO, Silva DM, Oliveira DR, Costa EA. Ahdistuneisuuden ja masennuksen hoito: Lääkekasveja jälkikäteen. Fundam Clin Pharmacol 2016; 30: 198–215

[16] Fišar Z. Lääkkeet liittyvät monoamiinioksidaasin aktiivisuuteen. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry 2016; 69: 112–124

[17] Naoi M, Maruyama W, Shamoto-Nagai M. Tyypin A monoamiinioksidaasi ja serotoniini ovat koordinoidusti mukana masennushäiriöissä: välittäjäaineiden epätasapainosta heikentyneeseen neurogeneesiin. J Neural Transm 2017; 125: 53–66