Osa 2 Cistanches Herban kemiallinen ja geneettinen syrjintä UPLC-QTOF/MS:n ja DNA-viivakoodauksen perusteella
Mar 03, 2022
Yhteystiedot: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Sähköposti:audrey.hu@wecistanche.com
OPLS-DA ja markkerin tunnistaminen Mahdollisten kemiallisten merkkiaineiden tunnistamiseksi näiden kahden lajin erottamiseksi luotiin OPLS-DA:n S-kuvaaja (kuva 3). S-kaaviossa jokainen piste edustaa yhtä tR–m/z-ioniparia. X- ja Y-akselit edustavat vastaavasti ionin panosta ja luottamusta; mitä kauempana ioni tR–m/z-pari osoittaa nollasta, sitä suurempi vaikutus/luottamus tällä kuvakkeella on näiden kahden ryhmän väliseen eroon. Siten tR-m/z-ioni, joka osoittaa 'S':n kahteen päähän, edustaa ominaismarkkereita, joilla on suurin luottamus kussakin ryhmässä. OPLS-DA-tulokset osoittivat, että UPLC-QTOF/MS:ää voitiin käyttää erottamiseenCistanche deserticolaalkaenCistanche tubulosa(Kuva 3). Näiden ryhmien syrjinnän helpottamiseksi määritettiin yhteensä kuusi uskottavaa ja merkittävää merkkiä (taulukko 3). Kolmen mahdollisen markkerin identiteetit määritettiin alustavasti. Näiden kolmen ionin kanssa korreloivat komponentit tunnistettiin alustavasti kampneosidi II:n, cistanosidi C:n ja cistanosidi A:n isomeereiksi. Merkkiyhdisteitä a, b ja c voidaan käyttää näiden kahden kasvilajin erottamiseen, koska a:n ja b:n ioni-intensiteetitCistanche deserticolaoli korkeampi kuin vuonnaCistanche tubulosa(Kuvat 4A, 4B) ja merkki c voitiin havaitaCistanche tubulosa, mutta ei sisälläCistanche deserticola(Kuvio 4C).
DNA-viivakoodaus: sekvenssitiedot ja tunnistustehokkuus
Sekvenssitiedot on esitetty taulukossa 4. PsbA-trnH:n (0.1732) keskimääräinen geneettinen etäisyys oli suurempi kuin kaksi muuta aluetta (0.0740 , 0,1197) merkittävästi. PsbA-trnH:n keskimääräinen GC-pitoisuus (20,64 prosenttia) oli pienempi kuin kahdella muulla alueella (55.00 prosenttia, 55.00 prosenttia). Vaikka ITS:n ja ITS2:n onnistumisprosenttia ei saatu tässä tutkimuksessa, psbA-trnH-alue suoriutui hyvin PCR-monistuksessa ja sekvensoinnissa (100 prosenttia, 87,23 prosenttia). Tunnistustehokkuus saavutettiin BLAST1-analyysillä ja lähimmän etäisyyden menetelmällä, ja se heijasti pääasiassa viivakoodien onnistumisastetta. psbA-trnH-alue oli selvästi korkeampi kuin kaksi muuta viivakoodia tunnistustehokkuudessa kahdella menetelmällä. Sekvenssien puute on todennäköisimmin syynä siihen, että ITS-alue osoitti 100 prosentin tunnistustehokkuutta BLAST1-menetelmällä ja 0 lähimmän etäisyyden menetelmällä.
Geneettisen eron analyysi kuudella parametrilla
Kuuden parametrin avulla analysoitiin spesifistä vaihtelua ja lajien välistä eroa kolmella viivakoodilla (taulukko 5). Merkittävä ero spesifisten ja spesifisten variaatioiden välillä oli osoitus DNA-viivakoodien hyödyllisyydestä. Tässä kolmen viivakoodin pienin lajien välinen etäisyys oli korkeampi kuin lajinsisäinen enimmäisetäisyys. Lisäksi psbA-trnH-alueella oli suurempi enimmäissisäinen etäisyys ja keskimääräinen lajien välinen etäisyys kuin kahdella muulla viivakoodilla, mikä osoitti, että psbA-trnH-alue suoriutui hyvin Cistanches Herban kahden alkuperän erottamisessa.
Viivakoodiaukon analyysi tunnistamiseksi
Cistanche deserticolajaCistanche tubulosaViivakoodirako esittelee lajien välisten ja sisäisten lajien huomattavan vaihtelun ja osoittaa erilliset, ei-päällekkäiset jakaumat sisäisten ja lajien välisten näytteiden välillä. Tässä tutkimuksessa (kuva 5) etäisyysalueeksi asetettiin 0–0,45, koska psbA-trnH:n suurin K2P-etäisyysCistanche deserticolajaCistanche tubulosaoli lähellä 0.45. Kolmessa viivakoodissa oli selviä aukkoja spesifisten ja spesifisten vaihteluiden jakaumissa. Lisäksi psbA-trnH:n aukko oli huomattavasti suurempi kuin kaksi muuta viivakoodia. Siksi psbA-trnH-alue voisi olla ihanteellinen viivakoodi kahden alkuperän erottamiseenCistanchesHerba.
Neighbor-joining (NJ) puu
NJ-puu havainnollistaa lajien välistä suhdetta ja helpottaa niiden klusteroinnin määrittämistä. Tässä tutkimuksessa rakennettiin kolmen viivakoodin NJ-puu K2P-mallin perusteella (kuva 6). Tulokset osoittivat, että kaksi Cistanches Herban alkuperää ryhmittyi kahdeksi kladiksi erikseen. Näin ollen NJ-puu erotti selvästi toisistaanCistanche deserticolajaCistanche tubulosa.
Keskustelu ja johtopäätökset
Cistanches Herba on tärkeä lääkeaine, jota käytetään yleisesti aasialaisen yhteisön ravitsemiseen [38]. Kuitenkin kaksi alkuperääCistanchesHerba, Cistanche deserticolajaCistanche tubulosa, joilla on erilaiset kemialliset koostumukset ja vastaavasti farmakologiset aktiivisuudet. Samanaikaisesti nämä kaksi alkuperää eroavat kliinisen sovelluksen ja hyödykemarkkinoiden osalta. Cistanchen luokitus on hämmentynyt ja massiiviset korvikkeet ja hajotusaineet tulvii markkinoille Cistanches Herban resurssien ja erityisen kasvuympäristön vuoksi. Cistanche-sukuun hyväksytään neljä lajia ja yksi muunnelma:Cistanche deserticola, Cistanche tubulosa, Cistanche sinensis, Cistanche salsaa, jaCistanchesalsaavar. albiflora [39]. Japanilaiset tutkijat pitivät alkuperääCistanchesHerba asCistanche salsaa[40–43], kun taas se tunnistettiinCistanche deserticolakirjoittanut Tu [44–46]. Siksi se on hämmentynyt Cistanchen luokituksessa, ja Cistanches Herban kahta alkuperää on vaikea erottaa toisistaan. Perinteisiä Cistanches Herban laadunvalvontamenetelmiä ovat morfologinen tunnistus [47,48], mikroskooppinen tunnistus [49] ja TLC (ohutkerroskromatografia) [50,51], FTIR (Fourier Transform Infrared Spectroscopy) [14], HPLC (High). Performance Liquid Chromatography) [52,53]. Morfologisella ja mikroskooppisella menetelmällä voidaan helposti erottaa lajit eri suvuista tai perheistä, joilla on suuria eroja morfologisissa ja mikroskooppisissa ominaisuuksissa, kun taas sisaruslajeja on vaikea erottaa. TLC ja FTIR voivat selvästi erottaa lajit, joilla on erilaisia kemiallisia koostumuksia, kun taas kemiallisen komponentin ja sisällön määrittäminen on vaikeaa. HPLC:tä käytetään pääasiassa erilaisten kemiallisten alkuaineiden pitoisuuksien erottamiseen, kuitenkin analyysiaika on pidempi ja herkkyys suhteellisen alhaisempi verrattuna UPLC:hen. Vastaavasti UPLC-QTOF/MS-teknologia oli nopeampi ja tarkempi kemiallisen koostumuksen määrittämisessä kuin muut kemialliset menetelmät. Molekyylitunnistusmenetelmät osoittavat hyvin geneettiseen vaihteluun perustuvaa erottelua, kuten SDS-PAGE (natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi) [54], AFLP (amplified Fragment Length Polymorphism) [55,56]. Näitä molekyylimenetelmiä ei kuitenkaan ole helppo käyttää, eivätkä ne ole universaaleja. Vastaavasti DNA-viivakoodaus voisi erottaa lajit yleisemmin, nopeammin ja tarkemmin kuin muut molekyylimenetelmät. Saman sukuun ja läheiseen geneettiseen sukulaisuuteen kuuluvien lajien osalta nämä menetelmät eivät yksinään välttämättä toimi hyvin tunnistamisessa.
Tässä yhdistimme UPLC-QTOF/MS- ja DNA-viivakoodauksen tunnistamisessaCistanche deserticolajaCistanche tubulosaja arvioivat kemialliset ja molekyylimarkkerit, jotka mahdollistaisivat niiden syrjinnän. 23 hyväksyttyä massahuippua havaittiin ja 16 tunnistettiin käyttämällä UPLC-QTOF/MS-menetelmää, ja ensin havaittiin kolmen mahdollisen markkeriyhdisteen helpottavan kahden alkuperän erottamista PCA- ja OPLS-DA-analyysillä. Lisäksi DNA-viivakoodaustekniikalla arvioitiin neljä indikaattoria niiden kyvyn perusteella erottaa kaksi alkuperää: tunnistustehokkuus, geneettinen tehokkuus, viivakoodausaukko ja NJ-puuanalyysi. psbA-trnH-aluetta tuettiin sopivana DNA-viivakoodina erottamiseenCistanche deserticolajaCistanche tubulosa. Lopuksi loimme ensin uuden molekyyli- ja kemialliseen analyysiin yhdistetyn menetelmän erotteluun ja laadunvalvontaan Cistanches Herban kahdessa alkuperässä. DNA-viivakoodaus voi erottaa kaksi alkuperää geneettisessä variaatiossa ja tunnistaa lajit yleisesti ja tarkasti; UPLC-QTOF/MS-teknologia pystyy analysoimaan kemiallisen koostumuksen ja arvioimaan lääkemateriaalien laadun nopeasti ja tarkasti. Yhdistetty DNA-viivakoodausmenetelmä ja UPLC-QTOF/MS-teknologia takaavat lääkemateriaalien tunnistamisen useista lähteistä tarkemmin ja tieteellisemmin ja voivat toimia menetelmänä muiden luokituksen hämmentäviä lajien tai sukujen tunnistamiseen.
Tekijän panokset
Suunnitteli ja suunnitteli kokeet: LFH SHZ LBW. Suoritti kokeet: SHZ LBW. Analysoidut tiedot: SHZ LBW. Mukana olleet reagenssit/materiaalit/analyysityökalut: LFH. Kirjoitti paperin: SHZ XJ LBW. Tarkista käsikirjoitus: ZHW.
Cistanche deserticolalla on monia vaikutuksia, napsauta tästä saadaksesi lisätietoja
Viitteet
1. Tu PF, Lou ZC, Li SC, Wang CS, Jiang WY, et ai. (1996) Vertailu munuaisten ravitsemiseen ja yangin tehokkuuden vahvistamiseen kolmella eri lajillaherbavesisäiliöt. Journal of Chinese medical materials 19: 420–421.
2. Zhang Y, Wu H, Wang SN, Zheng HC (1994) Vertailu kolmen eri lajin munuaisia ravitseviin ja yangia vahvistaviin toimintoihinherbavesisäiliöt. China Journal of Chinese Materia Medica 19: 169–171.
3. Lei L, Song ZH, Tu PF (2003) Edistyminen kemiallisten ainesosien tutkimuksessa kasveissaCistancheHuijaa. et Link. Chinese Traditional and Herbal Drugs 34: 473-476.
4. Yoshikawa M, Matsuda H, Morikawa T, Xie H, Nakamura S, et ai. (2006) Fenyylietanoliaminoglykosidit ja asyloidut oligosokerit, joilla on verisuonia relaksoivaa vaikutustaCistanchetubulosa. Bioorg Med Chem 14: 7468-7475.
5. Shimoda H, Tanaka J, Takahara Y, Takemoto K, Shan SJ, et ai. (2009) Hypokolesteroleemiset vaikutuksetCistanchetubulosauutetta, perinteistä kiinalaista raakalääkettä, hiirissä. Am J Chin Med 37: 1125-1138.
6. Yamada P, Iijima R, Han J, Shigemori H, Yokota S, et ai. (2010) Estovaikutus akteosidin eristettyCistanchetubulosakemiallisen välittäjän vapautumiseen ja RBL-2H3- ja KU812-solujen tulehdukselliseen sytokiinituotantoon. Planta Med, 1512–1518.
7. Morikawa T, Pan Y, Ninomiya K, Imura K, Matsuda H, et ai. (2010) Asyloidut fenyylietanoidiaminoglykosidit, joilla on hepatosuojaavaa vaikutusta aavikkokasvistaCistanchetubulosa. Bioorg Med Chem 18: 1882-1890.
8. Morikawa T, Pan Y, Ninomiya K, Imura K, Yuan D, et ai. (2010) Iridoidiset ja asykliset monoterpeeniglykosidit, kankanosidit L, M, N, O ja P alkaenCistanchetubulosa. Chem Pharm Bull (Tokio) 58: 1403–1407.
9. Hän YP, Yin ZZ, Tu PF, Lou ZC (1997) Herba cistanchen kaupallisen raakalääkkeen tunnistaminen ja tutkimus. Journal of Chinese medical materials 20: 117–122.
10. Zhu SY (2001) Farmakognostinen tunnistusCistanchetubulosahämmentynyt lajiCistanchedeserticola. Journal of Chinese medical materials 24: 24–25.
11. Xu XQ, Ni H, Wei HY, Jia XG, Zhang BG, et ai. (2013) Kolmen mikroskooppinen tunnistaminenherbavesisäiliötXin Jiangissa. Shizhen Medicine and Materia Research 24: 881–883.
12. Zhang M, Fu XL, Wang SY (2004) Kaupallisten tuotteiden mikroskooppinen tunnistaminenHerbaCistanchesdigitaalisella kuvantamistekniikalla. Journal of Chinese medical materials 27: 400–402.
13. Li JS, Yao ZQ, Yu MX (2000) Tutkimus:herbavesisäiliötja aviorikoksesta. Shizhen Medicine and Materia Research 11: 317–318.
14. Xu R, Sun SQ, Liu YG, Chen J, Liu TN, et ai. (2010) FTIR- ja 2D-IR-spektroskooppiset tutkimukset eri lähteistäherbavesisäiliöt. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi 30: 897–900.
15. Chen J, Sun SQ, Xu R, Liu YG, Yu J, et ai. (2009) TunnistusCistanchedeserticolaBoschniakla rossicasta ja Cynomorium solariumista käyttäen FTIR:tä ja kaksiulotteista korrelaatio-IR-spektroskopiaa. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi 29: 1502–1507.
16. Yang HC, Xia PX, Huang JX, Yuan HZ (2008) Tutkimus HPLC-sormenjäljestäCistanchedeserticola. Pharm Care & Res 8: 255–257.
17. Xie JN, Zhao MB, Wu FW, Tu PF (2005) Kromatografinen sormenjälkiCistanchedeserticolaHPLC:llä. Kiinan perinteiset ja yrttilääkkeet 36: 268–271.
18. Han JP, Song JY, Liu C, Chen J, Qian J, et ai. (2010) TunnistusCistanchelajit (Orobanchaceae), jotka perustuvat plastidin psbA-trnH intergeenisen alueen sekvensseihin. Acta Pharmaceutica Sinica 45: 126–130.
19. Shi HM, Wang J, Wang MY, Tu PF, Li XB (2009) Identification ofCistancheLajit kemiallisen ja inter-yksinkertaisen sekvenssin toistosormenjälkien mukaan. Biol. Pharm. Bull., 32: 142–146.
20. Han LF, Yiadom MB, Liu EW, Zhang Y, Li W, et ai. (2012) Fenyylietanoidiglykosidien rakenteellinen karakterisointi ja tunnistaminenCistanchesdeserticolaYC MaUHPLC/ESI-QTOF-MS/MS. Fytokemiallinen analyysi 23: 668-676.
21. Jiang X, Huang LF, Wu LB, Wang ZH, Chen SL (2012) UPLC-QTOF/MS Analysis of Alkaloids in Traditional Processed Coptis chinensis Franch. Evid-pohjainen täydennysvaihtoehto Alternative Med 2012: 942384.
22. Wu LB, Jiang X, Huang LF, Chen SL (2013) Prosessointiteknologian tutkimus Loquat (Eriobotrya japonica) Leaf ultra-Performance Liquid Chromatography - Quadrupole Time-of-Flight massaspektrometria yhdistettynä Chemometrics. PLoS ONE 8: e64178.
23. Hebert PD, Ratnasingham S, Waard JR (2003) Viivakoodaus eläinten elämää: sytokromi c oksidaasin alayksikön 1 eroja läheisesti sukulaisten lajien välillä. Proc. R. Soc. Lontoo. B., 270 Suppl 1: S96–99.
24. Hebert PD, Cywinska A, Ball SL, Waard JR (2003) Biologiset tunnistukset DNA-viivakoodien avulla. Proc Biol. Sei., 270: 313:321.
25. Kress WJ, Wurdack KJ, Zimmer EA, Weigt LA, Janzen DH (2005) DNA-viivakoodien käyttö kukkivien kasvien tunnistamiseen. Proc Natl Acad Sci., 102: 8369-8374.
26. Chen S, Yao H, Han J, Liu C, Song J, et ai. (2010) ITS2-alueen validointi uudeksi DNA-viivakoodiksi lääkekasvilajien tunnistamiseen. PLoS One 5: e8613.
27. Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, et ai. (2011) MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis käyttäen maksimaalisen todennäköisyyden, evolutionaarisen etäisyyden ja maksimaalisen parsimonisuuden menetelmiä. Mol Biol Evol 28: 2731-2739.
28. Meyer CP, Paulay G (2005) DNA-viivakoodaus: virheprosentit kattavaan näytteenottoon perustuvat. PLoS Biol 3: e422.
29. Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, Fukushima S (1984) Studies on the ConstituentsCistancheHerba.IV. Kahden uuden fenyylipropanoidiglykosidin, Cistanosides C ja D, eristäminen ja rakenteet. Chem Pharm Bull 32: 3880-3885.
30. Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, Fukushima S (1985) Studies on the Constituents ofCistancheHerba. VI. Uuden iridoidiglykosidin, 6-Deoxyeatalpol, eristäminen ja rakenteet. Chem Pharm Bull 33: 3645-3650.
31. Jiang Y, Li SP, Wang YT, Chen XJ, Tu PF (2009) Differentiation ofHerbaCistanchessormenjäljellä korkean suorituskyvyn nestekromatografialla - diodirivitunnistus - massaspektrometria. Journal of Chromatography A 1216: 2156–2162.
32. Han LF, Boakye YM, Liu E, Zhang Y, Li W, et ai. (2012) Fenyylietanoidiglykosidien rakenteellinen karakterisointi ja tunnistaminenCistanches deserticola YC MaUHPLC/ESI-QTOF-MS/MS. Phytochem Anal. 23: 668-676.
33. Li L, Tsao R, Yang R, Liu CM, Young JC, et ai. (2008) Fenyylietanoidiglykosidien eristäminen ja puhdistusCistanchedeserticolanopealla vastavirtakromatografialla. Food Chemistry 108: 702-710.
34. Lu DY, Zhang JY, Yang ZY, Liu HM, Li S, et ai. (2013) Kvantitatiivinen analyysiCistanchesHerbakäyttämällä korkean suorituskyvyn nestekromatografiaa yhdistettynä diodirivitunnistukseen ja korkearesoluutioiseen massaspektrometriaan yhdistettynä kemometrisiin menetelmiin. J Sep Sci 26: 1945–1952.
35. Kobayashi H, Karasawa H, Miyase T, Fukushima S (1985) Studies on the ConstiuentsCistancheHerba. V. Kahden uuden fenyylipropanoidiglykosidin, Cistanoside E ja F. Chem Pharm Bull 33: 1452–1457, eristäminen ja rakenteet.
36. Jiang Y, Tu PF (2009) Kemiallisten ainesosien analyysiCistanchelajit. J Chromatogr A 1216:1970–1979.
37. Massart DL, Vandeginste BGM, Deming SN, Michotte Y, Kaufman L (1988) Tieteen ja teknologian tiedonkäsittely. Kemometria: oppikirja.
38. Huang LF, Zheng SH, Wu LB, Jiang X, Chen SL (2014) Ecotypes ofCistanche deserticolaperustuu kemiallisiin komponentteihin ja molekyyliominaisuuksiin. SCIENTIA SINICA Vitae 44: 318–328.
39. Tu PF, Jiang Y, Guo YH (2011) herban tutkimus- ja teollisuuskehitysvesisäiliöt. Journal of Chinese Medicine 46: 882–887.
40. Kobayashi H, Oguchi H, Takizawa, Miyase T, Ueno A, et ai. (1987) Uusia fenyylietanoidiglykosideja alkaenCistanchetubulosa(SCHRENK) Koukku. f. I. Chem Pharm Bull 35: 3309-3314.
