Osa 1: Epigenomisen ja transkriptomisen vuorovaikutuksen kartoitus muistin muodostumisen ja palauttamisen aikana hippokampusengrammiyhtyeessä

Lisätietoja:ali.ma@wecistanche.com

Pls klikkaa tästä päästäksesi osaan 2

Asaf Marco1,2,*, Hiruy S. Meharena1,2, Vishnu Dileep1,2, Ravikiran M. Raju1,4, Jose Davila- Velderrain3, Amy Zhang2, Chinnakkaruppan Adaikkan1,2, Jennie Z. Young1,2, Fan Gao1, Manolis Kellis3,5, Li-Huei Tsai1,2,5,*

1Picower Institute for Learning jaMuisti, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts, USA.

2 Department of Brain and Cognitive Sciences, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts, USA.

3 Tietojenkäsittelytieteen ja tekoälyn laboratorio, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts, USA.

4 Vastasyntyneiden lääketieteen osasto, Bostonin lastensairaala, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, USA.

5 Broad Institute of Harvard ja MIT, Cambridge, Massachusetts, USA.

NapsautaCistanche-vitamiinikauppa ja Cistanche muistiin

Abstrakti

Epigenomi ja kolmiulotteinen (3D) -genominen arkkitehtuuri ovat nousemassa avaintekijöiksi hermosolujen toimintojen edellyttämien erilaisten transkriptioohjelmien dynaamisessa säätelyssä. Tässä hyödynnämme aktiivisuudesta riippuvaa merkintäjärjestelmää hiirillä määrittääksemme engram-solujen epigeneettisen tilan, 3D-genomiarkkitehtuurin ja transkriptiomaiseman koko elinkaaren ajan.muistimuodostumista ja muistamista. Löytömme paljastavat senmuistikoodaus johtaa epigeneettiseen pohjustustapahtumaan, jolle on tunnusomaista tehostajien lisääntynyt saatavuus ilman vastaavia transkription muutoksia.Muistikonsolidoituminen johtaa myöhemmin suurten kromatiinisegmenttien ja promoottorin ja tehostajan vuorovaikutuksiin. Lopuksi, uudelleenaktivoinnin yhteydessä engram-neuronit käyttävät osajoukkoa denovo-pitkän kantaman vuorovaikutuksia, joissa pohjustetut tehostajat saatettiin kosketukseen vastaavien promoottorien kanssa geenien säätelemiseksi, jotka osallistuvat paikalliseen proteiinien translaatioon synaptisissa osastoissa. Yhdessä työmme selventää kattavaa transkriptiota ja Käyttäjät voivat tarkastella, tulostaa, kopioida ja ladata tekstiä ja dataa tällaisten asiakirjojen sisältöä akateemista tutkimusta varten, noudattaen aina täydellisiä käyttöehtoja: http://www.nature. com/authors/editorial_policies/license.html#terms

*Kirjeenvaihto: marcoa@mit.edu. lhtsai@mit.edu.

Tekijän panokset:

AM ja L.-HT suunnittelivat projektin. AM ja AZ suorittivat käyttäytymiskokeita, ISH:ta, immunovärjäystä ja MARIS-analyysiä. CA suoritti virusinjektion ja immunovärjäykset. AM ja HSM suorittivat ATAC-seq-kokeita. AM ja AZ suorittivat ydin-RNA-seq-kokeita. AM, HSM ja VD suorittivat pc-Hi-C- ja Hi-C-kokeita. AM, HSM, VD, RMR ja JDV suorittivat ATAC-seq-analyysin. AM, RMR, HSM, VD ja FG suorittivat tuman RNA-seq-analyysin. AM, VD, HSM ja RMR suorittivat pc-Hi-C- ja Hi-C-analyysin. Kaikki kirjoittajat auttoivat tulkitsemaan tietoja. AM, HSM, VD, RMR, JZY, MK ja LHT kirjoittivat käsikirjoituksen kaikilta kirjoittajilta. LHT toimitti työkalut ja valvoi projektia.

Kilpailevat kiinnostuksen kohteet:

Tekijät eivät ilmoittaneet kilpailevia etuja.

epigenominen maisema koko elinkaaren ajanmuistimuodostuminen ja muistaminen hippokampuksen engrammiyhtyeessä.

Pitkäaikaisten muistojen muodostuminen ja säilyminen riippuu koordinoidusta geeniekspressiosta ja synaptisten proteiinien synteesistä1. Nämä molekyyliprosessit toimivat tietyssä neuronipopulaatiossa, joita kutsutaan engram-soluiksi2–4. Viimeaikaiset lähestymistavat, joissa käytetään reportterien aktiivisuudesta riippuvaa ilmaisua, tarjosivat puitteet engrammikokonaisuuden5–8 tutkimiselle, mutta molekyylimekanismit, jotka hallitsevatmuistisäilytys ja haku jäävät huonosti ymmärretyksi. Erityisesti epigeneettiset modifikaatiot ja 3D-genominen arkkitehtuuri ovat nousemassa avaintekijäksi geenin ilmentymisen dynaamisessa säätelyssä9–17, ja niiden merkitys hermosolujen toiminnassa, kehityksessä ja sairauksissa arvostetaan yhä enemmän14, 16, 18

Tässä käytimme Targeted Recombination in Active Populations (TRAP) -hiirimallia5,6, jossa aktivoidut neuronit, jotka ekspressoivat Activity Regulated Cytoskeleton Associated Protein, (Arc) -geeniä, on pysyvästi merkitty indusoitavalla tavalla. Aktivoituneet neuronit aikanamuistikoodaus, konsolidointi ja palautus lajiteltiin ja alistettiin tuman RNA-sekvensoinnille (nRNA-seq), transposaasiin pääsevän kromatiinin määritykselle sekvensointia käyttäen (ATAC-seq) ja kromosomikonformaation sieppaamiseen (Hi-C). Tietomme osoittavat senmuistikoodaus johtaa genominlaajuiseen kromatiinin saatavuuden lisääntymiseen ilman odotettavissa olevia muutoksia geeniekspressiossa. Lisäksi osoitamme, että muistin konsolidoinnin myöhäinen vaihe liittyi suurten kromatiinisegmenttien (alaosastojen) uudelleensijoittamiseen inaktiivisista ympäristöistä salliviin ympäristöihin ja promoottorin ja tehostajan vuorovaikutusmaiseman uudelleenjärjestelyyn. Lopuksi hermosolujen uudelleenaktivointi aikanamuistipalauttaminen liittyy denovopromootterin ja tehostajan vuorovaikutuksiin hyödyntäen suurta osajoukkoa tehostajista, jotka esikäsiteltiin aikana.muistikoodaus. Nämä promoottori-tehostaja-vuorovaikutukset liittyvät voimakkaaseen muutokseen paikalliseen proteiinisynteesiin ja synaptiseen morfogeneesiin osallistuvien geenien ilmentymisessä.

Tulokset

Aktivoitujen ja uudelleenaktivoitujen engram-solujen ajallinen ja spatiaalinen tunnistaminen

Hermosolujen aktiivisuuden seuraaminen ajan mittaan on ollut yksi suurimmista haasteista tutkittaessa engram-soluja, koska hermosolujen aktiivisuuden markkerit, jotka tunnetaan nimellä välittömästi varhaiset geenit (IEG), palaavat lähtötasolle pian induktion jälkeen1,2. Tämän rajoituksen voittamiseksi hyödynsimme TRAP5,6-mallia, joka vaatii kaksi siirtogeeniä, joista toinen ekspressoi CreERT2:ta aktiivisuudesta riippuvaisesta kaaripromoottorista ja toinen, joka mahdollistaa keltaisen fluoresoivan proteiinin (eYFP) reportterin ilmentymisen Cre- riippuvaisella tavalla. Tamoksifeenin (TAM) antaminen TRAP-hiirille johtaa pysyvään eYFP-leimaan aktivoiduissa kaarihermosoluissa. Ilman TAM:ia CreERT2 säilyy sytoplasmassa eikä eYFP:tä ekspressoidu (laajennettu data, kuva 1a). TRAP-hiiret altistettiin klassiselle Pavlovin kontekstuaalisen pelon ehdoin (CFC) paradigmalle (kuva 1a), joka on yleisesti käytetty menetelmä vastenmielisten muistojen tutkimiseen19. Noin 1,5–2 tuntia FS-altistuksen jälkeen aivot kerättiin tunnistaakseen i) RNA:ta sitovan proteiinin fox-1 homologin 3 (Rbfox3), joka tunnetaan myös nimellä NeuN plus ja eYFP plus -merkityt neuronit, jotka aktivoituivat ensimmäisen altistuksen aikana (aktivoitu). -varhainen), joka voidaan erottaa ii) NeuN plus /eYFP- aktivoimattomista perustilan neuroneista (Basal) (kuvio 1a). Viiden päivän kuluttua, ilman hakua, keräsimme iii) NeuN plus /eYFP plus neuronit, jotka oli merkitty harjoituspäivänä, mikä tarkoittaa pitkäaikaistamuistikonsolidointi (aktivoitu-myöhään). Jonkin sisällä

eri kohortissa hiiret altistettiin uudelleen säädetylle ärsykkeelle ja myöhemmin endogeeninen ARC-proteiinin ilmentyminen määritettiin 1,5–2 tuntia uudelleenaltistuksen jälkeen. Tämä mahdollisti iv) kaksoispositiivisten NeuN plus /eYFP plus / endogeenisten Arc plus engram -neuronien tunnistamisen, jotka aktivoitiin harjoituksen aikana ja aktivoituivat uudelleen.muistipalauttaa (aktivoitu uudelleen). Vaikka DNA-rekombinaatio ei välttämättä tapahdu täysin 1,5–2 tuntia FS:n jälkeen, havaitsimme korkean yhteislokalisaation (keskimäärin 84 prosenttia) endogeenisen Arc-proteiinin ja Arc:eYFP-reportterin välillä (Extended Data Fig. 1b), joka oli myös aiempien raporttien kanssa20.

Vahvistaamuistikoodaus ja palauttaminen CFC:n aikana, jäätymiskäyttäytyminen tallennettiin harjoituksen aikana ja uudelleen altistuminen pelkoa aiheuttaville vihjeille (laajennetut tiedot, kuva 1c). Aiempien julkaisujen6,20 mukaisesti tietomme osoittivat merkittävän kasvun eYFP plus (aktivoitu varhainen ja myöhäinen) neuronien määrä hippokampuksessa verrattuna hiiriin, jotka pysyivät naiivina CFC:lle kotihäkissään (F (2, 70)=240.3, s<0.0001, fig.="" 1b).="" activity-dependent="" tagging="" was="" also="" negligible="" (~1%)="" in="" the="" absence="" of="" tam="" induction="" (fig.="" 1c,="" extended="" data="" fig.="" 1d).="" with="" tamoxifen="" treatment,="" we="" observed="" a="" wide="" distribution="" of="" activity-labeled="" populations="" across="" all="" hippocampal="" sub-regions,="" where="" early="" activation="" was="" predominantly="" observed="" in="" the="" dg="" and="" late="" tagging="" was="" most="" abundant="" in="" the="" ca1="" (fig.="" 1d).="" to="" further="" interrogate="" the="" specificity="" of="" engram="" formation,="" we="" subjected="" trap="" mice="" to="" cfc="" learning="" in="" context="" a="" and="" then="" exposed="" them="" 5="" days="" later="" to="" the="" same="" context="" (a-a)="" or="" a="" novel="" neutral="" context="" b="" (a-b)="" (fig.="" 1e,="" extended="" data="" fig.="" 1e).="" we="" found="" comparable="" numbers="" of="" activated="" –late="" neurons="" in="" both="" groups="" (p="0.9)" and="" significantly="" fewer="" reactivated="" neurons="" in="" the="" a-b="" group=""><0.0001, fig.="" 1f;="" extended="" data="" fig.="" 1f),="" confirming="" that="" the="" reactivated="" cells="" play="" a="" key="" role="" in="" encoding="" prior="">

Muistin muodostuminen liittyy lisääntyneeseen kromatiinin saatavuuteen, pääasiassa tehostajiin

Ymmärtääksemme paremmin eri transkriptio-ohjelmia ohjaavia molekyylivoimia, mittasimme genominlaajuisia muutoksia kromatiinin saavutettavuudessa eri vaiheissa.muisti. Hippokampuksen kudokset yhdistettiin ja eristetyille ytimille (laajennettu data kuva 2a, täydentävä taulukko 1) alistettiin ATAC-seq-kirjaston valmistelu. DAR-analyysi (Diffbind, DESeq2-moodi) kaikkien populaatioiden välillä (kuva 2a) paljasti, että useimmat kromatiinitilan muutokset tapahtuvat muistin muodostumisen varhaisessa vaiheessa, jolloin 7,862 aluetta genomissa vahvistuu. saavutettavuus (Perus vs. Early, täydentävä taulukko 2). Sitä vastoin havaitsimme suhteellisen minimaalisia muutoksia kromatiinin tilassa siirryttäessä aktivoidusta varhain aktivoituun myöhäiseen (582 DAR:ta) ja aktivoitujen myöhään ja uudelleen aktivoituneiden hermosolujen välillä (725 DAR:a), ja niiden välillä oli 48 prosentin päällekkäisyys (laajennettu data, kuva 2b). ). Huomattavaa on, että tunnistimme suuren prosenttiosuuden (52 prosenttia) vakaasti saavutetuista DAR:eista, jotka tulivat helpommin saavutettaviksi aktivoitu-varhaisessa vaiheessa ja pysyivät saavutettavissa sekä aktivoiduissa myöhään että uudelleen aktivoiduissa neuroneissa (kuvat 2b, c; täydentävä taulukko 2). Mielenkiintoista on, että vaikka sekä varhaiset muutokset (perus vs. Early) että stabiilisti saadut DAR:t rikastuivat geenien välisten alueiden suhteen, myöhäiset kromatiinimuutokset (varhainen vs. myöhäinen ja myöhäinen vs. uudelleen aktivoitu) rikastuivat enimmäkseen promoottoripaikoilla (kuvio 2d).

Toiminnallinen näkemys saatiin arvioimalla, kuinka DAR:t ovat merkitty erilaisilla histonimuunnoksilla. Käytimme ensin ChromHMM:ää kromatiinin tilamallin luomiseen kahdesta riippumattomasta tutkimuksesta, joissa käytettiin massahippokampuksen kudosta ennen jalkojen shokkia ja sen jälkeen 21,22. Seuraavaksi suoritimme DAR-arvojen kerta-rikastusanalyysin (havaittiin odotetun jakauman yli) näille eri tiloille ja paljastimme, että varhaiset kromatiinimuutokset ja vakaat DAR:t rikastuivat tehostajamerkkien suhteen (kuva 2e; laajennetut tiedot, kuva 2c, täydentävä taulukko 3). .

Nämä tulokset ovat linjassa aikaisempien julkaisujen kanssa, jotka osoittavat, että primaarisen hermosoluviljelmän stimulointi indusoi pitkittynyttä tehostajaaktiivisuutta12,23. Seuraavaksi analysoimme yksittäisten stabiilien lokusten päällekkäisyyttä H3K4me1:n ja H3K27ac21:n kanssa. Nämä kaksi histonimerkkiä rajaavat eri tehostajapopulaatioita, jotka voivat olla joko 'primed' (vain H3K4me1), 'aktiivisia' (H3K4me1 ja H3K27ac) tai 'latentteja' (ei merkkejä)18. Stabiilit piikit osoittivat jakautumista sekä pohjustettujen että aktiivisten tehostajien välillä (laajennettu data, kuva 2d), jossa 47 prosentin näistä kohdista ennustettiin olevan "latentteja" (ei päällekkäisyyttä DAR:ien ja histonimerkkien21 välillä, jotka saatiin 1 tunti FS:n jälkeen). Mallimme vahvistamiseksi suoritimme kromatiini-immunosaostuksen (ChIP) H3K4me1- ja H3K27ac-histonimarkkereille, mitä seurasi qPCR. Neljä valittua paikkaa valittiin oletetusta tehostajamallinnusanalyysistämme (Extended Data Fig. 2d; Enhancer 1 – Enhancer 1 – Enhancer primed, Enhancer 2- Enhancer Active, Enhancer 3 and 4 – Enhancer latent). Mallimme mukaisesti tunnistimme perustilassa kaksi "latenttia" lokusta (tehostimet 3 ja 4), jotka muuttuivat "aktiiviseen" tilaanmuistimuodostuminen (kuva 2f). Lisäksi otaksutun tehostajan 1 havaittiin olevan "aloitettu" perustilassa ja se tuli aktiiviseksi, jolloin H3K27ac-markkereissa tapahtui merkittävä stabiili lisäys myöhäisen vaiheen ja palautuksen aikana (kuvio 2f). Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että äskettäin saatavilla olevien tehostajien valikoima laajeni tehostetuissa engrammihermosoluissa, joissa latentit tai pohjustetut alueet saivat H3K4me1- ja H3K27ac-merkit ja tulivat siten aktiivisiksi tehostajiksi.

Ymmärtääksemme saatavilla olevien promoottorien ja tehostajaalueiden toiminnallisen roolin, suoritimme motiivien rikastusanalyysin (lisätaulukko 4). Tietomme osoittavat, että suurin osa (70 prosenttia) saavutettavissa olevien promoottorien motiiveista on yhtä rikastettuja ja tunnistettu kaikissa promoottorin vaiheissa.muisti(Laajennettu data kuva 2e). Sitä vastoin suurin osa tehostajakohdista osoitti erillisiä transkriptiotekijää (TF) sitovia motiiveja eri muistivaiheissa. Mielenkiintoista on, että Jun Proto-Oncogenen, Ap-1 Transcription Factor -alayksikön (eli Jun-Ap1) ja TF:iden säätelytekijä X (Rfx) -perheen kaikkialla ilmaistut motiivit rikastuivat merkittävästi vasta alkuvaiheen jälkeen. koodaus (Extended Data Fig. 2e). Aiemmin on raportoitu, että Jun-Ap1-kompleksilla on keskeinen rooli tehosteiden valinnassa ja se saattaa toimia edelläkävijänä TF:nä määrittämään tehostajakohtia aivojen kehityksen ja hermosolujen toiminnan aikana12, 24. Nämä havainnot ovat yhdenmukaisia ​​tietojemme kanssa, joka osoitti korkean prosenttiosuuden piileviä/primed-lokuksia perustilassa (kuva 2f, laajennetut tiedot kuviot 2c, d). Näin ollen näyttää siltä, ​​​​että hermosolujen aktiivisuus saattaa laukaista Jun-Ap1:n sitoutumisen piileviin tehostajiin, jotka sitten värväävät kromatiinimuuntajat, jotka aktivoivat piileviä tehostajia. Vastaavasti transkriptiotekijä Yin Yang 1 (Yy1) -motiivien rikastuminen vain varhaisista ja myöhäisistä tiloista peräisin olevissa tehostajissa viittaa siihen, että promoottori-tehostaja-organisaatio on aktiivinen prosessimuistimuodostumista, koska äskettäin raportoitiin, että Yy1 helpottaa tämän pitkän kantaman vuorovaikutuksen muodostumista25. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että alkuvaiheessamuistimuodostuminen muuttaa kromatiinin saavutettavuusmaisemaa aktivoiduissa neuroneissa, ja pitkäkestoisia stabiileja muutoksia tapahtuu pääasiassa tehostaja-alueilla.

Dynaamiset muutokset spatiaalisessa ydinarkkitehtuurissa ja kromatiinin saavutettavuudessa alkuvaiheessamuistimuodostuminen vastaa lisääntynyttä promoottori-tehostaja-vuorovaikutustaajuutta aikanamuistipalauttaa mieleen

Nuclear 3D -arkkitehtuuri on nousemassa avaintekijäksi geeniekspression dynaamisessa säätelyssä monissa hermosolujen toiminnoissa26–28. Siksi olimme kiinnostuneita määrittelemään tarkkoja muutoksia, joita tapahtuu tilakromatiinin organisoinnissa aikanamuistimuodostumista ja lujittamista. Tuotimme Hi-C-tietoja perustilasta ja eYFP:stä sekä merkityistä neuroneista (varhainen ja myöhäinen, täydentävä taulukko 5). Kromatiini on erotettu kahteen avaruudellisesti erilliseen osaydinosastoon, 'A' ja 'B', jotka vastaavat transkriptionaalisesti aktiivista ja inaktiivista kromatiinia, vastaavasti15, 16, 26. Varhaiset todisteet viittaavat siihen, että hermosolujen aktiivisuus ja ulkoinen signalointi voivat saada aikaan 3D-kromatiiniarkkitehtuurin uudelleenorganisoitumisen14, 27, 28. Osastotilan analyysimme15, 16, 26 (kuvat 3a–c) paljasti suurten kromatiinilohkojen uudelleensijoittumisen inaktiivisista (B) sallivaan ympäristöön (A) (ja päinvastoin) alku- ja myöhäisvaiheessa.muistimuodostuminen (212 segmenttiä vaihdettu A:sta B:hen, 127 segmentistä B:stä A, keskikoko ~436Kbp). Mielenkiintoista on, että 52 prosenttia alkuvaiheen alueista, jotka siirtyivät B:stä A:han, säilyttivät tämän tilan myöhäisessä vaiheessa (eli pysyivät tilassa A, kuva 3b, c; täydentävä taulukko 6). Lisäksi lähes kaikki nämä alueet olivat päällekkäisiä ATAC-seq-analyysistämme saatujen DAR-arvojen kanssa, mikä vahvistaa alaosaston siirtymisen inaktiivisesta sallivaan ympäristöön (kuva 3d). Nämä tiedot osoittavat, että jotkin lokukset käyvät läpi alaosastojen vaihdon eri muistivaiheiden välillä, ja siksi ne voivat myötävaikuttaa pitkäaikaisiin muutoksiin hermosolujen ominaisuuksissa ja toiminnassa alkuperäisen aktivoinnin jälkeen.

Vaikka Hi-C-tietomme viittasivat laajamittaiseen uudelleenjärjestelyyn, jäi epäselväksi, mahdollistiko tämä uudelleensuuntaus uusien promoottori-tehostajaohjelmistojen vuorovaikutuksen ja erilaisten transkriptio-ohjelmien hienosäädön (kuva 3e). Hyödyntämällä promoottorin sieppaus Hi-C (pc-HiC) -tekniikkaa tutkimme tarkkoja muutoksia, joita tapahtuu promoottori-tehostaja-vuorovaikutuksessa prosessin aikana.muistimuodostumista ja muistamista. Tässä tutkimuksessa käytimme räätälöityjä "syöttejä", jotka kohdistuivat ~5{5}} promoottoriin29. Aiempien julkaisujen29 mukaisesti havaitsimme ~19 000 (ryhmää kohden) merkittävää promoottori-tehostaja- (67,5 prosenttia) ja promoottori-promoottori-vuorovaikutus (46,2 prosenttia) (laajennetut tiedot, kuviot 3a, b).

Koska promoottorit nisäkkään aivoissa saattoivat olla useiden säätelyelementtien hallinnassa14, 30, 31, analysoimme päällekkäisyyttä kaikkien vuorovaikutuksessa olevien tehostajien ja niiden vastaavien promoottorien välillä. Olemme havainneet sen jokaisen aikanamuistivaiheessa, samat promoottorit ovat vuorovaikutuksessa useammin erillisen tehostajien alajoukon kanssa (eli ainutlaatuiset, perus – 3243, varhainen - 7602, myöhäinen - 7028, uudelleen aktivoitu – 7244; kuva 4a, b; laajennetut tiedot Fig. 3c; lisätaulukko 7). Tämä tulos on yhdenmukainen aikaisempien julkaisujen kanssa, jotka osoittavat, että useita geenejä (c-Fos ja Arc) ympäröivät useat tehostajat ovat ratkaisevia niiden aktivoitumiselle ja niiden vuorovaikutustiheys vastaavien promoottorien kanssa muuttuu vasteena erilaisille depolarisoiville aineille viljellyissä neuroneissa31. Tunnistamme myös pienemmän vuorovaikutusten alajoukon, jossa promoottorit olivat vuorovaikutuksessa samojen tehostajien kanssa eri puolillamuistivaiheet (eli yleinen, ~ 31 prosenttia kaikista vuorovaikutuksista; lisätaulukko 7). Lisäksi uudelleen aktivoidut neuronit esittivät merkittävästi vahvemmat vuorovaikutuspisteet (Chicago, kuva 4b laskemalla; laajennetut tiedot, kuvio 3d). Näin ollen, vaikka ainutlaatuisten vuorovaikutusten määrä oli samanlainen varhaisessa, myöhäisessä ja uudelleen aktivoidussa tilassa, vahvemmat vuorovaikutuspisteet osoittavat, että spesifisiä promoottori-tehostajavuorovaikutuksia esiintyy useammin muistin aikana.

palauttaa mieleen. Tämä käsitys vahvistettiin edelleen 3C-kokeilla, joissa alukkeet suunniteltiin mittaamaan valitun tehostajan (E) ja geenipromoottorien (P) välisen vuorovaikutuksen tiheyttä, jotka koodaavat eukaryoottisen translaation aloitustekijä 3:n alayksikköä D (Eif3d) tai ionotrooppista kainaattia tai glutamaattireseptoria. 3 (Grik3) (kuvio 4c). Tietomme osoittivat, että uudelleen aktivoiduilla hermosoluilla oli merkittävä lisäys Eif3d-promoottorin ja valitun tehostajan välisessä vuorovaikutustaajuudessa muihin populaatioihin verrattuna (kuvio 4c). Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että promoottorin ja tehostajan vuorovaikutuksia esiintyy useammin aikanamuistipalauttaa mieleen.

Seuraavaksi kysyimme, vastaavatko pc-HiC:n avulla tunnistetut dynaamiset pitkän kantaman vuorovaikutukset kromatiinialueita, jotka tulevat helpommin saavutettaviksi ATAC-seq:n avulla määritettynä. Tämä vahvistaisi, että lisääntyneellä saavutettavuudella on toiminnallinen seuraus uusien promoottori-tehostajavuorovaikutusten aikaansaamisessa. Tämän saavuttamiseksi verrasimme päällekkäisyyttä vuorovaikutuksessa olevien tehostajien välillä kussakin solupopulaatiossa DAR:eihin (havaittu) tai satunnaiseen joukkoon saatavilla olevia genomisia lokuksia (odotettu). Analyysimme paljasti merkittävän päällekkäisyyden molempien saavutettujen DAR-arvojen välillä aktivoiduissa varhaisissa hermosoluissa ja vakaasti saatujen DAR-arvojen välillä vuorovaikutuksessa olevien tehostajien kanssa kaikissa solupopulaatioissa (Kaikki Ps < 0.0001,="" laajennetut="" tiedot,="" kuva="" 3e).="" sitä="" vastoin="" kromatiinin="" saatavuudessa="" tapahtuneet="" muutokset,="" jotka="" tapahtuivat="" vuoden="" myöhäisessä="">muistikonsolidointi ja uudelleenaktivointi eivät menneet merkittävästi päällekkäin vuorovaikutuksessa olevien tehostajien kanssa (laajennettu data, kuva 3e). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että saavutettavuuden lisääminen muistin koodauksen aikana on alkutapahtuma ja nämä pohjustetut lokukset osallistuvat de-novo toiminnallisiin promoottori-tehostaja-vuorovaikutuksiin myöhemmissä vaiheissa.muistimuodostus. Tätä dynaamista maisemaa havainnollistetaan visualisoimalla genomiset alueet eukaryoottisen translaation aloitustekijän 5 alayksikön A (Eif5a) geenin ympärillä (kuvio 4d). Tämä engrammin eliniän ajallinen molekyylidissektio korostaa kuinka koordinoitua solun epigeneettisen tilan pohjustustamuistikoodaus ja konsolidointi helpottaa pitkän kantaman vuorovaikutusta uudelleenaktivoinnin aikana.