Osa 1: Cistanche Deserticola -uutteet voivat antagonisoida immunosensenssia ja pidentää elinikää vanhenemiskiihdytettyjen hiiren 8 (SAM-P8) hiirissä

Yhteystiedot: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Sähköposti:audrey.hu@wecistanche.com

Ke Zhang, 1 Xu Ma, 1 Wenjun He, 1 Haixia Li, 1 Shuyan Han, 1 Yong Jiang, 1

Hounan Wu, 2 Li Han, 3 Tomohiro Ohno, 3 Nobuo Uotsu, 3 Kohji Yamaguchi, 3 Zhizhong Ma, 1, 4 ja Pengfei Tu1

1 Department of Natural Medicines, School of Farmaseutical Sciences, Peking University, No. 38 Xueyuan Road, Beijing 100191, China

2 Medical and Healthy Analytical Center, Peking University, No. 38 Xueyuan Road, Beijing 100191, Kiina

3 Fundamental Research Faculty, Fancl Research Institute, FANCL Corporation, 12-13 Kamishinano, Totsuka-ku, Yokohama, Kanagawa 244-0806, Japani

4 Perinteisen kiinalaisen ja länsimaisen lääketieteen integraation laitos, Lääketieteen perustieteiden laitos, Pekingin yliopisto, No. 38 Xueyuan Road, Beijing 100191, Kiina

Kirjeenvaihto on osoitettava Zhizhong Ma; zhma@bjmu.edu.cn ja Pengfei Tu; pengfeitu@bjmu.edu.cn Vastaanotettu 19. heinäkuuta 2013; Tarkistettu 23. lokakuuta 2013; Hyväksytty 11. marraskuuta 2013; Julkaistu 9. tammikuuta 2014; Akateeminen toimittaja: Adair Santos

1. Johdanto

Cistanche deserticola, joka on yksi suosituimmista perinteisistä kiinalaisista kasviperäisistä lääkkeistä/terveystuotteista, on kuvattu useissa historiallisissa kiinalaisissa yrttifarmakopeoissa olevan ikääntymistä estäviä ominaisuuksia. Sen vuoksi sitä on käytetty laajalti Kiinassa erilaisten ikään liittyvien häiriöiden hoitoon, mukaan lukien seniili dementia, impotenssi, hedelmättömyys, krooninen infektio ja hematopoieettiset häiriöt vanhuksilla [1]. Nykyaikaiset kemialliset lähestymistavat ovat mahdollistaneet kahden päätyyppisen yhdisteen, fenyylietanoidiglykosidit ja oligosakkaridit, eristämisen Cistanche deserticolan tärkeimmiksi vaikuttaviksi aineosiksi [1]. Viimeisen vuosikymmenen aikana Cistanche deserticolaa ja sen uutteita on tutkittu intensiivisesti ja sen on osoitettu pystyvän suojaamaan hermosoluja hermotoksiinien aiheuttamilta vaurioilta[2], estämään hiilitetrakloridin aiheuttamaa maksatoksisuutta [2] ja edistämään luuydinsolujen palautumista Co-indusoitu säteilyvaurio [3]. Sillä on myös osoitettu olevan anti-inflammatorisia, antioksidantteja ja ikääntymistä estäviä vaikutuksia [4]. Voiko Cistanche deserticola pidentää elinikää ja mitkä ovat sen taustalla olevat molekyylimekanismit [3]ikääntymistä vastaanominaisuuksia ei ole testattu tarkasti.

Anti-aging Cistanche deserticola -uutteet

Immunosensenssi eli immuunijärjestelmän muuttuminen iän myötä muodostaa taustan, jonka taustalla on havaittu vanhusten lisääntynyttä herkkyyttä infektioille, syöpään, hermostoa rappeuttaville sairauksille ja autoimmuunisairauksille [5]. Terapeuttisten toimenpiteiden, kuten kalorirajoituksen [6] ja E-vitamiinilisän, on raportoitu olevan tehokkaita viivyttämään immunosensenssin etenemistä ja vähentämään siten joidenkin ikään liittyvien sairauksien sairastuvuutta sekä pidentämään sekä ihmisten että jyrsijöiden elinikää. [7, 8]. Tämän alueen tutkimuksia mutkistaa kuitenkin se, että ikääntyminen liittyy paradoksiin, jotka liittyvät samanaikaiseen immuunipuutteeseen ja krooniseen tulehdukseen [9]. Tämä tarkoittaa, että yksinkertainen lymfosyyttien vapautumisen stimulointi tai tulehduskipu ei edusta ihanteellista terapeuttista interventiota ikääntymisen ja ikääntymiseen liittyvien sairauksien hoidossa [10]. Tämän vuoksi etsittäessä lääketieteellisiä toimenpiteitä, joilla voidaan ehkäistä tai lievittää ikään liittyviä tiloja, mukaan lukien infektiot, syöpä, autoimmuunisairaudet, ateroskleroosi ja hermoston rappeumataudit, jotka ovat johtavia kuolinsyitä ja vammautumisia, ja immuunijärjestelmän vikojen korjaamiseen on liityttävä tulehdusreaktiot.

Vanhenemiskiihdytetty hiiri [11] on AKR/J-kannasta johdettu sisäsiittoinen hiirimalli, jota käytetään laajalti ikääntymistutkimuksissa. Näiden hiirten P8-alakannan (SAM-P8) elinikä on huomattavasti lyhentynyt verrattuna R1-alakantaan (SAM-R1), joka myös osoittaa hitaampaa ikääntymisprosessia [12]. Rinnakkain ennenaikaisen ikääntymisensä kanssa SAM-P8-hiirillä on myös lisääntynyt neurologinen vanheneminen, immunosensenssi ja ikääntymiseen liittyvät hematopoieettiset puutteet, jotka jäljittelevät läheisesti ihmisen tyypillisiä ikääntymisen ominaisuuksia [13, 14]. Nopeutuneen ikääntymisprosessin ja ikääntymiseen liittyvien häiriöiden taustalla olevien mekanismien analyysi osoittaa, että mitokondrioiden toimintahäiriöt [15], oksidatiivinen stressi ja lisääntynyt somaattisen DNA:n mutaationopeus näyttävät kaikki liittyvän [16, 17]. Tämä hiirijärjestelmä, jolla on homogeeninen geneettinen tausta, tarjoaa siksi erinomaisen kokeellisen mallin ikääntymisen ja ikääntymistä ehkäisevien lääkkeiden [12] tutkimiseen, ja se on talletettu Kiinan Pekingin yliopiston lääketieteellisen tiedekunnan herbaarioon.

cistanche voi estää ikääntymistä

2. Materiaalit ja metodit

2.1. Materiaalit.

TuoreCistanche deserticola YC MAkerättiin eri alueilta Luoteis-Kiinassa, mukaan lukien Xinjiangin, Neimenggun ja Ningxian autonomiset alueet. Uutteiden valmistukseen käytetyt näytteet vahvisti professori Pengfei Tu, farmakognosian asiantuntija Pekingin yliopiston lääketieteellisen tiedekunnan luonnonlääkkeiden laitokselta. Käytetyssä Cistanche deserticolan (numero CD-2007-03-08) kupongissa oli Science Center (Peking, Kiina). Tämän tutkimuksen hyväksyi Pekingin yliopiston eläintutkimuskomitea, ja se suoritettiin Pekingin yliopiston laboratorioeläinten hoitoa ja käyttöä koskevien ohjeiden mukaisesti. Näiden hiirten sertifiointinumero oli SCXK2001-2008. Hiiriä pidettiin normaaleissa metabolisissa häkeissä ympäristössä

C, 45–60 prosentin kosteus ja 12 tunnin valo/pimeysjakso) ja mahdollisti vapaan pääsyn ruokaan ja veteen. Kahden viikon totuttelun jälkeen eläimet jaettiin viiteen ryhmään: 3 ECD-hoitoryhmää, SAM-R1-kontrolliryhmä ja ei-käsiteltyä SAM-P8-kontrolliryhmä. Kolmen hoitoryhmän ruokavaliota täydennettiin ruokavaliolla, johon sekoitettiin erilaisia ​​ECD-pitoisuuksia: pieni (50 mg/kg), keskimääräinen (150 mg/kg) ja suuri (450 mg/kg) keskimääräinen ECD-annos päivittäin. . SAM-R1- ja SAM-P8-kontrolliryhmiä, joissa ei ollut hoitoa, ruokittiin samalla ruokavaliolla ilman ECD:tä. Kaikkien eläinten ravinnonsaanti mitattiin kolmen päivän välein koko kokeen ajan. Verenpaine ja sydänkuukausia kokeen ajaksi hiirten terveydentilan määrittämiseksi. Kunkin hiiren elinikä oli Elinkykyiset apoptoottiset ja nekroottiset lymfosyytit kvantifioitiin käyttämällä Annexin V-FITC -pakkausta (Beijing Biosea Biotechnology Co., Ltd., Peking, Kiina). Lymfosyytit värjättiin kaksoisvärjäyksellä fluoreseiini-isotiosyanaattikonjugoidulla leimatulla anneksiini V:llä (Annexin V-FITC) ja suspendoitiin propidilla 200 ul:aan sitoutumispuskuria (10 mM HEPES/NaOH,

2.2 Cistanche deserticola (ECD) -uutteiden valmistaminen ja HPLC-analyysi.

Ilmakuivattu ja viipaloitu Cistanche deserticola(2.{1}} kg) jauhettiin ja uutettiin kahdesti 70-prosenttisella etanolilla 1 tunnin ajan. Käytetty kasvi/etanoli-suhteet olivat 1/6 (w/w) ensimmäisessä uutossa ja 1/4 (w/w) toisessa uutossa. Nämä kaksi uutetta yhdistettiin ja suodatettiin ennen kuin ne väkevöitiin suhteelliseen tiheyteen 1,10–1,15 alennetussa paineessa 60 °C:ssa. Tämä konsentraatti tyhjiöitiin ja kuivattiin ja tuloksena saatu jauhe oli Cistanche deserticola (ECD) -uute, jota käytettiin koko tutkimuksen ajan. .

ECD:n komponentit analysoitiin käyttämällä HPLC:tä, kuten aiemmin on kuvattu [1]. Lyhyesti sanottuna 100 mg ECD-jauhetta liuotettiin 10.0 ml:aan HO:ta ja suodatuksen jälkeen injektoitiin HPLC:hen. HPLC-analyysi suoritettiin Agilent 1100 -nestekromatografiajärjestelmällä (Agilent Co., USA). Liikkuva faasi koostui metanolin (A) ja 0,10 % metaanihapon (B) seoksesta. Käytettiin gradienttikromatografiaohjelmaa; tämä oli 26,5 prosenttia (A) ja 73,5 prosenttia (B) 0–7 minuutissa, 26,5–29,5 prosenttia (A) ja 73,5–70,5 (B) 8–10 minuutissa ja 29,5 prosenttia (A) ja 70,5 prosenttia (B). ) 20–27 minuutissa. Virtausnopeus pidettiin vakiona 1,0 ml/min, injektiotilavuus oli 10 ml ja kolonnin lämpötila pidettiin 25 °C:ssa. UV-detektoria, joka oli asetettu 330 nm:iin, käytettiin monitoroimaan kolonnin ulosvirtausta ja luomaan kromatogrammeja.

Kuivattu ja viipaloitu Cistanche deserticola

Fenyylietanoidiglykosidit ja cistanchen oligosakkaridittunnistettiin niiden retentioaikojen ja absorptiospektrien perusteella. Kvantitointi suoritettiin ulkoisten standardikalibrointikäyrien avulla. TuottoCistanche deserticola -uutteet(ECD) oli noin 3,33 prosenttia ja fenyylietanoidien pitoisuus oli 17,94 prosenttia. Akteosidi ja ekinakosidi olivat kaksi tärkeintä ainesosaa tässä fraktiossa, ja niiden pitoisuudet olivat vastaavasti 3,80 prosenttia ja 8,25 prosenttia. Oligosakkaridit muodostavat 82 prosenttia ECD:stä. ECD:n tärkeimpien aktiivisten komponenttien pitoisuudet on esitetty taulukossa 1.

2.3 Eläinten elinkaaren analyysi.

Tämä tutkimus on keskittynyt sen selvittämiseen, onkoCistanche deserticola -uutteetjotka pystyvät pidentämään SAM-R1-hiirten elinikää, ostettiin Pekingin yliopiston laboratorioeläinten jalostus- ja tutkimuskeskuksesta, terveys SAM-P8-hiiret vaihtavat niiden immunosensenssitilan.

2.4. Tilastollinen analyysi.

Tiedot esitetään keskiarvoina SD Vertailut eri ryhmien välillä tehtiin yksisuuntaisella ANOVA:lla post hoc -testillä. Elinikätutkimuksessa tiedoille tehtiin Kaplan-Meier eloonjäämisanalyysi, joka sisälsi sekä Log-rank (Mantel-Cox) että Gehan-Breslow- Wilcoxon -testin käytön. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen Statistical Package for Social Sciences for Windows (SPSS, fosfaattipuskuroitu suolaliuos (PBS, pH 7,4), joka sisälsi 0,01 prosenttia natriumatsidia, ja sille suoritettiin FCM-analyysi. Lymfosyyttialapopulaatiot analysoitiin virtauksen perusteella sytometria käyttäen FACS Calibur -virtaussytometriä (BD Biosciences, San Diego, CA, USA) ja BD CellQuest -analyysiohjelmistoa. Chicago, IL) ja a on merkittävä.

Fenyylietanoidiglykosidit ja cistanchen oligosakkaridit

3. Tulokset

Arvoa pienempi kuin 0,05 otettiin huomioon.Perifeeristen T-lymfosyyttien solujen elinkelpoisuuden arviointi anneksiini V-FITC- ja PI-kaksoisvärjäyksellä ja FACS-analyysillä. Sen jälkeen, kun SAM-P8-hiirille oli annettu ravintolisää kolmella ECD-annoksella 4 viikon ajan, eläimet kiinnitettiin 12 tunnin ajan ja nukutettiin sitten, ja verta kerättiin ja analysoitiin.

3.1. Cistanche deserticola (ECD) -uutteiden mahdollisten aktiivisten komponenttien analyysi. Kuten taulukosta 1 näkyy, ECD koostuu pääasiassa kahdesta tyyppisestä yhdisteestä, fenyylietanoidiglykosideista ja oligosakkarideista. Fenyylietanoidiglykosideista on tunnistettu ekinakosidi, akteosidi ja 8-epilogaanihappo, kun taas oligosakkarideista vain galaktitoli.

3.2.CistanchedeserticolakbdO4ct:n vaikutus SAM-P8-hiirten keskimääräiseen elinikään. Tätä ja myöhempiä tutkimuksia varten kahdeksan kuukauden ikäiset urospuoliset SAM-P8-hiiret jaettiin 4 ryhmään. Heistä yksi ryhmä hiiriä ruokittiin normaalilla ruokavaliolla ilman ECD:tä, muut 3 ryhmää ovat syöneet erikseen ruokavalioita, jotka sisältävät eri suhteita ECD:tä. SAM-R1-alakannan hiiriä, joilla on epänormaali ikääntymisprosessi ja elinikä, käytettiin kontrolliryhmänä kaikissa kokeissa.

Verrattuna kontrolli-SAM-R1-ryhmään, SAM-P8-hiirten keskimääräinen elinikä lyheni merkittävästi (kuvio 1(a);<0.001). although="" supplementation="" of="" diet="" with="" the="" low="" dose(50mg/kg)of="" ecd="" failed="" to="" produce="" a="" significant="" increase="" in="" life="" spanofsam-p8mice,="" at="" the="" medium="" (150="" mg/kg)and="" high(450="" mg/ml)="" supplementary="" doses="" there="" was="" a="" dose-dependent="" increase="" in="" life="" span="" (figures="" 1(a)and=""><0.05 0.0thatwasconfirmedby="" kaplan-meier="" survival="" analysis,="" which="" included="" use="" of="" both="" the="" log-rank="" (mantel-cox)="" and="" gehan-breslow-wilcoxon="">

3.3. Immunosensenssin kumoaminen SAM-P8-hiirillä Cistanche deserticola (ECD) -uutteilla. Perifeeristen naiivien T-lymfosyyttien väheneminen ja samanaikainen perifeerisen muistin T-lymfosyyttien lisääntyminen ovat immuunivanhenemisen merkittäviä piirteitä, joita pidetään laajalti ikään liittyvien immunologisten poikkeavuuksien tärkeimpänä taustalla. Tämä immunosensenssi SAM-P8:ssa suhteessa SAM-R1:een

aniftalsv0selvästi ilmeinen, kun FACS-analyysin piti luetella (CD3 plus CD44wCD4Bigh)lymfosyytit naiivien T-solujen indikaattorina ja (CD3 plus CD44gh CD45 BR-lymfosyytit muisti-T-solujen san-indikaattorina. Siten perifeerisen veren inbpth( Kuva 2) ja pernasolut (kuva 3) populaatiot vähensivät naiivien T-solujen tasoa ja kohonneet muisti-T-solujen tasot SAM-P8-hiirillä SAM-P8-hiirten ruokavalion täydentämisen ECD:llä havaittiin pystyvän kääntämään nämä immunosensenssiindikaattorit annoksella riippuvainen tapa sekä ääreisveren (kuva 2) että pernasolupopulaatioiden (kuva 3) populaatioissa. Lisäindikaattorina immuunivanhenemisen kääntymisestä ECD-ravinnon täydentämisellä luonnollisen tappajasolujen [18] taso, luontaisen immuunijärjestelmän tärkein solumarkkeri Tämä osoitti, että ECD-ruokavalion lisäys johti annoksesta riippuvaiseen lisääntymiseen NK(CD3 plus CD49 plus) -soluissa sekä ääreisveren (kuvio 4) että pernasolujen (kuvio 5) lymfosyyttipopulaatioissa.

3.4. Cistanche deserticola -uutteet vahvistavat Sca-1-positiivisten solujen suhteellista fluoresenssiintensiteettiä SAM-P8-hiirissä. Kantasoluantigeeni-1(Sca-1) on yksi huomattavimmista hematopoieettisten kantasolujen (HSC) biomarkkereista luuydinsolupopulaatioissa. Sca-1-positiiviset solut edustavat myös lymfosyyttien esiasteita, joilla on äskettäin viety luuytimestä perifeeriseen vereen, jossa ne läpikäyvät.

Kuva 2: FACS-analyysi ravintolisän vaikutuksesta ECD:llä, joka on naimaton ja muisti Tlymfosytesiinin ääreisveri. Kahdeksan kuukauden ikäiset urospuoliset SAM-P8- ja kontrolli-SAM-RI-hiiret jaettiin 5 ryhmään. Kolmea SAM-P8-eläinten hoitoryhmää ruokittiin neljän viikon ajan ruokavaliolla, jota oli täydennetty pienillä (100 mg/kg), keskisuurilla (500 mg/kg) ja suurilla (2500 mg/kg) ECD-annoksilla, ja kahta kontrollieläintä.

gatingon CD3 plus Tcels -viivat osoittavat kynnysarvoja, joita käytetään erottamaan CD44x* ja CD45 käytettävän naiivien (CD3 plus Cp b"C4RB→) ja muistin (CD3 plus CD4hCD 4Bl) T-solujen kokonaisalhainen tunnistaminen. b) Histogrammi, jossa näkyvät ryhmät syötettiin samalla ruokavaliolla ilman lisäravinteita. 12 tunnin paaston jälkeen perifeeristä verta otettiin nukutetuista RB T-solujen alajoukoista ja niille tehtiin FACS-analyysi osassa 5 kuvatulla tavalla. eri eläinryhmien ääreisveressä. (c) Histogrammi, joka näyttää muisti-T-solujen prosenttiosuuden eri eläinryhmien ääreisveressä. Pylväät edustavat keskiarvoa ± SD (jossakin ryhmässä,=10).<0.05sam-p8versus>

Kuva 3: FACS-analyysi ravintolisän vaikutuksesta ECD-onnaiivilla ja muistilla Tlymfosyytit perna.Kahdeksan kuukauden ikäiset urospuoliset SAM-P8- ja kontrolli-SAM-RI-hiiret jaettiin 5 ryhmään. Kolmea SAM-P8-eläinten hoitoryhmää ruokittiin neljän viikon ajan täydennettyjen ruokavalioiden kanssa pienillä (100 mg/kg), keskisuurilla (500 mg/kg) ja korkeilla (2500 mg/kg) annoksilla ECD:tä ja kahdella kontrollieläinryhmällä gatingon CD3 plus T-solujen avulla. Kussakin käyrässä näkyvät viivat osoittavat, että CD44zh- ja CD45 bw:tä tulisi käyttää erottamaan naiivit (CD3 plus CD "CsRB动)" ja muisti (CD3 plus CD42CD I'm）Tcels). (b) Histogrammin näyttäminen syötettiin 12 tunnin paaston jälkeen pernan lymfosyytit kerättiin nukutetuista RB T-solujen alaryhmistä ja niille tehtiin FACS-analyysi, joka on kuvattu osassa 5.

Kuva 4: ECD-ravintolisän vaikutukset luonnollisiin tappajasoluihin (NK-solut, CD3 plus CD49 plus T-solut) SAM-P8-hiirten perifeerisen veren lymfosyyttipopulaatioissa. Kahdeksan kuukauden ikäiset urospuoliset SAM-P8- ja kontrolli-SAM-RI-hiiret jaettiin 5 ryhmään. Kolmea SAM-P8-eläinten hoitoryhmää ruokittiin neljän viikon ajan ruokavaliolla, jota oli täydennetty pienillä (100 mg/kg), keskisuurilla (500 mg/kg) ja korkeilla (2500 mg/kg) ECD-annoksilla, ja kaksi kontrollieläinryhmää olivat sama ruokavalio ilman lisäravinteita. 12 tunnin paaston jälkeen perifeerinen veri kerättiin nukutetuista eläimistä ja niille tehtiin FACS-analyysi, kuten on kuvattu osassa 5. (a) Edustavat FACS-käyrät eri hiiriryhmistä, jotka luotiin portittamalla CD3 plus CD49 plus T-solut. (b) Histogrammi, joka näyttää luonnollisen tappajan T-solujen prosenttiosuuden eri eläinryhmien perifeerisessä veressä. Palkit edustavat keskiarvoa ± SD (kukin ryhmä, =10).=<0.01><0.01 each="" treatedgroup="" versussam-p8group="" (byone="" way="" anovawith="" post="" hoc="">

Kuvio 5: ECD-ravintolisän vaikutukset luonnollisiin tappajasoluihin (NK-solut, CD3 plus CD49 plus T-solut) SAM-P8-hiirten pernan lymfosyyteissä. Kahdeksan kuukauden ikäiset urospuoliset SAM-P8- ja kontrolli-SAM-RI-hiiret jaettiin 5 ryhmään. Kolmea SAM-P8-eläinten hoitoryhmää ruokittiin neljän viikon ajan ruokavaliolla, jota täydennettiin pienillä (100mg/kg), keskisuurilla (500mg/kg) ja korkeilla (2500mg/kg) ECD-annoksilla, ja kaksi kontrollieläinryhmää samalla ruokavaliolla ilman lisäravinteita. 12 tunnin paaston jälkeen pernan lymfosyytit kerättiin nukutetuista eläimistä ja niille tehtiin FACS-analyysi, joka on kuvattu osassa 5.(a) Edustava FACS-kaavio eri hiiriryhmistä, jotka luotiin portittamalla CD3 plus CD494 T-soluja.(b) Histogrammi, joka näyttää luonnollisen tappaja-T:n prosenttiosuuden. solut eri eläinryhmien pernan lymfosyyteissä. Palkit edustavat keskimääräistä SD:tä (jossakin ryhmässä,=10), # < 0,01="" sam-p8="" yersus=""><0.01 eachtreatedgroup="" versussam-p8group(by="" oneway="">

Edelleen erilaistumista erityyppisiksi kypsiksi lymfosyyteiksi. Näin ollen nämä Sca{0}}-positiiviset solut edustavat pääasiallista naiivien T-lymfosyyttien lähdettä ääreisveressä. Kuva 6 osoittaa, että verrattuna SAM-R1-kontrollihiiriin Sca-1-positiivisten solujen suhteellinen fluoresenssin intensiteetti SAM-P8-hiirissä oli huomattavasti alhaisempi. SAM-P8-hiirten ruokavalion täydentämisen kolmella eri ECD-annoksella osoitettiin lisäävän merkittävästi Sca-1-positiivisten solujen suhteellista fluoresenssin intensiteettiä (kuva 6).

Cistanche-yrtin etu: ikääntymisen esto