Osa 1:Cistanche Tubulosa -vesiuutteen vaikutukset suoliston häiriöistä kärsivien hiirien suoliston mikrobistoon

Ota yhteyttäoscar.xiao@wecistanche.comlisätietoja

Suolen mikrobiston häiriöt liittyvät moniin sairauksiin. *e vesipitoinen uuteCistanche tubulosa (CT), perinteisellä kiinalaisella yrttikoostumuksella, on raportoitu olevan rooliihmisen suoliston suojaaminen. Sen vaikutuksista suoliston mikrobistoon tiedetään kuitenkin vähän. *Tämä tutkimus tehtiin sen määrittämiseksi, voiko CT-vesiuute moduloida suoliston mikrobiomia hiirillä, joilla on suolistosairauksia. Havaitsimme, että vaurioituneetsuoliston morfologiacefiksiimikäsittelyn tuloksena saatu tulos voitaisiin pelastaa käyttämällä CT-vesipitoista uutetta. *CT-uutteella hoidettujen hiirten ja kontrollihiirien mikrobien monimuotoisuuden vertailu osoitti myös, että häiriö malliryhmien mikrobiomiyhteisössä voitaisiin palauttaa käsittelemällä vesipitoisen uutteen korkeita ja keskisuuria pitoisuuksia. Kefiksiimihoito johti maitohappobakteerien merkittävään vähenemiseen; CT-vesiuutteen täydentäminen kuitenkin sai takaisin näiden maitohappobakteerien kasvun. Lisäksi CT-vesiuute pystyi hillitsemään cefiksiimin aiheuttaman suoliston mikrobiomin metabolisten reittien dramaattisia muutoksia. *ese-löydökset antoivat käsityksen CT:n vesipitoisen uutteen hyödyllisistä vaikutuksista suoliston mikrobistoon, ja ne tarjosivat myös tärkeän viitteen vastaavien lääkkeiden kehittämiselle tulevaisuudessa.

Cistanche rentouttavaan suolistoon, napsautaTäällätietää enemmän

Johdanto

ovat osoittaneet, että C.deserticola-polysakkariditindusoida melanogeneesiämelanosyytit, vähentää oksidatiivista stressiä[15], lievittää kognitiivisia toimintahäiriöitä säätelemällä antioksidanttisia ja anti-inflammatorisia prosesseja rotilla [16], suojaaPC12-soluja OGD/RP:n aiheuttamilta vammoilta [17], tehostaa echinakosidin imeytymistä in vivo ja vaikuttaa suoliston mikrobistoon [18]. Probiootit ovat eläviä ei-patogeenisiä mikro-organismeja, joilla on terveyshyötyjä ja jotka antavat mikrobitasapainon ruoansulatuskanavassa, kun niitä annetaan riittävässä määrin [19]. *ey voi tehostaa epäspesifisiä solujen immuunivastetta, jolle on tunnusomaista makrofagien, luonnollisten tappajasolujen (NK) ja antigeenispesifisten sytotoksisten T-lymfosyyttien aktivoituminen ja erilaisten sytokiinien vapautuminen kantaspesifisellä ja annoksesta riippuvaisella tavalla [20]. Probioottiset kannat parantavat suoliston epiteelin ominaisuuksia TJ-modulaation avulla, ja tiettyjen probioottisten kantojen on osoitettu säätelevän mucinin ilmentymistä, mikä vaikuttaa limakerroksen ominaisuuksiin ja säätelee epäsuorasti suoliston immuunijärjestelmää [21]. Maitohappobakteerikannat (LAB) ja Bifidobacterium ovat tärkeitä probiootteja, joita on käytetty monilla aloilla [22–26]. *terveyshyötyjä on lukuisia, ja niiden antioksidanttikapasiteetti on tärkeä tekijä niiden terveyteen liittyvissä toiminnoissa[27]. Probiootit voivat kelatoida metalli-ioneja estääkseen niitä kakatalisoimasta hapettumista [28, 29]; ne voivat myös lisätä antioksidanttientsyymien ilmentymistä [30, 31], tuottaa erilaisia metaboliitteja, joilla on antioksidanttiaktiivisuutta [32, 33], välittää antioksidanttisignalointireittejä [34–36] ja säädellä entsyymejä, jotka tuottavat reaktiivisia happilajeja (ROS) ja suoliston mikro-organismien kulkeutumista oksidatiiviseen stressiin[37]. Äskettäinen tutkimus osoitti, että CD:n polysakkaridit voivat stimuloida joidenkin maitohappobakteerien kasvua, mikä voisi hyödyttää ihmisten terveyttä [38]. Cd-levyllä olevien polysakkaridien pitoisuus on kuitenkin erilainen kuin CT:ssä [7, 39], ja tämä ero voi johtaa diffefrenttiefffekteihin suoliston mikro-organismeissa. Lisäksi, vaikka CD-polysakkaridit voivat vähentää oksidatiivista stressiä aktivoimalla NRF2/HO-1-reitin [15],ingle-polysakkaridien vaikutukset voivat poiketa CT:n moniarvoisten koostumusten kokonaisvaikutuksesta. Lisäksi fanit voivat myösresistisen oksidatiivisen stressin [40] ja tukahduttaa lipolysaccha-ratsastusvälitteisiä tulehdusvasteita aktivoimallaKeap1/Nrf2/HO-1-reitin [41]. *ennen CT-vesiuutteen vaikutuksen määrittäminen on erittäin arvokasta. Lisäksi vesipitoisen CD-uutteen tiettyjen ainesosien vaikutukset oksidatiiviseen stressiin ja suolistoflooraan viittaavat siihen, että resistenssi oksidatiiviselle stressille saattaa korreloida suoliston kasviston muutosten kanssa. Edellä mainittujen aiheiden tietämyksen aukkojen täyttämiseksi tutkimme CTaqueous-uutteen vaikutuksia suoliston häiriöitä sairastavien hiirien suoliston mikrobistoon. *ese-tulokset antavat arvokasta tietoa mahdollisista mekanismeista, joiden avulla se muuttaa suolistoflooraa ja antaa suoliston vastustuskyvyn oksidatiiviselle stressille.

2. Materiaalit ja menetelmät

annettiin päivittäin klo 12.00, ja muita aineita annettiin päivittäin klo 15.00. Kokeiden aikana C-, D-, E- ja F-ryhmät pidettiin suoliston häiriöiden mallitilassa. *e ulosteet kerättiin seitsemän päivän välein steriililtä pöydällä ja varastoitiin -20 °C.2.4°C:ssa. Histopatologinen havainto hiirien paksusuolesta. Kokeen lopussa hiiret tapettiin kohdunkaulan dislokaatiolla, ja niiden paksusuolen sisältö kerättiin steriilille käyttökelpoiselle pöydälle ja varastoitiin −80 °C:ssa; Samaan aikaan paksusuolen kudosnäytteet kiinnitettiin 10%: iin neutraaliin formaliiniin.*en, näytteet dehydratoitiin käyttämällä etanolin gradienttipitoisuutta, hyalinisoitiin ksyleenillä, upotettiin parafiiniin, leikattiin ja värjättiin hematoksyliini-eosiinilla. Morfologisia muutoksia paksusuolen limakalvossa havaittiin ja verrattiin optisella mikroskoopilla. Villus-pituus ja kryptasyvyys paksusuolessa mitattiin ja laskettiin villuspituuden ja kryptasyvyyden suhde (V/C-arvo) (51).2.5. DNA:n uuttaminen ja kirjaston rakentaminen. DNA uutettiin ulosteista käyttämällä E.Z.N.A. ®Soil DNA Kitiä (Omega Bio-Tek, Norcross, GA, USA) valmistajan protokollan mukaisesti. DNA:n laatu määritettiin fluorometrillä (QuantiFluor™–ST, Promega Corporation, USA). Parilliset alukkeet V3-V4-alueella 16s rDNA on suunniteltu vahvistamaan aluetta ja tuottamaan 466 bp DNA-fragmentteja. *e eteenpäin pohjamaali oli 341F (-5-CCTACGGGNGGNGGCWGCAG-3-) ja käänteinen pohjamaali 806R (-5-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3-). JokainenPCR-tilavuus oli 25 μl, sisältäen 2,5 μl 10 × PCR-bufffferia, 2 μl dNTP: tä, 1 μl kutakin pohjamaalia ja 20–30 ng templaatin DNA: ta. *en, indeksoidut sovittimet kiinnitettiin amplikonien päähän sekvensointikirjastojen luomiseksi. *kirjastot validoitiin QuantiFluor-fluorometrillä™ ja kvantifioitiin arvoon 10 nmol.2.6. 16s rRNA-geenien sekvensointi ja mikrobiyhteisöAnalyysi. *e Illumina-alustaa (Illumina MiSeq) käytettiin 2 × 250 bp:n parillisen datan hankkimiseen. Operatiiviset taksonomiset yksiköt (OTU) hankittiin Uparse-ohjelmistolla tavallisella klusteroinnilla, jonka samankaltaisuus oli 97%. *e RDP-luokittelijan naiivia Bayesianassignment-algoritmia käytettiin kohdistamaan OTU: t Greengene-tietokannan julkaisuun 13.5 ja suorittamaan lajimerkintöjä. *e suoliston mikrobiston alfa-monimuotoisuus laskettiin Shannon- ja Simpson-indekseillä, ja ryhmien väliset erot analysoitiin lineaarisella syrjivällä analyysillä Effffect Size (LEfSe). *e beeta-monimuotoisuutta analysoitiin Brady–Curtis-erojen pääkoordinaattianalyysillä (PCoA). PICRUSt2:ta käytettiin arvioimaan suoliston mikrobien mikrobien metabolista kapasiteettia [42].2.7. Tilastollinen tietojen analyysi. SPSS 20:tä käytettiin yksisuuntaisessa ANOVA:ssa, ja kokeelliset tiedot ilmaistiin X ± S:nä; X ilmaisee keskiarvon ja S tarkoittaa keskihajontaa.

Cistanche immuniteetin parantamiseksi

3. Tulokset

3.1. 8 CT-vesiuutteen vaikutus paksusuolen morfologiaan.*e edustavat yhdisteet (ekinakosidi ja asetonidi) ja niiden CT-uutteen pitoisuudet validoitiin HPLC:llä (kuva S1). Vesipitoisen uutteen vaikutuksen määrittämiseksi suolistoon tutkimme paksusuolen villien pituuden ja syvennysten syvyyden vesiuutteella käsittelyn jälkeen. *e paksusuolen villit normaaleissa ja suuriannoksisissa ryhmissä (A, B ja D) olivat pidempiä ja sormimaisia, kun taas mallin paksusuolen villit ja pieniannoksiset ryhmät (C ja F) olivat lyhyitä ja paksusuolen villien kärjet olivat rikki (kuva 1). Näin ollen suuriannoksinen CT-vesiuute lisäsi merkittävästi paksusuolen villien pituutta ja pienensi syvennyssyvyyttä hiirillä, joilla oli suolistosairauksia, verrattuna malliryhmän hiiriin (P< 0.01).="" in="" contrast,="" recess="" depth="" was="" not="" significantly="" different="" between="" the="" high-dose="" group="" and="" the="" normal="" group="" (p="">0.05) (taulukko S1). *ese-tulokset osoittivat, että suuri annos CT-vesipitoista uutetta voi parantaa morfologiaa suolistosairauksista kärsivien hiirten paksusuolen sisällä.3.2. 8e CT:n vesipitoisen otteen efffektiGut Microbiotan monimuotoisuudesta. Suoritimme 16s rRNA-geenisekvensoinnin tutkiaksemme paksusuolen sisällä tapahtuvien morfologisten muutosten mahdollista syytä ja tutkiaksemme suoliston mikrobiston muutoksia CT-vesiuutteella käsittelyn jälkeen. Raakatiedoista saatiin keskimäärin 100 553 tehokasta tunnistetta, jotka vaihtelivat 77 734:stä 125 144:ään (taulukko S2). *Polttarit ryhmiteltiin 4932 OTU: iin (taulukko S3). Sitten analysoimme suoliston mikrobiston monimuotoisuutta Theseuksen perusteella. *e Shannon- ja Simpson-indekseissä ei ollut eroa A-ryhmän (normaali CT-vesiuutteen kanssa) ja B-ryhmän (normaali ilman CT-vesiuutetta) välillä (kuva 2(a)). *on osoitettu, että hiirillä, joilla ei ole kefiksiimihoitoa, CT-vesiuutteella ei ehkä ole ollut muita hyödyllisiä tai haitallisia vaikutuksia suoliston mikrobiston teα-monimuotoisuuteen. Malliryhmän (C) α monimuotoisuus osoitti kuitenkin laskevaa suuntausta verrattuna normaaliryhmien suuntaukseen. *e hiiret, joita hoidettiin suuren ja keskiannoksen CT-vesiuutteilla, osoittivat merkkejä a-monimuotoisuuden elpymisestä, kun taas tällaista ilmiötä ei havaittu hiirillä, joita hoidettiin pieniannoksisella CT-vesiuutteella (kuva 2(a)). Samaan aikaan PCoA paljasti, että normaaleilla ryhmillä (A ja B) ja suoliston häiriöryhmillä, joille annettiin suuria annoksia (D) ja keskiannoksen (E) CTaqueous-uutteita, oli yleensä lyhyempiä näytteiden välisiä etäisyyksiä kuin malliryhmässä ja pieniannoksisessa CTaqueous-uutelisäryhmässä (F) (kuva 2(b)). *Tulokset osoittivat, että CT-vesiuute voisi auttaa parantamaan suoliston mikrobiston monimuotoisuutta hiirillä, joilla on suolistosairauksia.

3.3 Muutokset CT-vesiuutteella käsitellyn suoliston mikrobiston koostumuksessa. *e mikrobiston koostumusprofiileja verrattiin eri ryhmiin. Phylum-tasolla proteobakteerien suhteellinen runsaus malliryhmässä oli suurempi kuin muissa ryhmissä.

Kuva 1: Cistanche tubulosa (CT) -vesiuutteen *e vaikutus paksusuolen morfologiaan: A, normaali ryhmä, johon on lisätty keskiannoksen vesipitoista Cistanche tubulosa (CT) -uutetta; B, normaali ryhmä; C, malliryhmä; D, malliryhmä, johon on lisätty suuriannoksista CT-vesiuutetta; E, malliryhmä, johon on lisätty keskiannoksen CT-vesipitoista uutetta; F, malliryhmä, johon on lisätty pieniannoksista CT-vesiuutetta. a) RyhmäA. b) Ryhmä B. c) Ryhmä C. d) Ryhmä D. e) Ryhmä E. f) Ryhmä F.

(Kuvio 3 a).) *Proteobakteerien lisääntyminen viittasi siihen, että kefiksiimi muutti mallihiirien mikrobiomia ja että CT-vesipitoinen uute saattaa hyödyttää suoliston mikrobiota, koska Proteobakteerien lisääntynyt esiintyvyys on häiriintyneen suolistoflooran keskusmarkkeri [43–45]. Lisäksi sukutasolla Lactobacillusin suhteellinen runsaus malliryhmässä väheni verrattuna normaalien ja suuriannoksisten ryhmien runsauteen; Se kuitenkin lisääntyi verrattuna keski- ja pieniannoksisen ryhmän ryhmään (kuva 3 b). *Nämä tulokset osoittivat, että suuriannoksinen CTaqueous-uute saattaa edistää joidenkin Lactobacillus-suvun bakteerien kasvua. Tutkittujen ryhmien välinen differentiaalinen mikrobisto määritettiin edelleen LEfSe-analyysin mukaisesti. *analyysi osoitti, että kefiksiimihoidon jälkeen Turicibacterin, Alphaproteobacterien, Acidobacterian, Betaproteobacterialesin ja Chloroflflexin suhteelliset runsaudet lisääntyivät merkittävästi, kun taas lactobacillus-, Eubacterium_nodatum_group-, Pseudonocardiales- ja Christensenellaceae_R-7_group suhteelliset runsaudet vähenivät merkittävästi normaaliryhmään verrattuna (kuva 4(a)). Silmiinpistävää on, että kun malliryhmää täydennettiin suuriannoksisella CT-vesiuutteella, Muribaculaceaen, Lactobacillusin, Kineosporiaceaen, Eubacterium no datum -ryhmän ja Pedobacteren suhteelliset runsaudet lisääntyivät merkittävästi malliryhmän suhteelliset runsaudet. Samaan aikaan Rhodobacterin, Ruminococcaceae UCG_013, Roseburian, Ruminiclostridium_9 ja Candidatus Stoquefifichuksen suhteelliset runsaudet vähenivät merkittävästi malliryhmän suhteelliset runsaudet (kuva 4(b))

Kuva 2: Suolen mikrobiston monimuotoisuusanalyysi hiirien ulosteista. a) α-Bakteeriyhteisöjen monimuotoisuus Mitattuna Shannon-indeksillä (A) ja Simpson-indeksillä (B); b) pääkoordinaattianalyysin (PCoA) kaavio, joka visualisoi tiedot Bray–Curtis-erojen perusteella. A, normaali ryhmä, johon on lisätty keskiannoksen vesipitoista Cistanche tubulosa (CT) -uutetta; B, normaali ryhmä; C, malliryhmä; D, malliryhmä, johon on lisätty suuriannoksista CT-vesiuutetta; E, malliryhmä, johon on lisätty keskiannoksen CT-vesipitoista uutetta; F, malliryhmä, johon on lisätty pieniannoksista CT-vesiuutetta.