Osa 1: ekinakosidi aiheuttaa apoptoottisen syöpäsolukuoleman estämällä nukleotidipoolia puhdistavaa entsyymiä MTh1

Ottaa yhteyttä:joanna.jia@wecistanche.com

Abstrakti:Nukleotidipoolia desinfioivan entsyymin MTH1 inhibitio aiheuttaa laajoja oksidatiivisia DNA-vaurioita ja apoptoosia syöpäsoluissa, ja siksi sitä voidaan käyttää syövän vastaisena strategiana. Koska luonnontuotteet ovat olleet runsas lääkekemikaalien lähde, käytimme tässä tutkimuksessa MTH1--katalysoimaa entsymaattista reaktiota suuren suoritustehona in vitro -seulontamäärityksessä etsiäksemme luonnollisia yhdisteitä, jotka pystyvät estämään MTH1:tä.Ekinakosidi, lääkekasveista johdettu yhdisteCistancheja Echinacea, estivät tehokkaasti MTH1:n katalyyttistä aktiivisuutta in vitro -määrityksessä. Erilaisten ihmisen syöpäsolulinjojen hoitoEkinakosidijohti hapettuneen guaniinin (8-oksoguaniinin) solutason merkittävään nousuun, kun taas solujen reaktiivisten happilajien määrä pysyi muuttumattomana, mikä osoittaa, ettäEkinakosidiesti myös solun MTH1:n aktiivisuutta. Tämän seurauksena echinacoside-hoito aiheutti välittömän ja dramaattisen lisäyksen DNA-vauriomarkkereissa ja G1/S-CDK-inhibiittorin p21 noususäätelyssä, mitä seurasi merkittävä apoptoottinen solukuolema ja solusyklin pysähtyminen syövässä, mutta ei ei-syöpäsoluissa. Yhdessä nämä tutkimukset tunnistivat luonnollisen yhdisteen MTH1-estäjäksi ja viittaavat siihen, että luonnontuotteet voivat olla tärkeä syöpälääkkeiden lähde.

Avainsanat: Ekinakosidi, MTH1, 8-oksoG, DNA-vaurio, apoptoosi, solusyklin pysähtyminen

Cistancheote onsyövän vastainenterveyshyödyt

Napsauta tästä päästäksesi osaan 2

Johdanto

Solujen ja mitokondrioiden nukleosiditrifosfaatti (NTP) ja deoksinukleosiditrifosfaatti (dNTP) -pooli on erilaisten reaktiivisten happilajien (ROS) merkittävä kohde.1–3 Koska DNA-polymeraasien spesifisyys ei ole täydellinen, 4,5 hapettuneita dNTP:itä voidaan liitetään äskettäin syntetisoituun DNA:han aiheuttamaan geneettisiä poikkeavuuksia, ellei niitä korjata.6 Esimerkiksi nukleotidipoolin pääasiallinen hapettunut emäs, 8-oksoguaniini (8-oksoG), voi muodostaa emäsparin sytosiinin ja adeniinin kanssa. Kun se liitetään vastakkaiseen adeniiniin DNA:n replikaation aikana, se voi mahdollisesti aiheuttaa T:A=G:C -transversion,7 joka on yksi yleisimmistä ihmisen syövissä löydetyistä mutaatioista.8,9 Vaikka useimmat hapettuneet vapaat dNTP:t poistetaan nukleotidipoolia desinfioivat entsyymit, aiemmat tutkimukset ovat paljastaneet, että nukleotidipooli on edelleen tärkeä hapettuneiden emästen lähde DNA-molekyyleissä ja merkittävä tekijä oksidatiivisissa DNA-vaurioissa.3,10 tärkein entsyymi nukleotidien desinfioinnissa poolit.15 Siitä huolimatta, jopa nukleotidipoolia puhdistavien entsyymien valvonnassa, merkittävä osa hapettuneista dNTP:istä liitetään DNA:han, ja DNA-molekyyleissä olevat emäkset voivat myös hapettua suoraan ROS:n vaikutuksesta.6 Solut luottavat sitten kehittyneempiin strategioihin, joihin liittyy erilaisia DNA-glykosylaasit, kuten OGG1 ja MUTYH, ja DNA:n korjausprosessit, mukaan lukien emästen poistokorjaus (BER) ja epäsovituskorjaus (MMR), ongelmallisten emästen korjaamiseksi DNA-molekyyleihin.10,16,17 BER a nd MMR korjaa normaalisti useita hapettuneita emäksiä DNA:ssa päivässä ja sillä on siten tärkeä rooli genomin eheyden ja stabiilisuuden suojelemisessa.

Soluissa, jotka ovat kohonneessa oksidatiivisessa stressissä, hapettuneiden nukleotidien lisääntynyt liittyminen DNA:han voi ylittää solujen korjauskapasiteetin ja laukaista DNA-vauriovasteen (DDR).18 Jatkuva DDR-signalointi johtaa solusyklin pysähtymiseen, solujen ennenaikaiseen vanhenemiseen taiapoptoosi, mikä asettaa esteen tuumorin syntymiselle.19 Silti vaikka syöpäsoluilla on erittäin lisääntynyt oksidatiivinen jännitys ja ne tuottavat mahdollisesti tappavan hapettuneiden nukleotidien taakan20, ne voivat selviytyä DDR:hen liittyvästä vanhenemisesta taiapoptoosi.21 Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että MTH1:llä on avainrooli syövän kehittymisessä poistamalla tehokkaasti vaarallisen runsaan 8-oxodGTP:n ja 2-OH-dATP:n kasvainsoluista.22 MTH1 oli todettiin yli-ilmentyneen eri syöpätyypeissä,23–25- ja 8-oksoG-tasot, ja oksidatiivisten DNA-vaurioiden laajuus oli pienempi kasvaimissa kuin ympäröivissä normaaleissa kudoksissa.26–28 Toiminnallisesti MTH1:n yli-ilmentyminen väheni merkittävästi DNA-mutaatioiden määrä, joka havaittiin MMR-puutteellisissa hiiren alkion fibroblasteissa10 ja antoi soluille mahdollisuuden voittaa onkogeenisen Ras-indusoidun solujen ennenaikaisen vanhenemisen ja apoptoosin;29 kun taas MTH1:n suppressio esti syövän kehittymisen OGG{18}}-puutteellisissa hiirissä30 ja edisti ROS-indusoitu DDR ja solujen vanheneminen Ras-transformoiduissa soluissa.3,29,31 Näin ollen, vaikka MTH1:llä on suojaava rooli estämällä ROS-indusoituja mutaatioita terveissä soluissa, näissä tutkimuksissa havaittiin, että MTH1 on erityisen tarpeellinen syntymisen ja eloonjäämisen kannalta. syöpäsoluista. Viimeaikaiset tutkimukset ovat tuottaneet lisää näyttöä MTH1:n roolin tukemiseksi syövän kehittymisessä.31–34 MTH1:n suppressio RNAi:lla tai pienimolekyylisillä estäjillä useissa syöpäsolulinjoissa johti huomattavasti lisääntyneeseen 8-okso d G:n sisällyttämiseen genomiseen DNA:han , mikä johtaa laajoihin DNA-vaurioihin, apoptoottiseen solukuolemaan ja syöpäsolujen eloonjäämisen vähenemiseen.32,33 Hiiren ksenograftitutkimuksissa MTH1:n estäminen tukahdutti tehokkaasti syöpäsolujen kasvua. Tärkeää on, että MTH1:n suppressointi ei vaikuttanut normaalien solujen kasvuun ja eloonjäämiseen, luultavasti siksi, että normaaleissa soluissa on alhaisempi ROS ja siksi niiden eloonjääminen on vähemmän riippuvainen MTH1:stä.32,33 Nämä havainnot viittaavat siihen, että MTH1:n estäminen on lupaava uusi strategia syöpää vastaan.

Luonnontuotteet ovat olleet runsas lääkinnällisten yhdisteiden lähde.35 Monet nykyaikaiset terapeuttiset aineet, mukaan lukien syöpälääkkeet, on johdettu yrtti- tai kasviperäisistä valmisteista.36–39 Silti useilla perinteisillä yrteillä ehdotetaan säilyvän erilaisia ​​terapeuttisia ominaisuuksia. on karakterisoitava, mikä johtuu suurelta osin vaikeuksista hallita niiden koostumusta niiden tehokkuuden ja vaikutusmekanismien yksiselitteisen määrittelemiseksi.40 Tarvitaan uusia lähestymistapoja, jotka mahdollistavat aktiivisten yhdisteiden havaitsemisen ja molekyylimekanismien analyysin. Tässä suhteessa kohdeohjattu korkean suorituskyvyn in vitro -seulonta voi auttaa löytämään mekaanisesti määriteltyjä lääkeyhdisteitä luonnonvaroista. Tässä tutkimuksessa käytimme MTH1--katalysoimaa entsymaattista reaktiota tehokkaana in vitro -testinä etsiäksemme luonnollisia yhdisteitä, jotka voivat estää MTH1:tä. Yllättäen seulonta paljasti senEkinakosidi, luonnontuote, joka tunnetaan parhaiten voimakkaasta antioksidanttiaktiivisuudestaan, pystyy estämään MTH1:tä.

Ekinakosidicistanche-tölkkiinanti-apoptoosi

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

Luonnolliset yrttiyhdisteet ostettiin Yuanye Biological Technology Co.:lta, Shanghaista, Kiinan kansantasavallasta. Kunkin yhdisteen nimi, luettelonumero, Chemical Abstracts Servicen (CAS) rekisterinumero ja puhtaus on lueteltu taulukossa S1. Yhdisteiden kantaliuokset valmistettiin 100-prosenttiseen dimetyylisulfoksidiin (DMSO) (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), ja työliuokset valmistettiin määrityspuskuriin tai täydelliseen soluviljelyalustaan. Vehikkelikontrollina käytettiin samaa liuosta ilman testiyhdistettä, mutta joka sisälsi saman määrän DMSO:ta. (S)-krisotinibi ostettiin Selleck Chemicalsilta, Houston, TX, USA.

in vitro -seulonta

Luonnollisten kasviperäisten yhdisteiden seulomiseen käytetty in vitro entsymaattinen määritys noudatti Gadin et al.32 kuvaamia menetelmiä. Lyhyesti sanottuna yksittäisten yhdisteiden sarjalaimennokset valmistettiin määrityspuskuriin, joka sisälsi 100 mM Tris- asetaatti (pH 8.{11}}), 40 mM NaCl, 10 mM Mg-asetaatti, 0,005 prosenttia Tween 20 ja 1 mM DTT. Seuraavaksi lisättiin 0,5 nM rekombinantti ihmisen MTH1:tä (Abcam, Cambridge, UK), 100 µM dGTP:tä (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ja 0,2 U/ml epäorgaanisia pyrofosfataaseja (Thermo Fisher Scientific) ja levyjä inkuboitiin. levyravistelijassa 1 tunnin ajan huoneenlämmössä. Lopullinen reaktiotilavuus oli 100 µl 96-kuoppalevyllä. Reaktion lopussa lisättiin malakiittivihreää (J&K Scientific, Peking, Kiinan kansantasavalta)41, ja levyjä inkuboitiin huoneenlämpötilassa vielä 15 minuuttia. Absorbanssi aallonpituudella 630 nm mitattiin BioRad 680 -mikrolevylukijalla (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA). Estopitoisuuden (IC50) arvot määritettiin epälineaarisella regressioanalyysillä käyttämällä GraphPad Prism -ohjelmistoa.

soluviljelmä

Ihmisen MG-63 osteosarkooma, SK-HEP-1hepatokarsinooma, MCF7-rintasyöpä, SW480 paksusuolensyöpä, HEK293 alkion munuainen ja hiiren NIH/3T3 fibroblastisolulinjat olivat American Type Culture Collectionista, ja ihmisen normaali maksasolulinja L-O2 ostettiin yhtiöltä KenGen Biotech, Nanjing, Kiinan kansantasavalta. Näitä kennoja pidettiin 37 asteessa kostutetussa ilmakehässä, jossa oli 5 prosenttia CO2:ta, palveluntarjoajien antamien ohjeiden mukaisesti. Näiden solulinjojen käytöstä ei vaadittu instituution arviointilautakunnalta eettistä lausuntoa.

Solunsisäisten {{0}}okso-solujen mittaus Solunsisäiset 8-oksoG-tasot mitattiin värjäämällä Cy3-konjugoidulla avidiinilla.42 Yhteensä 1 × 104 solua kylvetty pyöreän peitinlasin päälle 12-kuoppalevyihin. Seuraavana päivänä soluja käsiteltiin 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM tai 80 μM ekinakosidilla 5 tunnin, 12 tunnin tai 24 tunnin ajan ja kiinnitettiin sitten jäillä. -kylmä metanoli 20 minuuttia, minkä jälkeen inkubointi Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa (TBS) 0,1 prosentin Triton X-100:n (Sigma-Aldrich) kanssa 15 minuuttia. Näytteet blokattiin TBS:ssä 0,1 prosentilla Triton X-100:lla ja 15 prosentilla naudan sikiön seerumia 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa ja värjättiin sitten Cy3--konjugoidulla avidiinilla (0,5 ug/ml) (Rockland Immunochemicals, Limerick, PA, USA) sulkuliuoksessa 1 tunnin ajan 37 asteessa. Pesun jälkeen fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS) 3 kertaa 5 minuutin ajan, peitinlasit suljettiin lasilevyille hyönteissuojalle. Kiinnitysväliaine 4′,6-diamidino-2-fenyyli-indolilla (Vector Laboratories, Burlingame, CA , USA). Kuvat otettiin ja analysoitiin Zeiss LCM 510 konfokaalimikroskoopilla.

Solunsisäisen Rosin mittaus Solunsisäiset ROS-tasot mitattiin virtaussytometrialla käyttämällä solupohjaista ROS-määrityssarjaa (Beyotime Biotechnology, Haimen, Kiinan kansantasavalta). Kuusikuoppalevyillä kasvatettuja soluja käsiteltiin 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM tai 80 μM ekinakosidilla 5 tunnin, 12 tunnin tai 24 tunnin ajan, pestiin kahdesti PBS:llä ja inkuboitiin 10 μM dikloorifluoreseiinidiasetaattia 30 minuuttia 37 asteessa. Sitten solut trypsinoitiin ja analysoitiin FACSCaliber-virtaussytometrillä (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Solunsisäiset ROS-tasot ilmaistiin solujen keskimääräisenä diklooridihydrofluoreseiinin fluoresenssin intensiteetinä. Esitetyt luvut olivat kolmen riippumattoman kokeen keskiarvoja.

Immunofluoresoiva värjäys

Peitelasiilla kasvatettuja soluja käsiteltiin {{0}} μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM tai 80 μM ekinakosidilla 5 tunnin, 12 tunnin tai 24 tunnin ajan ja pestiin sitten kerran PBS:llä ja kiinnitettiin 4 prosenttia paraformaldehydiä PBS:ssä 20 minuutin ajan ja estetty TBS:ssä 0,1 prosentilla Triton X-100:lla ja 15 prosentilla naudan sikiön seerumilla 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Kiinteät solut värjättiin 2 tuntia huoneenlämpötilassa primaarisella vasta-aineella 8-oksoG:tä (hiiren monoklonaalinen anti-8-oksoG, Abcam), 53BP1:tä (kanin anti-53BP1; Bethyl Laboratories, Montgomery) vastaan. , TX, USA) tai aktiivinen kaspaasi-3 (kanin anti-kaspaasi-3, Bioss, Peking, Kiinan kansantasavalta), minkä jälkeen värjäys Alexa-488-konjugoidulla aasin antihiirellä ( Abcam) tai Cy3-konjugoitu vuohen anti-kanin (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA) sekundaarinen vasta-aine 1 tunnin ajan huoneenlämmössä. Pesun jälkeen PBS:ssä 3 kertaa 5 minuutin ajan, peitinlasit suljettiin lasilevyille VECTASHIELD Mounting Mediumissa DAPI:lla (Vector Laboratories). Kuvat on otettu Zeiss LCM 510 konfokaalimikroskoopilla.

pesäkkeiden muodostusmääritys

Päivää ennen käsittelyä solut kylvettiin kuusikuoppaiselle levylle konsentraatiolla 1 x 104 solua kuoppaa kohti. Sitten niitä käsiteltiin 0 μM, 60 μM tai 80 μM ekinakosidilla 7 päivän ajan. PBS:llä pesun jälkeen solut kiinnitettiin jääkylmällä metanolilla ja värjättiin kristalliviolettiliuoksella (Sigma-Aldrich) (0,5 % 25 % metanolissa). Kuvat otettiin levyjen kuivaamisen jälkeen yön yli. Kristalvioletit liuotettiin lisäämällä 70 % etanolia, ja absorbanssi 595 nm:ssä mitattiin BioRad 680 -mikrolevylukijalla. Tiedot analysoitiin GraphPad Prism -ohjelmistolla.

MTT-määritys

Yhtä päivää ennen käsittelyä solut kylvettiin 96-kuoppalevyille pitoisuudella 1 × 104 solua kuoppaa kohti, minkä jälkeen niitä käsiteltiin ekinakosidin sarjalaimennoksilla 24 tunnin tai 48 tunnin ajan tai 60 μM ekinakosidilla 5 tunnin, 12 tunnin ajan. tai 24 tuntia. Elatusaine poistettiin ja solut pestiin PBS:llä ja sitten 20 μl:lla 3-(4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli)-2,{{15} }difenyylitetratsoliumbromidi (MTT) -liuosta (5 mg/ml PBS:ssä, pH 7,2) (Thermo Fisher Scientific) lisättiin kuhunkin kuoppaan. Levyjä inkuboitiin 37 asteessa vielä 4 tuntia. Lopulta MTT-liuos poistettiin ja kuhunkin kuoppaan lisättiin 150 µl DMSO:ta. Levyjä inkuboitiin levyravistelijassa 10 minuuttia ja absorbanssi aallonpituudella 570 nm mitattiin BioRad 680 -mikrolevylukijalla. Jokainen koe suoritettiin kahdesti kolmena rinnakkaisena. Tiedot analysoitiin GraphPad Prism -ohjelmistolla. IC50-arvot määritettiin käyttämällä epälineaarista regressioanalyysiä.

solusyklin analyysi

Kuusikuoppaisten levyjen soluja käsiteltiin 0 μM, 6{{10}} μM tai 80 μM ekinakosidilla 24 tunnin ajan ja kerättiin trypsiinillä (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) , pestiin kahdesti PBS:llä ja kiinnitettiin sitten jääkylmällä etanolilla (70 prosenttia) 2 tunnin ajan -20 asteessa. Kiinteät solut pestiin kahdesti kylmässä PBS:ssä ja suspendoitiin uudelleen 300 µl:aan juuri valmistettua PBS:ää, jossa oli 0,1 prosenttia Triton X-100, 0,2 mg/ml DNaasi-vapaata RNaasi A:ta (Sigma-Aldrich), 10 ug/ml propidiumjodidia ( PI) (Hoffman-La Roche Ltd., Basel, Sveitsi). Sen jälkeen, kun solut oli inkuboitu 37 asteessa pimeässä 20 minuuttia, solut suodatettiin Falcon nailonverkon (BD Biosciences) läpi, ladattiin FAC-SCalibur-virtaussytometriin ja analysoitiin käyttämällä ModFit-ohjelmistoa (BD Biosciences).

DNA-fragmentaatioanalyysi

Kuusikuoppalevyillä kasvatettuja soluja käsiteltiin 0 µM, 60 µM tai 80 µM ekinakosidilla 24 tunnin ajan ja kiinnitettiin jääkylmässä 4-prosenttisessa paraformaldehydissä (Sigma-Aldrich) 20 minuutin ajan. PBS:llä pesun jälkeen solut suljettiin VECTASHIELD Mounting Mediumiin DAPI:lla (Vector Laboratories). Ydinmorfologia kuvattiin Olympus-fluoresoivalla mikroskoopilla. DNA-fragmentoitumisen havaitsemiseksi agaroosigeeleissä DNA uutettiin käyttämällä QIAamp DNA -mikrokittiä (Qiagen NV, Venlo, Alankomaat), ja elektroforeesi suoritettiin 2-prosenttisilla agaroosigeeleillä, jotka sisälsivät 0,1 ug/ml etidiumbromidia.

Apoptoosin analyysi virtaussytometrialla Apoptoottisia soluja tutkittiin käyttämällä Annexin V-FITC Apoptosis-detektiopakkausta (Bestbio, Shanghai, Kiinan kansantasavalta) noudattaen valmistajan ohjeita. 96-kuoppalevyillä kasvatettuja soluja käsiteltiin 0 µM, 15 µM, 30 µM, 60 µM, 80 µM tai 160 µM ekinakosidilla 2 tunnin, 5 tunnin, 12 tunnin tai 24 tunnin ajan, pestiin kahdesti PBS:llä ja suspendoitiin sitten uudelleen sitoutumispuskuriin. Seuraavaksi lisättiin peräkkäin 5 µl anneksiini V-FITC:tä ja 5 µl PI:tä (Roche), ja soluja inkuboitiin 15 minuuttia pimeässä huoneenlämpötilassa. Solut ladattiin FACSCalibur-virtaussytometriin (BD Biosciences), ja tiedot analysoitiin käyttämällä Cell Quest -ohjelmistoa (BD Biosciences).

Western blot -analyysi

Kuusikuoppalevyillä kasvatettuja soluja käsiteltiin 0 µM, 6{{10}} µM tai 80 µM ekinakosidilla 5 tunnin, 12 tunnin tai 24 tunnin ajan, pestiin kahdesti PBS:llä ja kaavittiin pois levyltä käyttämällä 100 µl radioimmunosaostuspuskuria (150 mM NaCl, 1,0 % IGEPAL CA-630, 0,5 % natriumdeoksikolaattia, 0,1 % natriumdodekyylisulfaattia ja 50 mM Tris, pH 8,0) (Sigma-Aldrich), joka sisältää 1 mM fenyylimetaanisulfonyylifluoridia. Näytteitä sentrifugoitiin 12,000 × g 20 minuuttia 4 asteessa. Proteiinipitoisuudet supernatanteissa määritettiin Bradford-reagenssilla (Dingguo, Changchun, Kiinan kansantasavalta). Näytteitä denaturoitiin 95 asteessa 10 minuuttia ja erotettiin 12-prosenttisella natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesigeelillä. Elektroforeesin jälkeen proteiinit siirrettiin polyvinylideenifluoridikalvoille (Millipore), minkä jälkeen blokattiin Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa Tween 20:llä (10 mM Tris, pH 7,5; 100 mM NaCl; 0,1 prosenttia Tween 20), joka sisälsi 5 prosenttia (w/v) rasvatonta maitoa 1 tunnin ajan huoneenlämmössä. Blotit tutkittiin primaarisilla vasta-aineilla p21:tä (Abcam), poly(ADP-riboosi)polymeraasia (Bioss) tai aktivoitua kaspaasia-3 (Bioss) vastaan, mitä seurasi piparjuuriperoksidaasilla konjugoidut sekundaariset vasta-aineet (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Signaalit kehitettiin käyttämällä tehostettua kemiluminesenssia Western blot -tunnistussarjaa (Transgen Biotech, Changchun, Kiinan kansantasavalta). Kokeet toistettiin kolme kertaa.

Ekinakosidicistanche-tölkkiinanti-apoptoosijaantioksidantti

Mitokondrioiden mittaus

kalvopotentiaali

Mitokondrioiden kalvopotentiaali mitattiin käyttämällä JC{{0}}-väriä (Biotechnology) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kuusikuoppalevyillä kasvatettuja soluja käsiteltiin 0 µM, 60 µM tai 80 µM ekinakosidilla 5 tunnin, 12 tunnin tai 24 tunnin ajan, pestiin kahdesti PBS:ssä ja inkuboitiin sitten JC-1:n kanssa 20 minuuttia. Kuvat on otettu Olympus-fluoresoivalla mikroskoopilla.

Tilastollinen analyysi

Tilastollinen analyysi suoritettiin GraphPad Prism Softwarella. Merkittävyys laskettiin käyttämällä yksisuuntaista varianssianalyysiä, ja P0.05 katsottiin tilastollisesti merkitseväksi. Tulokset ilmaistiin keskiarvona ± standardipoikkeama.

Ekinakosidicistanche-tölkkiinanti-apoptoosija parantaa vastustuskykyä