Osa 1: Ekinakosidi lisää siittiöiden määrää rotilla kohdistamalla hypotalamuksen androgeenireseptorin

Yhteystiedot: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Sähköposti:audrey.hu@wecistanche.com

Zhihui Jiang1,2, Bo Zhou2, Xinping Li2, Gordon M. Kirby3 ja Xiaoying Zhang1,2

Pls klikkaa tästä päästäksesi osaan 2

Miesten hedelmättömyys on merkittävä terveysongelma, jonka arviolta 4,2 prosenttia miesten hedelmättömyydestä on maailmanlaajuisesti. Varhainen työmme osoitti senCistanche-uutteetsuojaa hiirten siittiöiden vaurioilta ja siltäekinakosidi(ECH) on yksi tärkeimmistä aktiivisista komponenteista. Tässä raportoimme ECH:n, luonnontuotteen, joka kumoaa oligoastenospermiaa tai suojaa sitä vastaan, tärkeä rooli rotilla. ECH määritettiin HPLC:llä, siittiöiden määrä ja laatu arvioitiin ja hormonitasot määritettiin radioimmunosorbenttimäärityksellä. ECH alensi androgeenireseptorin (AR) ja keskeisten steroidogeenisiin liittyvien geenien tasoja Western blot - ja qPCR-analyysillä määritettynä. ECH:n ja AR:n välinen vuorovaikutus arvioitiin epäsuoralla ELISA:lla ja molekyylitelakolla. Tulokset osoittavat, että ECH yhdistettynä hypotalamuksen AR:hen Met-894 ja Val-713 taskussa estää AR:n siirtymisen sytoplasmasta hypotalamuksen ytimiin. Vaikka negatiivinen palaute sukupuolihormonien säätelystä estettiin, positiivista palautetta stimuloitiin lisäämään luteinisoivan hormonin ja testosteronin eritystä, mikä lisää siittiöiden määrää. Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että ECH estää AR-aktiivisuutta hypotalamuksessa siittiöiden määrän lisäämiseksi ja rottien oligoastenospermialta suojaamiseksi.

Cistanche

Testosteronin tuotantoa kivessoluissa säätelee voimakkaasti hypotalamus-aivolisäke-gonadaalinen akseli (HPG) muodostamalla homeostaattisen palautesilmukan1. Hypotalamuksen erittämä gonadotropiinia vapauttava hormoni (GnRH) voi stimuloida luteinisoivan hormonin (LH) eritystä aivolisäkkeestä, mikä edelleen stimuloi testosteronin tuotantoa kivesten Leydig-soluissa. Testosteronia biosyntetisoi joukko steroidogeenisiä entsyymejä. Yhtenä tärkeimmistä reiteistä steroidogeeninen akuutti säätelyproteiini (StAR) voi kuljettaa kolesterolia solunsisäisistä lähteistä mitokondrioihin2, missä se altistuu kolesterolin sivuketjun pilkkoutumisentsyymille (CYP11A1), 3 -hydroksisteroididehydrogenaasille (HSD3), { {10}}hydroksylaasi (CYP17A1) ja 17 -hydroksisteroididehydrogenaasi (HSD 17 ), jotka katalysoivat kolesterolin muuttumista testosteroniksi3,4. Testosteroni syöttyy sitten negatiivisesti takaisin HPG-elementtiin ja säätelee edelleen LH:n eritystä annoksesta riippuvaisella tavalla.

Testosteronin vaikutus HPG-akselin takaisinkytkentäsilmukkaan tapahtuu sitoutumalla androgeenireseptoriin (AR), joka löytyy sekä hypotalamuksesta että aivolisäkkeestä5. Hiirillä AR:n ablaatio ja minimaalinen testosteronin tuotanto lisäävät LH:n ja follikkelia stimuloivan hormonin (FSH) tasoja6, mikä viittaa siihen, että AR osallistuu negatiivisen syöttösilmukan säätelyyn. Testosteronisignaloinnin klassinen genominen mekanismi tapahtuu, kun testosteroni diffundoituu soluun ja sitoutuu AR:hen. Tämä ligandi-reseptorikompleksi siirtyy sitten ytimeen, jossa se sitoutuu androgeenivaste-elementteihin (ARE:t) testosteronille reagoivien geenien säätelyalueilla muuttaakseen niiden translokaatiota. Testosteroni indusoi myös steroidihormonien ei-klassisen toimintareitin, jolle on ominaista nopeat tapahtumat, jotka johtavat sytosolisten signalointikaskadien aktivoitumiseen, jotka normaalisti laukaisevat kasvutekijät7,8. Sekä klassiset että ei-klassiset testosteronireitit edistävät spermatogeneesin ja hedelmällisyyden ylläpitämistä. AR:n toiminta on kuitenkin tärkeämpi klassisessa reitissä, koska testosteroni parantaa siittiöiden laatua.

Ekinakosidi(ECH) on yksi bioaktiivisista komponenteista, jotka on johdettu Echinacea9- ja -lääkekasvilajeistaCistanche10. Laajan farmakologisen toiminnan kirjolla echinacea-uutteita ovat 1Research Center of Modern Biotechnology, School of Biotechnology and Food Engineering, Anyang Institute of Technology, Anyang, Henan, 455000, Kiina. 2 College of Veterinary Medicine, Northwest A & F University, Yangling, Shaanxi, 712100, Kiina. 3 Biolääketieteen laitos, Ontario Veterinary College, Guelphin yliopisto, Guelph, Ontario, N1G 2W1, Kanada. Kirjeenvaihto ja materiaalipyynnöt tulee osoittaa osoitteeseen XZ

yksi suosituimmista kasviperäisistä ravintolisistä Euroopassa ja Yhdysvalloissa, mikä johtuu pääasiassa niiden antioksidanttisista ominaisuuksista11 ja kyvystään ehkäistä flunssaa12. Mielenkiintoista,Cistanche-uutteet ja ECH:ta on perinteisesti käytetty tonic-aineena parantamaan lisääntymishäiriöitä ja lisäämään miesten seksuaalista aktiivisuutta perinteisessä kiinalaisessa lääketieteessä10. Jotkut OTC-tuotteetCistanche uutto on kehitetty ravitsevina lisäravinteina, ja ne ovat saamassa suosiota Kiinan ja joidenkin muiden Aasian maiden luontaistuotemarkkinoilla (China Food and Drug Administration)13. ECH:n toiminnan taustalla olevat mekanismit ovat kuitenkin epäselviä.

Miesten hedelmättömyys on merkittävä terveysongelma, jonka arviolta 4,2 prosenttia miesten hedelmättömyydestä maailmanlaajuisesti on14. Miesten hedelmättömyyden diagnoosi perustuu tällä hetkellä siittiöiden laadun tutkimukseen, joka sisältää siemenparametrien, kuten siittiöiden pitoisuuden, liikkuvuuden ja morfologian, analyysin15. Estrogeenia jäljittelevä bisfenoli A (BPA) on laajalle levinnyt ympäristösaaste, jonka vaikutusta miesten hedelmällisyyteen on tutkittu useissa eläinlajeissa ja ihmisissä16. BPA häiritsee hypotalamus-aivolisäke-sukurauhasten akselia, estää kivesten steroidogeenisten entsyymien ilmentymistä ja testosteronin synteesiä urospennuilla17 aiheuttaen hypogonadotrooppisen hypogonadismin tilan18. Tässä tutkimuksessa tutkimme ECH:n vaikutuksia siittiöiden laatuun ja hormonitasoihin. Lisäksi BPA valittiin siittiövaurion malliaineeksi tutkimaan edelleen ECH:n suojaavaa vaikutusta huonoa siittiöiden laatua vastaan.

Cistanche-uutteet

Tulokset

ECH lisää siittiöiden määrää. Siittiöiden lukumäärä cauda-lisäkivessä, siittiöiden elinkelpoisuus ja siittiöiden liikkuvuus on esitetty taulukossa 1. Käsittely 80 mg/kg ECH:lla ja 15 mg/kg testosteronipropionaatilla (TP) lisäsi merkittävästi lisäkives siittiöiden määrää. Siittiöiden elinkelpoisuudessa ja liikkuvuudessa ei kuitenkaan ollut merkittävää eroa.

ECH lisää testosteroni- ja LH-tasoja seerumissa, aivokudoksessa sekä aivolisäkkeessä ja kiveksessä. ECH-hoito lisäsi huomattavasti LH-tasoja seerumissa, enkefalonissa sekä aivolisäkkeessä ja kiveksessä (kuvio 1A). ECH(H)-ryhmässä LH-tasot nousivat merkitsevästi 11--kertaisesti seerumissa, 14-kertaisesti aivolihasessa ja aivolisäkkeessä ja 12--kertaisesti kiveksessä. Testosteroni nousi merkittävästi 1,5-kertaiseksi ja 1{10}}-kertaiseksi enkefalonissa sekä aivolisäkkeessä ja kiveksessä, mutta ei seerumissa ECH(H)-hoidon jälkeen. TP-hoidon jälkeen testosteronitasot nousivat merkittävästi 1,6-, 1,8- ja 1{16}}-kertaisiksi seerumissa, enkefalonissa sekä aivolisäkkeessä ja kiveksessä.

ECH lisäsi steroidogeenisen entsyymin geenin ilmentymistä. ECH lisäsi merkittävästi keskeisten steroidogeenisten entsyymien ilmentymistä kiveksessä (kuvio 1B). CYP11A1:n, CYP17A1:n, HSD3 1/2:n ja HSD17:n mRNA-tasot ECH(H)-ryhmässä nousivat yli 3--kertaiseksi, kun taas StAR-mRNA:n tasot eivät osoittaneet merkittäviä eroja kaikissa ECH-hoidoissa. (p > 0.05). TP ei merkittävästi muuttanut CYP11A1:n, CYP17A1:n, HSD3 1/2:n ja HSD17:n ilmentymistä. Tämä näkyy kattavassa lämpökartta-analyysissä ECH:n vaikutuksesta steroidogeenisten entsyymien ilmentymiseen, mikä osoittaa, että ECH lisäsi merkittävästi CYP11A1:n, CYP17A1:n, HSD3 1/2:n ja HSD17:n ja erityisesti HSD3 1/ mRNA-tasoja. 2 (kuvio 1C).

ECH voi ylittää veri-aivoesteen ja vähemmässä määrin veri-kivesesteen. Androgeenin takaisinkytkentäsilmukan arvioimiseksi HPG-akselilla ECH:n kykyä päästä hypotalamukseen arvioitiin sarjassa PK-tutkimuksia. ECH-pitoisuudet havaittiin hypotalamuksessa 12 tunnin kerta-annoksen oraalisen 30 mg/kg ECH:n jälkeen, ja ECH osoitti huomattavaa hypotalamuksen penetranssia keskimääräisen hypotalamuksen/plasma-suhteen ollessa 33,92 prosenttia (kuvio 2A). T1/2-arvot olivat 2,61 ± 0,42 h ja 1,88 ± 0,22 h plasmassa ja hypotalamuksessa, vastaavasti (kuvio 2B). Kuitenkin erittäin rajoitettu ECH:n pääsy kivekseen havaittiin käyttämällä HPLC:tä. ECH:n pitoisuudet kiveksessä olivat 0.083 ug/ml, 0,043 ug/ml ja 0,028 ug/ml 0,5 tunnin, 1 tunnin ja 1,5 tunnin kuluttua. hoitoon.

ECH vähentää hypotalamuksen AR-translokaatiota ytimeen. ECH:n vaikutuksen testaamiseksi AR-translokaatioon AR:n ilmentyminen kiveksen ja hypotalamuksen sytoplasmassa ja tumassa määritettiin käyttämällä Western blot -analyysiä. Kuten kuviossa 3A esitetään, ECH vähensi AR-proteiinia hypotalamuksen ytimissä kerta-arvoisesti verrattuna kontrolliryhmään. Hoito enzalutamidilla, AR:n estäjällä, alensi AR-proteiinin tasoa hypotalamuksen ytimissä 48--kertaisesti. Erityisesti sytoplasminen AR oli korkeampi ECH-hoidolla ja enzalutamidihoidolla kuin kontrolleilla, mikä viittaa siihen, että ECH estää AR-kuljetuksen sytoplasmasta hypotalamuksen ytimeen. Kuten odotettiin, ECH ei estä AR:n kuljetusta sytoplasmasta kiveksessä olevaan tumaan (kuvio 3B).

ECH lisäsi HPG-akseliin liittyvien geenien ilmentymiä. ECH lisäsi merkittävästi LH:n, LHR:n, GnRH1:n ja Gnrhr:n ilmentymiä enkefalonin ja aivolisäkkeen sekoituspoolissa, mutta GnRH1-tasoissa ei ollut merkittävää eroa TP-hoidon jälkeen. Lämpökartta-analyysi osoittaa, että GnRH 1:n ja LH:n ilmentymät olivat korkeimmat HPG-akseliin liittyvien geenien joukossa.

Kuva 1. ECH:n vaikutus LH:n, testosteronin ja tärkeimpien steroidogeenisten entsyymien tasoihin. Huomautus: (A) LH-tasot seerumissa, enkefalonissa sekä aivolisäkkeessä ja kiveksessä (mIU/ml, keskiarvo ± SD);

T-tasot seerumissa, enkefalonissa sekä aivolisäkkeessä ja kiveksessä (ng/ml, keskiarvo ± SD); (B) tärkeimpien steroidogeenisten entsyymien ilmentyminen;

(C) erilaisten steroidogeenisten entsyymien mRNA-ilmentymisen hierarkkinen klusterointi kiveksessä. Vihreä, vihreä-punainen ja punainen värit edustavat matalaa,

keskimääräinen ja korkea runsaus, vastaavasti, n=7. a,b,c Eri kirjaimet osoittavat tilastollisesti erilaisia ​​ryhmiä (p <>

Kuva 2. ECH:n jakautuminen ja farmakokineettiset parametrit hypotalamuksessa. Huomautuksia: (A) hypotalamus/plasma-suhteet ( prosentti ) laskettiin plasman ja hypotalamuksen altistumisesta ECH:lle (pitoisuus) 0,5 h, 1.0 h, 1,5 h, 2.{101} {8}} h, 2,5 h, 3.0 h, 6.0 h, 9.0 h ja 12.0 h oraalisen annon jälkeen. (B) ECH:n farmakokineettiset (PK) parametrit plasmassa ja hypotalamuksessa. T1/2, puoliintumisaika; Cmax, huippupitoisuus; Vz/F, näennäinen jakautumistilavuus; MRT, keskimääräinen retentioaika; AUC, pinta-ala pitoisuus-aikakäyrän alla.

AR on ECH:n kohde. ECH:n ja AR:n välisten suhteiden vahvistamiseksi ECH-ovalbumiini (ECH-OVA) syntetisoitiin onnistuneesti (kuvio 5A, B). ECH-OVA:n molekyylipaino on suurempi kuin OVA:n, joten niillä on erilaiset liikkuvuusnopeudet (kuva 5A), ja ECH-OVA:n absorbanssihuippu on ECH:n ja OVA:n välillä (kuva 5B),

Cistanche-uutteet

Kuva 3. ECH:n vaikutus AR-kuljetukseen kiveksessä ja hypotalamuksessa. Huomautuksia: (A) ECH:n vaikutus AR-kuljetukseen hypotalamuksessa. AR-proteiinitasot määritettiin Western blot -analyysillä, ja pylväät edustavat laminiini B:ksi normalisoidun tuma-AR:n ja GAPDH:ksi normalisoidun sytoplasmisen AR:n densitometristä kvantifiointia. Jokainen arvo edustaa kuuden riippumattoman kokeen keskiarvoa ± SD. a,b,c Palkkien yläpuolella olevat kirjaimet osoittavat tilastollisesti erilaisia ​​ryhmiä (p < 0.05);="">B) ECH:n vaikutus AR-kuljetukseen kiveksessä.

mikä viittaa siihen, että ECH konjugoitiin onnistuneesti OVA:han. Epäsuorat ELISA-tulokset (kuvio 5C) osoittavat, että anti-AR-vasta-aine kykenee havaitsemaan AR-proteiinia, joka on läsnä ECH-OVA:ta sisältävissä kuopissa (osoituksena anti-OVA-vasta-aine), mikä viittaa siihen, että ECH voi sitoutua AR-proteiiniin.

ECH yhdistyy Met{0}} ja Val-713 AR-taskuun. Yhdiste ECH kiinnitettiin AF2-kohtaan ihmisen AR:n pinnalla, ja ECH:n ja AR:n teoreettinen sitoutumismuoto esitettiin kuviossa 5D. Yhdiste ECH otti käyttöön kompaktin konformaatiositoutumisen ihmisen AR:n taskussa. ECH:n kaksi fenyyliryhmää sitoutuvat AR-taskun hydrofobiseen domeeniin ja ylläpitävät läheisiä hydrofobisia kontakteja tähteiden Leu-712, Val-716, Met-734, Ile-737 kanssa. , Met-894 ja Ile-898, kun taas ECH:n kaksi muuta puolta sijaitsivat taskun sisäänkäynnissä ja ottivat vain muutaman kosketuksen. Yksityiskohtainen analyysi osoitti, että sekä Met-894 (sidoksen pituus: 2,4 Å) että Val-713 (sidoksen pituus: 2,7 Å) muodostivat vetysidoksia ECH:n hydroksi1-ryhmien kanssa, mikä oli tärkein vuorovaikutus ECH:n välillä ja ihmisen AR.

ECH vaimentaa BPA:n aiheuttamia lisääntymisvaurioita. ECH:n vaikutuksen tutkimiseksi lisääntymisvaurioihin tutkittiin siittiöiden laatua sekä sukupuolihormonien ja steroidogeenisten entsyymien tasoja BPA-indusoiduissa hiirissä. Kuten kuviossa 6 esitetään, BPA-hoito vähensi merkittävästi siittiöiden määrää ja siittiöiden liikkuvuutta 26,5 prosentilla ja 39,2 prosentilla, vastaavasti. ECH:n antaminen esti siittiöiden määrän ja siittiöiden liikkuvuuden vähenemisen 35,5 prosentilla ja 30,1 prosentilla. BPA:n antaminen johti myös LH:n ja T:n erityksen merkittävään laskuun, ja ECH nosti huomattavasti LH:n ja T:n tasoja 24,1 prosentilla ja 18,3 prosentilla, verrattuna pelkkään BPA-hoitoon (kuvio 6A, B). StAR:n, CYP17A1:n, 3 -HSD:n ja 17 -HSD:n mRNA-tasot BPA-ECH-hoidossa lisääntyivät merkittävästi verrattuna BPA-hoitoon (kuvat 6C, D).

Kuva 4. Muutokset HPA:han liittyvässä geeniekspressiossa ECH-hoidon jälkeen. Huomautuksia: (A–D) pylväät edustavat LH:n, LHr:n, Gnrh 1:n ja Gnrhr:n mRNA-tasoja enkefalonissa ja aivolisäkkeessä. a,b,c Palkkien yläpuolella olevat kirjaimet osoittavat tilastollisesti erilaisia ​​ryhmiä (p < 0.05).="" (e)="" eri="" steroidogeenisten="" entsyymien="" mrna-ilmentymisen="" hierarkkinen="" klusterointi.="" vihreä,="" vihreä-punainen="" ja="" punainen="" värit="" edustavat="" alhaista,="" keskisuurta="" ja="" suurta="" runsautta,="" vastaavasti,="" n="7." kontrolli="" (käsitelty="" normaalilla="" suolaliuoksella="" 10="" ml/kg),="" ech(l)="" (käsitelty="" ech:lla="" 5="" mg/kg),="" ech(m)="" -ryhmä="" (käsitelty="" ech:lla="" 20="" mg/kg),="" ech(h)="" (käsitelty="" ech="" 80:lla)="" mg/kg),="" tp="" (käsitelty="" tp:llä="" 15="">