Ottaa yhteyttä:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Imane Bensaata, Blaise Robin3, Joeille Perez', Yann Salemkour, Anna Chipont, Marine Camus, Mathilde Lemoine', Lea Guyonnet', Helene Lazareth', Emmanuel Letavernier, Carole Henique', Pierre-Louis Tharaux' ja Olivia Lenoir'

"Université de Paris, PARCC, Inserm, Paris, Ranska; ja Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cite, Pariisi, Ranska

Proteinurian vahva ennustearvo kroonisissa glomerulopatioissa on vakiintunut, samoin kuin angiotensiini ll:n patogeeninen rooli glomerulussairauden etenemisen edistämisessä, johon liittyy muuttunut glomerulussuodatuseste, podosyyttivaurio ja glomerulusten arpeutuminen. Täällä havaitsimme, että krooninen angiotensiini Il:n aiheuttama hypertensio esti autofagian virtausta hiiren glomeruluksissa. Atg5:n (geeni, joka koodaa proteiinia, johon liittyy autofagia) deleetio spesifisesti podosyytissä johti kiihtyneeseen angiotensiini I:n aiheuttamaan podosytopatiaan, korostuneeseen albuminuriaan ja glomeruloskleroosiin. Tämä osoittaa, että autofagia on keskeinen suojamekanismi podosyytissä tässä tilassa. Angiotensiini-Il:n aiheuttama kalpaiiniaktiivisuus podosyyteissä estää autofagian virtausta. Podosyytit hiiristä, joilla oli endogeenisen kalpaiini-inhibiittorin kalpastatiinin siirtogeeninen ilmentyminen, osoittivat korkeampaa podosyyttiautofagiaa lähtötasolla, joka oli resistentti angiotensiini II -riippuvaiselle estämiselle. Myös jatkuva autofagia kalpastatiinin kanssa rajoitti podosyyttivaurioita ja albuminuriaa. Nämä havainnot viittaavat siihen, että hypertensiolla on patogeenisiä vaikutuksia glomerulaariseen rakenteeseen ja toimintaan, osittain kalpaiinien aktivoitumisen kautta, mikä johtaa podosyyttien autofagian estoon. Nämä havainnot paljastavat alkuperäisen mekanismin, jolla angiotensiini Il-välitteinen verenpainetauti estää autofagiaa kalsium-indusoidulla kalpaiinin kerääntymisellä, jolla on patogeenisiä seurauksia, jos kalpastatiiniaktiivisuus aiheuttaa epätasapainoa. Siten kalpaiinivälitteisen autofagian vähenemisen estäminen voi olla lupaava uusi terapeuttinen strategia nefropatioille, jotka liittyvät korkeaan reniini-angiotensiinijärjestelmän aktiivisuuteen.

Cistanchedeserticola estäämunuainensairaus

Käännöslausunto

Ottaen huomioon autofagian ratkaisevan roolin kehityksessämunuainensairaudet, autofagian farmakologinen modulaatio saattaa olla lupaava strategia useiden munuaissairauksien ehkäisyssä ja hoidossa. Samanaikaisesti kalpaiiniaktiivisuuden yliaktivaatiolla podosyyteissä havaittiin olevan haitallisia vaikutuksia podosyyttien toimintaan, kun taas sen haitallisia vaikutusmekanismeja ei tunnistettu. Tässä tarjoamme todisteita siitä, että kalpaiini yhdistää angiotensiini Il:n haitallisen toiminnan haitalliseen autofagian estoon podosyyteissä ja ehdottaa, että kalpaiinin esto voisi olla lupaava terapeuttinen kohde podosyyttisairauksille osittain podosyyttiautofagian ylläpitämisen kautta.

Hypertensio on diabeteksen jälkeen toiseksi suurin syy etenemiseenkrooninenmunuainensairaus-ja vaatimatonkin verenpaineen nousu on itsenäinen riskitekijä loppuvaiheen munuaissairaudelle. Yhä useammat kokeelliset tutkimukset ovat korostaneet podosyyttien merkitystä niiden kehityksessämunuainenvahinkoa. Podosyyttien progressiivinen menetys ja mikrovaskulaariset muutokset ilmenevät varhain, kun munuaisten toiminta heikkenee kokeellisessa hypertensiivisessä nefropatiassa. Potilailla elävien podosyyttien virtsaan erittymisen osoitettiin olevan herkkä ja spesifinen preeklampsian markkeri, ja munuaiskleroosia sairastavilla potilailla oli merkittävästi pienempi glomerulaaristen podosyyttien tiheys kuin munuaisten luovuttajilla. Lisäksi angiotensiini II:n (Angel) patogeeninen rooli munuaiskerässairauden etenemisen edistämisessä on vakiintunut, ei vain hypertensiivisissä tiloissa, vaan myös useissa glomerulaarisissa sairauksissa.

Glomerulaarinen hypertensio johtaa glomerulusten kapillaarien venymiseen, endoteelin vaurioitumiseen ja kohonneeseen glomerulusten proteiinisuodatukseen, mikä aiheuttaa glomerulusten kollapsia ja glomeruloskleroosia. Sillä on myös suora vaikutus glomerulaarisiin rakenteisiin aiheuttaen signaalin säätelyvasteita, joiden tarkoituksena on kompensoida. Aktivoitu systeeminen ja paikallinen reniini-angiotensiini-aldosteronijärjestelmä (RAAS) edistää mesangiaalista hyperplasiaa ja verisuonten läpäisevyyden tekijöiden synteesiä. Samanaikaisesti podosyytit osoittavat kalsiumsignalointia ja muokkaavat muotoaan AnglI tyypin 1 reseptorin (AT1) suhteen-28Näistä stimulaatiosta riippuvaisista adaptiivisista mekanismeista24-28 tulee pitkällä aikavälillä sopeutumattomia, mikä lopulta johtaa glomeruloskleroosiin. AT1 välittää merkittävää RAAS-osuutta verenpaineeseen sekä suolan ja veden homeostaasiin. Angiotensiinia konvertoivan entsyymin estäjiä ja AT1-salpaajia käytetään kliinisesti potilaiden verenpainetaudin ja sydämen vajaatoiminnan hoitoon. Mielenkiintoista on, että molemmat salpaajat osoittavat myös suojaavaa vaikutustamunuainentoiminto.

Autofagian osoitettiin olevan välttämätön solujen homeostaasin ylläpitämiselle, erityisesti postmitoottisissa ja varsinkin podosyyteissä.{0}} Autofagia on cll9olysosomaaleihin liittyvä pitkäikäisten sytoplasmaproteiinien ja toimintahäiriöisten organellien hajoamisjärjestelmä55, ja se sisältää proteiinien ja organellien sekvestroinnin. autofagosomeissa. Autofagosomien muodostuminen riippuu useiden geenien, mukaan lukien Mapllc3a/b, Berlin 1 ja Atgs, induktiosta. On yhä enemmän todisteita siitä, että autofagisen reitin säätelyhäiriöt ovat osallisena patogeneesissä.munuainenikääntymistä ja useitamunuainensairaudet, kuten akuutti munuaisvaurio, polykystinen munuaissairaus, ikääntyminen ja diabeettinen nefropatia.

Autofagian säätely podosyyteissä, fysiologinen ja ennen kaikkea patologinen, ei ole hyvin tunnettu. Osoitimme äskettäin, että podosyyttien autofagia on riippumaton rapamysiinin (mTOR) säätelyn mekaanisesta kohteesta fysiologisissa olosuhteissa, mikä tekee tästä solutyypistä poikkeuksen. AT1-aktivaatio stimuloi proteiinisynteesiä ja proteiinin vaihtuvuutta soluissa. Näin ollen päätimme, että RAAS: n aktivaatio voi myös vaikuttaa proteiinin vaihtuvuuden stimulaatioon ja proteostaasiin.

Tässä tutkimuksessa keskityimme AnglI-signaloinnin rooliin podosyyttien autofagian säätelyssä. Tunnistamme kalsiumaktivoidut proteaasit kalpaiinit, jotka välittävät AnglI:n kroonista estävää vaikutusta podosyyttien autofagiaan. Lisäksi havaitsimme, että endogeeninen kalpaiini-inhibiittori kalpastatiini pystyi estämään AngI-riippuvaisen autofagian eston ja podosyyttivaurion verenpainetaudin aikana.

Nämä havainnot paljastavat alkuperäisen mekanismin, jossa AnglI-välitteinen verenpainetauti estää autofagiaa kalsium-indusoidulla kalpaiinin kerääntymisellä, jolla on patogeenisiä seurauksia kalpastatiiniaktiivisuuden epätasapainossa.

MENETELMÄT

Eläimet

Tohtori E. Letavernier tarjosi ystävällisesti kalpastatiinisiirtogeenisiä (CST18) hiiriä. Hiiret, joilla oli podosyyttispesifinen Atg5-häiriö) luotiin aiemmin kuvatun geenin (Nphs2.cre Atg5'o) mukaisesti risteyttämällä Nphs2.cre-hiiret Ag5lxlomice5:n kanssa C57BL6/J-taustalla. Nphs2.cre Atg5'oxlox-hiiret ja kontrollipoikue-urokset Tässä tutkimuksessa käytettiin 10 - 12 viikon ikäisiä. Hypertensiivinen malli indusoitiin AnglI:n (Sigma-Aldrich, A9525) sc-infuusiolla annoksella 1 ug/kg/min 4 - 6 viikon ajan osmoottiset minipumput (Alzet Corp, malli 2006). Pumput istutettiin selkään lapaluiden ja lantion väliin. Hiiret saivat suolalisää (3 % NaCl) ruoassa. Atgsloxilox(villityypin [WT])-hiiriä käytettiin kontrollina Kaikki tutkimukset. Deoksikortikosteroniasetaatti (DOCA) -suolan osalta nefronien pelkistysmallilla aikuisille uroshiirille tehtiin yksipuolinen vasemmanpuoleinen nefrektomia. Kaksi viikkoa munuaisten poiston jälkeen he saivat DOCA-pellettejä 21-day release (Innovative Research of America) -istutuksella sc. Toinen pelletti istutettiin 3 viikkoa ensimmäisen implantin jälkeen saivat 0,9 prosenttia NaCl:a juomaveteen ad libitum ja kuolivat 6 viikon DOC:n annon jälkeen.6 Kokeet suoritettiin Ranskan eläinlääkintäohjeiden ja Euroopan yhteisön eläinkoekäyttöön laatimien ohjeiden mukaisesti (L358-86/609EEC). ja ne ovat Ranskan tutkimusministeriön ja paikallisen yliopiston tutkimuksen eettisen komitean (APAFIS-7646 ja -22373) hyväksymiä.

Primaarinen podosyyttiviljelykoe

Erilaistuneita primaarisia podosyyttejä viljeltiin aiemmin kuvatulla tavalla./Lyhyesti sanottuna vasta eristetty munuaiskuori sekoitettiin ja pilkottiin kollagenaasi I:llä (Gibco, {{0}}) Roswell Park Memorial Institute 1640:ssa (Life Technologies,{{2). }}). Kudokset kuljetettiin sitten 70 μm:n ja 40 μm:n solusiivilä (BD Falcon, 352340 ja 352350) läpi. Glomerulit, jotka tarttuvat 40 um:n solusihtiin, poistettiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS; Life Technologies, 10010023) sekä 0,5 prosentilla naudan seerumialbumiinilla (Eurobio, HALALB07-65), joka injektoitiin paineen alaisena ja pestiin sitten kahdesti. PBS:ssä. Juuri eristettyjä munuaiskeräsiä maljattiin 6-kuoppamaljoille Roswell Park Memorial Institute 1640:ssä (Gibco, 61870036) täydennettynä 10 prosentilla vasikan sikiön seerumilla ja 1 prosentilla penisilliiniä/streptomysiiniä (Life Technologies, 15140122), jotta podocyyteistä pääsisi eroon. ja kasvaa. Podosyyttien rikastuminen varmistettiin Western blot -analyysillä kuten aiemmin (lisäkuva S1). Podosyyttejä viljeltiin bafilomysiini Al:n (100 nmol/, Sigma-Aldrich, B1793) poissa tai läsnä ollessa 4 tuntia. Immunofluoresenssikokeita varten primaariset podosyytit maljattiin 4 levyn etiketeille (Dutcher, 055071). Podosyytit kiinnitettiin sitten 4-prosenttisessa paraformaldehydissä 10 minuutin ajan ja käsiteltiin immunofluoresenssia varten.

Kalpaiinin aktiivisuusmääritys

Solunsisäinen kalpaiiniaktiivisuus määritettiin primaarisissa podosyyteissä, kuten aiemmin on kuvattu. Yhteensä 100,000 solua viljeltiin 24-kuoppakudosviljelymaljoissa Roswell Park Memorial Institute 1640:ssä, johon oli lisätty 10 prosenttia vasikan sikiön seerumia ja 1 prosenttia penisilliiniä/streptomysiiniä. Ilmoitetun viljelyjakson jälkeen elatusaine korvattiin Krebs-Ringer HEPES -bikarbonaattiliuoksella (KRH) (pH 7,4), joka sisälsi 4 mM CaCl2:a, 10 uM kalpaiini-inhibiittorin kanssa tai ilman sitä-1, ja inkuboitiin 10 minuuttia ennen lisäystä. 50 mM kalpaiinisubstraattia N-sukkinyyli-Leu-Leu-Val-Tyr-7-amino-4-metykumariinia (Sigma-Aldrich, S6510). 90-minuutin inkubaatiojakson jälkeen cal-kipuaktiivisuus määritettiin erotuksena fluoresenssin välillä (mitattu 360 nm:n virityksessä ja 430 nm:n emissiossa) kalpaiini-inhibiittorin kanssa ja ilman-1.

Western blot

Primaarisia podosyyttejä raaputettiin 80 ul:lla radioimmunosaostusmäärityspuskuria, joka sisälsi fosfataasia ja proteaasi-inhibiittoria. Proteiinipitoisuus mitattiin BCA Protein Assay Kitillä (Merck Biochemistry, 71285). Kaksikymmentä mikrogrammaa proteiineja suoritettiin elektroforeesilla Criterion XT -elementtigeelillä (12 % Bis-Tris, Bio-Rad, 3450124). Proteiinit siirrettiin polyvinylideenidifluoridikalvolle (Thermo Fischer Scientific, 88518). Sen jälkeen kun kalvoja oli blokattu 5-prosenttisessa maidossa Tris-puskurisuolaliuoksessa 0,1-prosenttisessa Tweenissä (TBS-T), kalvoja inkuboitiin kanin polyklonaalisen anti-LC3:n (1:1000, Cell Signaling Technology, 2575), kanin polyklonaalisen anti-ATG5:n kanssa. (1:2000, Cell Signaling Technology, 2630), marsun polyklonaalinen anti-sekvestosomi 1 (SQSTM1)/P62 (1:10 000, PROGEN, GP62), kanin polyklonaalinen anti-kalpaiini 1 domeeni IV (1:1000, Abcam,ab39170) ), kanin polyklonaalinen anti-kalpaiini 2:n domeenin I aminoterminaalinen pää (1:1000, Abcam, ab39165), hiiren monoklonaalinen IgG1 anti-kalpaiini 4 (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, sc-32325), kani anti-podosiini (1:1000, Abcam, ab50339), marsun anti-nefriini (1:500, PROGEN, GP-N2) ja rotan monoklonaalinen antitubuliini (1:5000, Abcam, ab6160) vasta-aine. Pesun jälkeen kalvoja inkuboitiin piparjuuriperoksidaasiin kytketyn vasta-aineen kanssa (1:2000, Cell Signaling Technology, 7074, 7076, 7077). Tiettyjen signaalien havaitseminen suoritettiin käyttämällä ECL Chemiluminescent Kit -sarjaa (Bio-Rad, 170-5070) LAS 4000 -laitteella (Fuji). Kvantifiointiin käytettiin densitometria-analyysiä ImageJ-ohjelmistolla (National Institutes of Health).

Verenpainemittaukset ja fysiologiset arvioinnit

Hiirten systolinen verenpaine mitattiin tail-cuff-menetelmällä (Visitech Systems Inc., BP-2000). Jokaisesta hiirestä otettiin kymmenen mittausta ja sitten määritettiin keskiarvo. Systolinen verenpaine mitattiin lähtötilanteessa (12 viikon iässä) ja sitten viikoittain hoitojakson loppuun asti. Kaikki hiiret sijoitettiin aineenvaihduntahäkkeihin, joissa oli vapaa pääsy veteen 6-tunnin virtsan keräämistä varten. Virtsan kreatiniini- ja plasman ureapitoisuudet analysoitiin spektrofotometrisesti käyttämällä kolorimetristä menetelmää (Olympus, AU400). Albumiinin erittyminen virtsaan mitattiin käyttämällä spesifistä entsyymi-immunosorbenttimääritystä albumiinin kvantitatiiviseen määrittämiseen hiiren virtsasta (Crystal Chem, 80630).

Histologia

Munuaiset kerättiin ja kiinnitettiin 4-prosenttisessa PBS-puskuroidussa formaliinissa. Parafiiniin upotetut leikkeet (3-um paksut) värjättiin Massonin trikromilla munuaisten morfologian arvioimiseksi. Munuaisten poikkeavuudet luokiteltiin komponenttien poikkeavuuksien esiintymisen ja vakavuuden perusteella, mukaan lukien glomeruloskleroosi, mesangiaalinen laajeneminen, tubulusatrofia tai -kipsit ja fibroosi. Skleroottisten glomerulusten osuus arvioitiin sokkotutkimuksella vähintään 50 glomerulusta munuaisleikkausta kohti.

Munuaisosien ja primääristen podosyyttien immunofluoresenssivärjäys

Kiinteät primaariset podosyytit salpattiin TBS-T 3-prosenttisessa naudan seerumialbumiinissa ja inkuboitiin yön yli 4 asteessa primaaristen vasta-aineiden kanssa marsun anti-SQSTM1/P62 (1:1000, PROGEN, GP-62C) ja kanin anti-green fluoresoiva proteiini (GFP; 1:500, Abcam, ab290). TBS-T-huuhtelujen jälkeen fluoroforeihin konjugoidut sekundaariset vasta-aineet aasin anti-marsun IgG AF594-konjugoitu vasta-aine (Jackson ImmunoResearch,706-585-148) ja aasin anti-kanin IgG AF488-konjugoitu vasta-aine( Invitrogen, A21206) käytettiin. Kuvat on otettu Zeiss 2 -fluoresoivalla mikroskoopilla, AxioCam HRc -kameralla ja Axiovision 4.3 -ohjelmistolla.

Formaliinilla kiinnitetyille parafiiniin upotetuille (FFPE) munuaisille leikkeistä (3 um) tehtiin parafiini ja hydratointi, ja antigeenin haku suoritettiin kuumennetussa sitraattipuskurissa (pH 6). Leikkeet permeabilisoitiin sitten Tritonilla 0,1 prosenttia (Euromedex) ja blokattiin TBS-T3-prosenttisella naudan seerumin albumiinilla ennen kuin vasta-aine inkuboitiin yön yli 4 asteessa. Käytimme vuohen anti-nefriiniä (1:100, PROGEN, GP-N2), marsun anti-SQSTM1/P62 (1:1000, PROGEN, GP-62C), kanin anti-GFP:tä (1:1000, Abcam, ab290), vuohen anti-podocalyksiini (PODXL;1:1000, Bio-Techne,AF-1556) ja kanin anti-Wilm's Tumor 1 (WT1;1:100, Abcam, ab192)vasta-aine. Toissijaiset vasta-aineet olivat Alexa 488- ja Alexa 568- konjugoidut Invitrogenin vasta-aineet. Tumat värjättiin sinisellä käyttämällä Hoechstia. Diat kiinnitettiin käyttämällä fluoresoivaa asennusväliainetta (Dako, S3023). Mikrovalokuvat otettiin Zeiss Axiophot -fotomikroskoopilla ja Axiovision-ohjelmistolla. Fidžin puoliautomaattisia kvantifiointia käytettiin nefriinipositiivisten ja PODXL plus -alueiden kvantifiointiin glomerulusleikkausta kohti vähintään 30 glomeruluksessa hiirtä kohti. Podosyyttien lukumäärä laskettiin WT1 plus tumien lukumääränä glomerulusleikkaa kohti vähintään 30 glomeruluksessa hiirtä kohti.

Transmissioelektronimikroskoopin menetelmä

Pienet palat munuaiskuoresta (1 mm) kiinnitettiin 3-prosenttisessa glutaraldehydissä EM-asteella (Electron Microscopy Sciences) 1-3 0 päivän ajan ja pestiin kolmesti PBS:ssä. Näytteet jälkikiinnitettiin 1-prosenttiseen osmium-te-troksidiin 0,1 M (Electron Microscopy Science) 0,1 M PBS:ssä (pH 7,4) ja pestiin vedellä. Näytteet kuivattiin alkoholilaaduissa ja 100-prosenttisessa propyleenioksidissa (Electron Microscopy Science). Hartsin suodatus suoritettiin seuraavasti: sekoita Epikote 812:ta ja propyleenioksidia suhteessa 1:1 30 minuutin ajan, minkä jälkeen sekoita Epikote 812 ja propyleenioksidi suhteessa 1:2 yön yli huoneenlämpötilassa. Näytteet upotettiin 4 mm:n gelatiinikapseleihin 100-prosenttisessa Epikote 812:ssa ja polymeroitiin uunissa, joka kuumennettiin 60 °C:seen. Ultraohuet osat leikattiin UFC7-ultramikrotomilla (Leica Microsystems GmbH) ja asetettiin Gilder Grids 200 -verkkoon (Electron Microscopy Science). Ne vastavärjättiin 7-prosenttisella uranyyliasetaatilla (LFG-jakauma) ja Reynoldin lyijysitraatilla (LFG). Näytteet tutkittiin JEM1011-transmissioelektronimikroskoopilla (JEOL) Orius SC1000 CCD -kameralla (Gatan), jota käytettiin Digi-talMicrograph-ohjelmistolla (Gatan).

Kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktiosarja

Juuri eristetyt glomerulukset jäädytettiin QIAzol Lysis -reagenssissa (Qiagen) -80 asteeseen. RNA:n kokonaisuutto fenolipohjaisella menetelmällä käsiteltiin valmistajan suositusten mukaisesti. cDNA:t syntetisoitiin käyttämällä RT²First Strand Kit -sarjaa (Qiagen, 330401), ja reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (PCR) suoritettiin käyttämällä Custom RT²Profiler PCR Array -järjestelmää ( Qiagen, CLAM36771C) ja RT'SYBR Green qPCR Mastermix (Qiagen, 330502). Kvantitatiiviset PCR-levyt ajettiin Applied Bio-systems StepOnePlus -syklilaitteella. Jokainen ryhmä sisältää käänteistranskription tehokkuuden ja genomisen DNA-kontaminaation laadunvalvonnan. Kvantitatiivinen PCR-analyysi suoritettiin käyttämällä 2-△△CT-menetelmää GeneGlobe Data Analysis Centerin avulla (www. Qiagen. com/shop/genes-and-pathways/data-analysis-center-overview-page) ja ilmaistaan ​​log2-kertaisena muutoksena geeniekspressiossa.

In silico proteominen analyysi

Kalpaiinin pilkkoutumiskohdan in silico -ennuste tehtiin DeepCalpainilla (http://deepcalpain.cancerbio.info/help.php), GPS-CCD:llä (http://ccd.biocuckoo.org) ja CaMPDB:llä (http://). calpain.org/)verkkotyökalut. Hiiren proteiinin aminohapposekvenssi saatiin Uniprotilta (https://www.uniprot.org). Tuloksia jatketaan lisätaulukoissa S1 ja S2.

Tilastolliset analyysit

Kaikki kaaviot edustavat yksittäisiä arvoja ja keskiarvoa ± SEM. Tilastolliset analyysit suoritettiin käyttämällä GraphPad Prism -ohjelmistoa, versiota 9. Vertailu 2 ryhmän välillä suoritettiin käyttämällä parametrista Studentin t-testiä, kun näytteet läpäisivät Anderson-Darlingin ja D'Agostinon normaaliteettitestin ja F-testin varianssin tasa-arvoa varten. Muuten käytettiin ei-parametrista Mann-Whitney-testiä. Vertailu useiden ryhmien välillä suoritettiin käyttämällä 1-tapa- tai 2-tapa-varianssianalyysiä, jota seurasi useiden ryhmien vertailutesti Sidakin korjauksella. P:n arvot<0.05 were="" considered="" significant.=""><><><>

Kuva 1| Angiotensiini I (Angel) ja runsaasti suolaa sisältävän ruokavalion (HSD) aiheuttama verenpainetauti estää glomerulusten autofagiaa. (ac)

Podocalyksiinin (PODXL;punainen) ja P62:n (vihreä) immunofluoresenssi glomeruluksissa (a,a') villityypin (WT) hiiristä, (b,B) WT-hiiristä 6 viikon Angel plus HSD:n jälkeen ja (c) Nphs2.cre Atgsl/ox -hiiristä, jotka osoittavat P62:n kertymistä podosyytteihin verenpainetaudin aikana ja podosyyttispesifisissä ATG5--puutteellisissa hiirissä. Nuolenpäät osoittavat P62:ta plus pisteet WT:ssä kohdassa (a'). Tumat vastavärjättiin Hoechstilla (sininen). Kuvan alaosat, joissa on prime, osoittavat suurempaa suurennusta. Palkit =50 μm. （d) P62 plus:n kvantifiointi ilmaistaan ​​prosenttiosuutena glomerulaarisesta alueesta.n =4 WT-hiiret ja n=5 WT Angel plus HSD- ja Nphs2.cre Atgsoxlo-hiirillä. Arvot esitetään yksittäisinä käyrinä ja keskiarvo ± SEM. Mann-Whitneyn testi:*P= 0.0159.

Angel plus runsaasti suolaa sisältävän ruokavalion aiheuttama verenpainetauti esti podosyyttien autofagiaa

Podosyytit osoittavat korkeaa autofagiatasoa in vivo, kuten osoittaa voimakas GFP-ekspressio siirtogeenisissä hiirissä, joilla on GFP-fuusio LC3:een (GFP-LC3-hiiret), joka on autofagian avainmerkki (lisäkuva S2A). Autofagia on dynaaminen prosessi, jossa muodostuu jatkuvasti autofagosomeja ja hajoaa autofagolysosomeja. Autofagosomaalisen hajoamisen estäminen klorokiinilla johti GFP:n ja pisteiden kerääntymiseen, mikä osoittaa suurta autofagista virtaa podosyyteissä (lisäkuvat S2A ja B). Vahvistus siitä, että GFP plus pisteet olivat autofagosomeja, osoitettiin kaksoisimmunofluoresenssilla GFP:lle ja SQSTM1/P62:lle, autofagian hajottamalle kaperoniproteiinille (lisäkuva S2C ja D). Jälleen klorokiinikäsittely aiheutti GFP:n plus P62 plus pisteiden kertymisen osoittaen tärkeää autofagista virtaa podosyyteissä. Lopuksi, korkea autofaginen virtaus säilyi in vitro, kuten GFP- ja P62-ilmentyminen GFP-LC3-hiiristä eristetyissä primaarisissa podosyyteissä ja GFP plus- ja P62 plus -pisteiden voimakas kertyminen bafilomysiini Al -käsittelyn alla, toinen autofagosomaalisen hajoamisen estäjä, osoittavat (lisäkuva S2E- H).

Hypertension kykyä moduloida podosyyttien autofagisia vasteita arvioitiin sitten hiirillä, joihin oli infusoitu AngII:ta runsassuolan ruokavalion (HSD) kanssa 6 viikon ajan, ja ei-hypertensiivisissä kontrolleissa. Kuten kuvasta 1 näkyy, AnglI plus HSD aiheutti P62:n kertymisen glomeruluksiin, jolloin kertyi voimakkaasti podosyytteihin, mikä viittaa siihen, että Angl plus HSD oli vastuussa podosyyttien autofagian salpauksesta (kuva maa). Mielenkiintoista on, että P62:n kerääntyminen podosyytteihin oli samanlaista kuin se, joka havaittiin hiirillä, joilta puuttui podosyyttiautofagia (Nphs2.cre Atg5'olox-hiiret). Toisessa verenpaineen mallissa, DOCA-suolamallissa, havaitsimme myös progressiivista P62:n kertymistä podosyytteihin pitkin podosyyttejä. taudin aika (lisäkuva S3).

Atg5:n poistaminen erityisesti podosyyteistä johtaa lisääntyneeseen albuminuriaan, podosyyttien häviämiseen ja glomerulaariseen vaurioon Angel plus HSD -mallissa

Tämän jälkeen tutkimme, vaikuttaako autofagian esto vain podosyyteissä (Nphs2.cre Atg5laxlox-hiiret) glomerulaariseen vaurioon AnglI plus HSD -mallissa. Vahvistimme ensin, että Nphs2. cre Atg5-hiirillä oli normaali verenpaine, normaali munuaisten toiminta, eikä glomerulaarisia histologisia leesioita ollut ennen 10 kuukauden ikää, kuten aiemmin on raportoitu (Supplementary lox (WT) ja Nphs2.cre Atgslox kuva S4).2 Sitten Atg5'cl-hiirille infusoitiin AngII HSD:llä 6 viikon ajan. Tärkeää on, että systolinen verenpaine oli samankaltainen kahdessa ryhmässä AnglI-infuusion jälkeen tutkimuksen aikana (kuvio 2a), vaikka verenpaineen mittaamiseen käytetty hännänmansettimenetelmä ei ehkä pystynyt ratkaisemaan pieniä verenpaineeroja. Angl-infuusio HSD:llä lisäsi huomattavasti virtsan albumiinin ja kreatiniinin suhdetta WT-hiirillä, ja tämä vaikutus lisääntyi edelleen merkittävästi hiirillä (kuvio 2b). Hypertensiiviset Nphs2.cre Atg5lox/lox Nphs2.cre Atgsoxlox-hiiret osoittivat myös merkittävästi lisääntynyttä glomeruluskleroosia verrattuna WT-pentueen kavereihin (kuva 2c-e). Mitatun proteinurian kanssa proteiinipitoiset kipsit ja tubulusten laajeneminen olivat merkittävästi yleisempiä hiirillä, joilla oli podosyyttipuutos ATG5:ssä (kuva 2f-h).

Podosyyttien määrä glomerulusta kohti väheni merkittävästi Nphs2.cre Atg5loxloxissa (kuva 2i-k). Podosyyttivaurio Nphs2.cre Atgsoxlo-hiirissä, joissa oli AngII-infuusio plus HSD, eteni jopa fokaaliseen ja segmentaaliseen glomeruloskleroosiin, kuten parietaaliepiteelisolujen (PEC) ilmentyminen osoittaa. ) aktivaatiomarkkeri CD44 glomeruluksissa (kuvio 2l ja m). Elektronimikroskopia-analyysi osoitti merkittäviä muutoksia, jotka liittyvät ATG5-puutteeseen kroonisen AngII-infuusion yhteydessä HSD:n kanssa, mukaan lukien jalkaprosessin häviäminen…hiirillä. Sitä vastoin muutama ultrahypertensiivinen Nph2. cre Atg5'oxlx-rakenteellisia vikoja löydettiin WT-hiirten podosyyteistä jopa 10 viikon AngII-infuusion jälkeen HSD:llä (kuvat 2n ja o), mikä osoittaa, että podosyyttien autofaginen aktiivisuus vaaditaan niiden vastustuskykyyn Angel plus HSD:n aiheuttamia vaurioita vastaan. Kaiken kaikkiaan tuloksemme osoittivat, että AnglIl plus HSD -mallissa autofagian esto pahentaa podosyyttien vaurioita ja menetystä ja indusoi myöhempää fokaalista ja segmentaalista glomeruloskleroosia.

Kuva 2|Atg5:n deleetio spesifisesti podosyyteissä johtaa merkittävään lisääntymiseen albuminuriassa, munuaisvauriossa ja podosyyttien häviämisessä kuuden viikon angiotensiini Il(Angel)-infuusion ja runsaasti suolaa sisältävän ruokavalion (HSD) jälkeen. (a) Systolinen verenpaine Atgslo/b- ja Nphs2.cre Ataslo-hiirillä 36 päivän aikana Angel plus HSD.n =9 hiirtä genotyyppiä kohti. Arvot esitetään keskiarvona ± SEM. Kaksisuuntainen varianssianalyysi (ANOVA): ns. (bm),n =10 hiiressä genotyyppiä kohden. Kohdassa (b,g,h,k) arvot esitetään yksittäisinä kaavioina ja keskiarvo ± SEM.(b) Angel plus HSD (jatkuu)

Kuva 3| Kalpaiinin ilmentyminen ja aktiivisuus podosyyteissä.(a) Western blot -analyysi kalpaiinin-1.kalpaiini-2 ja kalpaiinin-4 ilmentymisestä primaarisissa podosyyteissä. Tubuliinin ilmentyminen toimii normalisointina. (b) Kalpaiiniaktiivisuus mitattiin primaarisista podosyyteistä, joita oli käsitelty tai ei käsitelty angiotensiini ll:lla (Angel; 100 nM) 24 tunnin ajan kalpeptiinin kanssa (10 uM) tai ilman sitä, n =5 riippumatonta koetta. Arvot esitetään yksittäisinä käyrinä ja keskiarvo ± SEM. Yksisuuntainen varianssianalyysi (ANOVA): hoito, P=0.0035.Sidakin moninkertainen vertailutesti:*P=0.0128 Angll versus perustaso," P=0.0056 Angll plus kalpeptiini vs. Angll.(c) Kalpaiiniaktiivisuus mitattiin primaarisista podosyyteistä villityypin (WT) tai siirtogeenisistä kalpastatiinihiiristä (CST'), joita oli käsitelty tai ei käsitelty Angelilla (100 nM) 24 tunnin ajan. n {{18} } riippumattomia kokeita. Arvot esitetään yksittäisinä käyrinä ja keskiarvo ± SEM. Kaksisuuntainen ANOVA-pari hoitogenotyypille. P= 0.0483. Sidakin moninkertainen vertailutesti:**P=0.0009 WT:lle Kulma vs. perusviiva,*P=0.0420 CST'9 Kulma vs. perusviiva, *P=0.0424 WT vs. CST9 Angll.

Pls napsauta tästä päästäksesi osaan 2