Osa 1: Ephedra Fragiliksen bioaktiiviset yhdisteet: Uuton optimointi, kemiallinen karakterisointi, antioksidantti ja glykaatiota estävät toiminnot

Lisätietoja: ottaa yhteyttätina.xiang@wecistanche.com

Abstrakti: Box-Behnken-suunnittelulla (BBD) varustettua vastepintamenetelmää (RSM) käytettiin optimoimaan bioaktiivisten yhdisteiden uuttaminen Ephedra fragiliksesta. Tulokset ehdottivat, että uutto 61,93-prosenttisella etanolilla 44,43 asteessa 15,84 tunnin ajan oli paras ratkaisu tälle muuttujien yhdistelmälle. Optimaalisissa uutto-olosuhteissa saatu raaka etanoliuute (CEE) fraktioitiin peräkkäin liuottimilla, joiden polaarisuus oli kasvanut. Kokonaisfenolin (TP) ja kokonaisflavonoidin (TF) pitoisuus sekäantioksidanttija antiglykaatioaktiivisuudet mitattiin. Aktiivisimman fraktion fytokemiallinen sormenjälkiprofiili karakterisoitiin käyttämällä RP-HPLC:tä. Etyyliasetaattifraktiolla (EAF) oli korkein TP- ja TF-pitoisuus, ja sillä oli tehokkain antioksidantti- ja antiglykaatiovaikutus. Pearson-korrelaatioanalyysin tulokset osoittivat, että TP- ja TF-pitoisuudet korreloivat erittäin merkitsevästi antioksidantti- ja antiglykaatioaktiivisuuksien kanssa. Kaiken kaikkiaan E. fragilis -bakteerin EAF:stä tunnistettiin kuusi yhdistettä, mukaan lukien neljä fenolihappoa ja kaksi flavonoidia. Lisäksi molekyylitelakointianalyysi osoitti myös mahdollisen yhteyden tunnistettujen bioaktiivisten yhdisteiden ja niiden vaikutusmekanismien välillä. Tuloksemme viittaavat uusiin todisteisiin E. fragilis -bioaktiivisten yhdisteiden antioksidanttisista ja antiglykaatiovaikutuksista, joita voidaan käyttää ikääntymisen ja glykaatioon liittyvien komplikaatioiden hoidossa ja ehkäisyssä.

Avainsanat: Ephedra fragilis; vastauspinnan metodologia; Box-Behnken suunnittelu; bioaktiiviset yhdisteet; RP-HPLC; antioksidantti- ja antiglykaatiovaikutuksia

Napsauta tätä saadaksesi lisätietoja tuotteista

1. Esittely

Jatkuva altistuminen eri lähteistä tuleville hyökkääjille voi johtaa lisääntymiseenvapaat radikaalittuotanto ihmiskehossa ylittää sen kyvyn säädellä niitä, ja ajan myötä edistää useiden oksidatiiviseen stressiin liittyvien sairauksien, kuten ikääntymisen ja diabeteksen, kehittymistä[1]. Siten,antioksidanttejalisäravinteet voivat auttaa ylläpitämään optimaalista biologista järjestelmää poistamalla liiallisia vapaita radikaaleja [2]. On osoitettu, että vapaat radikaalit osallistuvat glykaatioprosessiin. Glykaatio, spontaani ei-entsymaattinen reaktio proteiineissa olevien aminohappotähteiden aminohapporyhmien ja pelkistyssokereiden välillä, tapahtuu suuremmassa määrin ikääntymisen ja hyperglykemian aikana, mikä johtaa edistyneeseen glykaation lopputuotteiden (AGE) tuotantoon ja kertymiseen 3]. Sen lisäksi, että AGE:t häiritsevät proteiineja ja muuttavat niiden toimivuutta, ne voivat myös

ottaa yhteyttä AGE-reseptoriin (RAGE), joka on 45 kDa:n moniligandisolupintareseptori, joka kuuluu immunoglobuliinien superperheeseen [4], ja aktivoi useita myöhempiä solunsisäisiä signalointireittejä, joihin liittyy vapaiden radikaalien tuotannon lisääntyminen, mikä myötävaikuttaa patologisiin komplikaatioihin. diabetekseen [5].

On hyvin todettu, että antioksidantit ja radikaaleja poistavat molekyylit ovat hyviä suojia näitä prosesseja vastaan ​​[6]. Lääkekasvien käyttö oksidatiiviseen stressiin liittyvien sairauksien ehkäisyssä ja tasapainottamisessa on vanha lääketieteellinen perinne. Viime aikoina monet tutkimukset ovat osoittaneet, että sekundaariset metaboliitit, kuten tanniinit, fenolihapot ja flavonoidit, joilla on kaksi antioksidantti- ja antiglykaatiopotentiaalia, ovat tehokkaampia diabeteksen hoidossa [7]. Siksi on erittäin mielenkiintoista löytää uusia fytokemikaalien lähteitä, jotka tehokkaasti poistavat vapaita radikaaleja ja vähentävät ei-entsymaattista glykaatiota.

Ephedra fragilis kuuluu Ephedra-sukuun (Ephedracea-perhe), joka sisältää yli 60 lajia, jotka kasvavat autiomaassa ja puolikuivissa olosuhteissa molemmilla pallonpuoliskoilla kuudella mantereella [8]. Yli 5000 vuoden ajan monia Ephedra-suvun lajeja on yleisesti käytetty perinteisessä kiinalaisessa lääketieteessä (TCM) useiden sairauksien hoitoon; on tehty useita tutkimuksia, joissa on raportoitu niiden monista terveyshyötyistä, kuten anti-inflammatorinen [9, anti-invasiivinen, antiangiogeeninen, [10], antimikrobinen, antiproliferatiivinen, pro-apoptoottinen[11], neuroprotektiivinen [12], maksan suojaava ja anti-inflammatorinen aine. -hapetusominaisuudet [13]. Flavonoideja, alkaloideja, fenolihappoja ja muita efedrakasvien yhdisteitä on pidetty näiden farmakologisten ominaisuuksien pääasiallisina fytokemiallisina komponentteina [14]. Lääketeollisuudessa korkean suorituskyvyn käänteisfaasinestekromatografiaa (RP-HPLC) käytetään laajalti analyyttisenä menetelmänä kemiallisten yhdisteiden havaitsemiseksi ja tunnistamiseksi niiden erilaisten hydrofobisten ominaisuuksien perusteella, vaikka kirjallisuudessa on kuvattu vain vähän tutkimuksia Ephedra-lajit.

Näiden bioaktiivisten yhdisteiden uuttaminen eri kasvilähteistä on ensimmäinen tärkeä vaihe niiden kvalitatiivisessa ja kvantitatiivisessa analyysissä [15]. Eri tekijät mm. uuttomenetelmä, liuottimen tyyppi ja pitoisuus, lämpötila, aika ja muut voivat merkittävästi vaikuttaa näiden yhdisteiden koostumukseen ja uuttonopeuteen [16]. Siksi uuttoprosessit on optimoitava, jotta saadaan korkea kasviaktiivisten yhdisteiden pitoisuus. Alun perin Boxin ja Wilsonin 1950-luvulla kehittämä vastauspintametodologia (RSM) on nykyään yleisimmin käytetty työkalu sellaisten prosessien suorittamiseen, parantamiseen ja optimointiin, joissa riippumattomilla tekijöillä on yhteisvaikutus haluttuun vasteeseen. Yksi tutkijoiden RSM:n useimmin valitsemista malleista on Box-Behnken-suunnittelu (BBD), koska se vaatii rajoitetun kokeilun ja on siksi vaihtoehto, joka välttää pitkäkestoiset kokeilut ja pienentää kustannuksia [17-19].

Tähän mennessä kirjallisuudessa ei ole saatavilla tutkimuksia E. fragilis -bioaktiivisten yhdisteiden uuton optimoinnista. Tästä syystä tämän tutkimuksen tavoitteena oli optimoida kokonaisfenolipitoisuuden (TP) ja flavonoidipitoisuuden (TF) uuttaminen E. fragilis -bakteerista käyttämällä BBD:tä. Optimaalisissa uutto-olosuhteissa saatu raaka etanoliuute (CEE) fraktioitiin peräkkäin kasvavan polaarisuuden omaavilla liuottimilla ja niiden antioksidantti- ja antiglykaatioaktiivisuudet tutkittiin erilaisilla in vitro -testeillä. Lopuksi suoritimme in silico -analyysin ymmärtääksemme paremmin mekanismeja, joilla EAE:n bioaktiiviset yhdisteet, jotka on tunnistettu käänteisfaasin korkean suorituskyvyn nestekromatografialla (RP-HPLC), sitoutuvat BSA:han ja RAGE:hen kohdeproteiineina.

2. Tulokset ja keskustelu

2.1. Mallien sovittaminen

RSM with a BBD was applied to investigate the effect of ethanol concentration (%, Xj), temperature(°C, X2), and time (h, X3)on the extraction yield of TP and TF from E. fragilis. The results of 15 trials after the BBD are given in Table 1. Analysis of variance(ANOVA)(Table 2) indicates that the models were significant as evidenced by F and p-values. The coefficient of multiple determinations (R')of the models were 0.9935 and 0.9939 for TP and TF, respectively, suggesting that only 0.65 and 0.61%of the total variations are not explained by the models. A comparable value of adjusted R2 to R2 represents an excellent statistical model. As given in Table 2, the adjusted R2(0.9818 and 0.983 for TP and TF contents, respectively) is close to R2, which means that the insignificant terms were not included in the models. Moreover, predicted R2(0.9012 and 0.9338 for TP and TF contents, respectively) is in reasonable agreement with adjusted R2 and confirms that the models are highly significant. The"fitness" of the models was also confirmed using the lack of fit test The insignificant p-value for lack of fit (p >{0}}.05) kahdelle vastaukselle osoittaa mallien soveltuvuuden tulosten vaihtelun tarkkaan ennustamiseen [20]. Hyvä tarkkuus kuvataan signaali-kohinasuhteeksi, joka on suurempi kuin 4, jota pidetään toivottavana [21]. Riittävän tarkkuuden arvot ovat TP- ja TF-sisällöille 29,4772 ja 28,729, mikä osoittaa riittävän signaalin. Samanaikaisesti pienemmät variaatiokertoimen arvot (CV prosenttia) (1,52 ja 0,4246 prosenttia TP- ja TF-pitoisuuksille, vastaavasti) osoittavat kokeellisten arvojen parempaa tarkkuutta ja luotettavuutta. Kunkin vastetekijän osalta uuttotekijöiden XI (etanolipitoisuus), X2 (uuttolämpötila) ja X3 (uuttoaika) vaikutusta tutkittiin huolellisesti (taulukko 2). Kunkin kertoimen merkitsevyyttä testattiin käyttämällä F- ja p-arvoja, ottaen huomioon, että suurempi F-arvo ja pienempi p-arvo johtivat aina merkittävämpään vastaavuuteen eri riippumattomien muuttujien välillä [22]. Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että mallit olivat toistettavia ja soveltuvia optimointiin.

2.2. Poistomuuttujien vaikutukset TP-sisältöön

Kuten taulukossa 2 on esitetty, ANOVA-tulokset osoittivat merkittäviä lineaarisia (X ja X2), neliöllisiä (Xj, X5 ja X) ja interaktiivisia (X1X ja X2X3) vaikutuksia TP-sisältöön. Näistä TP-sisältö on pääasiassa riippuvainen X:stä, X3:sta p<0.001 followed="" by="" x1="" and="" x1x,="" at=""><0.01. the="" following="" second-order="" polynomial="" equation="" could="" be="" used="" to="" express="" the="" relationship="" between="" tp="" content="" and="">

Sopivuuden puutteen arvo oli ei-merkittävä (F-arvo =11.02, p-arvo=0.0843), mikä osoittaa, että malli on hyvin suunniteltu ja hyvä ennuste (R{ {9}}.9935; Adj R2=0.9818)(taulukko 2).

Etanolipitoisuuden ja uuttolämpötilan (XjX2) väliset vuorovaikutukset tuottavat erittäin merkittävän (s<0.01)effect on="" tp="" content="" (table2).="" as="" ethanol="" concentration="" (x1)="" and="" extraction="" temperature="" (x)increase="" in="" the="" range="" of="" 40-61.80%="" and="" 25-44.30°c="" respectively,="" the="" tp="" content="" increases="" rapidly.="" however,="" beyond="" 61.80%and="" 44.30°c,="" tp="" content="" decreases="" slightly(figure="" 1a).="" however,="" the="" interaction="" of="" the="" extraction="" temperature="" and="" extraction="" time="" (x2x3)showed="" a="" highly=""><0.001) effect="" on="" tp="" content="" (table="" 2).="" as="" shown="" in="" figure="" 1b,="" tp="" content="" slightly="" improved="" with="" increasing="" extraction="" temperature="" (x2)and="" extraction="" time="" (x3)up="" to="" 44.37℃c="" and="" 15.77="" h,="" respectively,="" but="" diminished="" slowly="">

Nämä vaikutukset voivat johtua siitä, että fenoliyhdisteet ovat polaarisia molekyylejä, joita esiintyy luonnossa glukosidien kanssa, mikä tekee niistä vesiliukoisempia [23]. Koska fenoliyhdisteiden uutto on voimakkaasti riippuvainen liuottimen polaarisuudesta, vesi-alkoholiseos on tehokkaampi uuttamisessa kuin pelkkä alkoholi [20]. Mitä tulee "samankaltainen-liukenee-kuin"-periaatteeseen, etanolipitoisuuden lasku johtaa liuottimen polaarisuuden lisääntymiseen, mikä auttaa TP:n liukenemisessa[15]. Siitä huolimatta korkea etanolipitoisuus voi vaikuttaa uuttonopeuteen estämällä fenoliyhdisteiden liukenemisen. Samoin uuttolämpötilan kohoaminen tehosti kohdefenoliyhdisteiden talteenottoa pehmentämällä kudoksia, heikensi soluseinän eheyttä, tehosti massan siirtoa ja liuottimen tunkeutumista kasvimatriisiin ja lisäsi sekä liukoisuutta että diffuusionopeutta; Liian korkeat lämpötilat pidennettyä uuttoaikaa varten voivat kuitenkin lisätä niiden hajoamisen mahdollisuuksia [23]. Lisäksi pitkän uuttojakson on havaittu mahdollisesti pidentävän hapen ja valon altistumista, mikä viime kädessä lisää riskiä vapaiden radikaalien muodostumiselle, joita fenoliyhdisteet voivat poistaa [23]. Siksi pidennetty uuttoaika ei auttanut maksimoimaan uuttosaantoa [24].

2.3. Poistomuuttujien vaikutukset TF-sisältöön

Kuten taulukosta 2 käy ilmi, X:n ja X3:n lineaariset vaikutukset; X:n ja X:n neliövaikutukset; ja X1X2:n ja XjXg:n vuorovaikutus osoitti merkittäviä vaikutuksia TF-pitoisuuteen. Kaikista merkittävistä tekijöistä TF on pääasiassa riippuvainen X3, X, X, X, ja X1X2 p:ssä<0.001 followed="" by="" x="" andx1x3="" at=""><0.01. the="" fitted="" second-order="" polynomial="" of="" tf="" content="" is="" as="">

Sopivuuden puutteen ei-merkittävä arvo (F-arvo=1.13; p-arvo=0.5024) ehdotti, että ehdotettu malli sovitti muuttujien spatiaalisen vaikutuksen vastaukseen hyvällä ennuste (R2=0.9939; Adj R2= 0.9830) (taulukko 2).

TF-sisällölle luotiin erilaisia ​​3D-vastepintakaavioita, jotka esitettiin kuviossa 1D-F. Etanolipitoisuuden ja uuttolämpötilan (X1X2) vuorovaikutus osoitti merkittävää (s<0.001) effect="" on="" tf="" content.="" from="" figure="" 1d,="" tf="" content="" increased="" at="" first="" and="" then="" decreased="" quickly="" with="" the="" rise="" of="" the="" two="" parameters,="" and="" a="" maximum="" tf="" content="" was="" achieved="" when="" ethanol="" concentration="" (xj)="" and="" extraction="" temperature="" (xo)were="" 61.89%="" and="" 44.23°c,="" respectively.="" this="" phenomenon="" is="" similar="" to="" tp,="" which="" might="" also="" be="" attributed="" to="" the="" fact="" that="" a="" rise="" in="" the="" extraction="" temperature,="" the="" solubility,="" extraction="" rate,="" and="" diffusion="" rate="" increase,="" which="" ultimately="" helps="" tf="" to="" dissolve="" insolvent="">

Samalla tavalla etanolipitoisuuden ja uuttoajan (XIX3) välinen vuorovaikutus osoitti samanlaista korrelaatiota (kuvio 1F). TF:n uuttosaanto kasvoi vähitellen sekä etanolipitoisuuden (Xj) että uuttoajan (X3) kasvaessa. Lähellä vastekäyrän keskipistettä (61,89 prosenttia ja 15,81 tuntia X:lle ja X3:lle, vastaavasti), TF-saanto saavutti korkeimman, mutta laski hitaasti sen jälkeen. Tämä ilmiö johtuu todennäköisimmin Fickin diffuusioperiaatteen toisesta laista, joka paljastaa, että lopullinen tasapaino kiinteän matriisin liuospitoisuuden ja liuottimen välillä saavutetaan tietyn ajan kuluttua, mikä johtaa kohdeyhdisteiden uuttosannon hidastumiseen [26]. .

2.4. Optimoitujen ehtojen validointi

Optimoinnin tavoitteena oli määrittää uutto-olosuhteet, jotka tuottaisivat samanaikaisesti suurimmat TP- ja TF-pitoisuudet. Optimoinnin suorittamiseen käytettiin suunnittelun asiantuntijaohjelmistoa. BBD ehdotti optimaaliseksi etanolipitoisuudeksi, uuttolämpötilaksi ja ajaksi 61,93 prosenttia, 44,43 astetta ja 15,84 tuntia E. fragilis -bioaktiivisten yhdisteiden uuttamiseksi. Tässä optimaalisessa pisteessä ennustetut TP- ja TF-pitoisuudet olivat 15,335 mg GAE/g dw ja 2,972 mg OE/g dw, vastaavasti (taulukko 3). Mallien ennustuskyvyn validointi suoritettiin kokeellisesti RSM:ltä saaduissa optimaalisissa olosuhteissa. Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena saaduissa olosuhteissa, ja keskimääräiset TP- ja TF-pitoisuudet olivat 14,98±0.29GAE/g DW ja 2,92±0.09 QE/g dw, vastaavasti. Tutkittujen vasteiden kokeelliset arvot olivat vertailukelpoisia ja linjassa ennustettujen arvojen kanssa, mikä vahvisti, että mallit olivat riittäviä heijastamaan odotettua optimointia.

2.5. Uuttosaanto ja fytokemiallinen analyysi

Taulukko 4 osoitti E. fragilis CEE:n ja sen fraktioiden uuttosannon. Tuloksemme osoittivat, että uuttosaanto eri fraktioissa eroaa merkittävästi välillä 0,78 - 10,6 prosenttia (w/wo). Kuten taulukosta 4 näkyy, CEE(1{{14} Korkein tuottoprosentti oli },6 prosenttia, jota seurasivat WF (2,73 prosenttia ), WBF (204 prosenttia ), DMF (0,64 prosenttia ) ja EAF (0,93 prosenttia), kun taas HF (0,78 prosenttia) ) oli alhaisin tuottoprosentti.

E. fragilis CEE:n ja sen fraktioiden TP-pitoisuus määritettiin kalibrointikäyrän (y {{0}}) regressioyhtälön avulla.009x-0.{{ 25}}154; R2=0.9973) ja ilmaistuna milligrammoina gallushappoekvivalentteina (GAE) grammaa kohti kuivattua painoa (taulukko 4). Yleensä EAF:lla oli korkein TP-pitoisuus (32,78±0.49 mg GAE/g DW), jota seurasivat peräkkäin WBF, DMF ja CEE (25,02±1,01, 19,21±0,22 ja 14,98±0,29 mg GAE/g). DW), kun taas WF ja HF esittivät alhaisimmat pitoisuudet (10,47±0,71 ja 8,14±0,17 mg GAE/g DW, vastaavasti). E. fragilis CEE:n ja sen fraktioiden TF-pitoisuus arvioitiin alumiinikloridikolorimetrisellä määrityksellä käyttäenkversetiinias a standard (y=0.0295x+0.0361; R2=0.9986)(Table 4). Similar to the TP content, the same results were observed in the TF content with the highest and lowest content being detected in the EAF(10.50 ± 0.11 mg OE/g of DW)and HF(1.65± 0.13 mg OE/g of DW), respectively. The TF content is arranged as the following sequence: EAF>WBF>DMF> CEE>WF>HF. Mielenkiintoista on, että EAF:n TP- ja TF-pitoisuudet olivat 2,18 ja 3{3} kertaa korkeammat kuin CEE:ssä, mikä viittaa siihen, että etyyliasetaatti voi olla sopiva liuotin konsentroimaan enemmän saatavilla olevia fenoli- ja flavonoidiyhdisteitä CEE-fraktioinnin aikana. Tietomme TP:n ja TF:n sisällöstä ovat yhdenmukaisia ​​Yaon et al. [27], jotka raportoivat, että Pyrola asarifolia -lääkekasvista saadussa EAF:ssä oli korkeimmat fenolien ja flavonoidien tasot verrattuna muihin fraktioihin (petrolieetteri, n-butanoli ja vesi). Tutkimuksessaan Bhardwaj et al. [28] raportoi myös samankaltaisista tuloksista käytettäessä useita liuottimia, joiden polaarisuus lisääntyy (n-heksaani, kloroformi, etyyliasetaatti ja n-butanoli) Codonopsis clematidea -lääkekasvin halkaisussa. Näiden kirjoittajien mukaan EAF:llä on korkeimmat TP- ja TF-pitoisuudet, joita seuraa n-butanoli, kloroformi ja heksaani. Tämä merkittävä ero fenoliyhdisteiden uuttosaantoissa, koostumuksessa ja puhtaudessa fraktioiden välillä johtuu luultavasti kasvimateriaaleista löytyvien ainesosien polaarisuuden eroista, niiden kemiallisesta rakenteesta, polymerointiasteesta ja niiden vuorovaikutuksesta keskenään [29] ].

2.6. In vitro -antioksidanttiaktiivisuus

2.6.1.DPPH"Puhelutoiminta

DPPH" on yksi harvoista stabiileista vapaista radikaaleista, joita käytetään laajalti kasviuutteiden antioksidanttipotentiaalin tutkimiseen [30]. Uutteen sieppauspotentiaali liittyy usein sen kykyyn poistaa stabiileja vapaita radikaaleja, mikä johtuu sen vetyä luovuttavasta kyvystä. .

Tutkittiin CEE:n/fraktioiden sekä VC:n puhdistuskykyä eri annoksilla DPPH*vapaalle radikaalille. Kuva 2A osoittaa, että kaikilla fraktioilla oli ilmeistä DPPH·puhdistusaktiivisuutta annoksesta riippuvaisella tavalla alueella 0,1 - 1 mg/ml. Annoksella 1 mg/ml 64,32, 44,1{{22} },67.24, 86.63,80.95,51.37 ja 99.62 prosenttia DPPH"radikaalista sammutti CEE, HE, DMF, EAF, WBF, WF ja VC, vastaavasti. EAF (0,116±{{30}}). )etenee WBF:llä (0,175 ± 0.03 mg/ml), CEE:llä (0.23 ± 0,065 mg/ml) ja DMF:llä (0,297) ±0,044 mg/ml).WF ja HF osoittivat suhteellisesti korkeampia IC50-arvoja (0,964 ± 0,178 ja 1,245 ± 0,105 mg/ml), vastaavasti.

Observed differentials in the scavenging activities of the fractions against the DPPH*radical may be assigned to the structural characteristics and the number of phenolic compounds present in each fraction. Similar results were observed in the medicinal plant Liquidambar formosana Hance leaf since the EAF was more effective than the other fractions (dichloromethane, n-butanol, and water fractions)[31]. As a standard molecule, ascorbic acid (VC) displayed the lowest IC50 value (0.039 ±0.009 mg/mL) in comparison to all fractions. The scavenging potential is in decreasing order of VC>EAF> WBF>DMF >CEE>WF>HF.

DPPH-radikaalien poistamisen IC50-arvo korreloi merkittävästi molempien TP-pitoisuuksien kanssa (r=0.963;p<0.01) and="" tf="" content(r=""><0.01)as presented="" in="" table="" 5.="" therefore,="" the="" discovered="" antioxidant="" activity="" suggested="" that="" eaf="" can="" be="" a="" source="" of="" numerous="" natural="" compounds="" with="" antioxidant="" properties="" that="" can="" act="" as="" hydrogen="" donors="" to="" terminate="" the="" process="" of="" oxidation="" by="" converting="" the="" free="" radicals="" to="" their="" stable="">

2.6.2.ABTS· plus Scavenging Activity

ABTS-puhdistusmääritystä käytetään laajasti indeksinä puhtaiden yhdisteiden ja luonnonuutteiden antioksidanttikapasiteetin tiedottamiseen ja tutkimiseen [32,33]. ABTS*-kromoforin sinisen/vihreän värin haalistuminen lämpötilassa 734 kasviuutteen läsnä ollessa voi viitata antioksidanttiaktiivisuuteen.

Kuten kuvassa 2B on esitetty, CEE/fraktioiden huuhtelukäyrä ABTS* plus osoitti nousevaa trendiä pitoisuuden kasvaessa. Konsentraatiolla 1 mg/ml CEE:n, HF:n, DMF:n, WBF:n, EAF:n, WF:n ja VC:n poistonopeudet olivat 80.31,40.54,88.76, 9{{2{ {22}}}},11, 82,97, 67,36 ja 94,90 prosenttia. Kaikista fraktioista pienin ICs0-arvo osoitti EAF(0.11{{30}}±0.014 mg/ ml) etenee DMF:llä(0.196±0.023 mg/ml),WBF (0.277±0.031 mg/ml), CEE(0.429) ± 0,039 mg/ml) ja WF (0,654 ± 0,043 mg/ml), kun taas HF osoitti korkeimman ICs0-arvon (1,314 ± 0,104 mg/ml). Yhdessä tämä havainto oli yhtäpitävä Kaewseejanin ja Siriamornpunin [29] kanssa. Vertailu VC:n estokykyyn (0,025 ± 0,005 mg/ml) osoitti, että CEE:n ja sen fraktioiden puhdistusaktiivisuus oli hieman heikkoa.

Kuten taulukossa 5 esitetään, erittäin merkittävä korrelaatio ABTS-radikaalin poistamisessa TP-sisällön kanssa (r=0.921;p<0.01), and="" a="" significant="" correlation="" with="" tf="" content="" (r=""><0.05), were="" shown.="" this="" finding="" confirms="" the="" results="" obtained="" for="" the="" dpph*scavenging="" assay,="" proving="" the="" capacity="" of="" eaf="" to="" scavenge="" free="">

2.6.3. H2O2-poistotoiminta

Koska H2O2 on pääasiallinen oksidatiivisen stressin aiheuttaja, se diffundoituu helposti solujen läpi kalvon läpi lähettimolekyylinä [34]. Yhdessä H2O2 itsessään ei ole vaarallinen [35], mutta se voi reagoida Fe2:n kanssa Fenton-reaktion kautta ja synnyttää erittäin reaktiivisen hydroksyyliradikaalin (OH*)[36]. Siten se on ROS:sta vahingollisin biomolekyyleille. Siksi on tarpeen arvioida CCE:n ja sen eri fraktioiden kyky poistaa H2O2.

Scavenging activities of CEE/fractions, as well as standard antioxidants, were presented in Figure 2C. Notably, all extracts showed a strong scavenging activity on HO, which increased with the increase of sample doses ranging from 0.1 to 1 mg/mL. Moreover, the H2O2 scavenging potential decreased in the order of EAF> WBF>DMF>CEE>WF>HF ja vastaavat huuhtelukyvyt 1.0 mg/ml:lla olivat 84,56, 75,24, 67,17, 56,18, 50,19 ja 34,95 prosenttia, mikä oli paljon alhaisempi kuin VC:llä (98,03 prosenttia).

Kaikista fraktioista EAF osoitti alhaisimman IC50-arvon (ICs0= 0.098±0.013 mg/ml), ja se oli merkittävästi korkeampi kuin VC (0,024 ± 0,006 mg/ml). Tämä voi johtua korkean fenoli- ja flavonoidiyhdisteiden läsnäolosta EAF:ssä, joilla tiedetään laajalti olevan ratkaiseva rooli antioksidantteina biologisissa järjestelmissä. Äskettäisessä tutkimuksessamme osoitimme E. fragilis -bakteerin EAF:n kyvyn suojata Tetrahymena pyriformista H2O2--indusoidulta oksidatiiviselta vauriolta [37].

Data-analyysimme osoitti, että kuten DPPH"- ja ABTS* plus -tuloksissa, H2O2-poiston ICs0-arvon välillä havaittiin vahva positiivinen korrelaatio molempien TP-sisältöjen kanssa (r=0.926; p<0.01) and="" tf="" content="" (r=""><0.01)(table 5).="" in="" their="" study,="" sroka="" and="" cisowski="" [38]="" reported="" also="" a="" positive="" correlation="" between="" phenolic="" compounds="" with="" ho2-scavenging="" ability.="" according="" to="" these="" authors,="" the="" ho2-scavenging="" depended="" strongly="" on="" the="" number,="" positions,="" and="" the="" model="" of="" substitution="" of="" oh="" bonded="" to="" the="" aromatic="" ring="" of="" phenolic="">

2.6.4. Tehon vähentäminen

Uutteen pelkistyskyky toimii indikaattorina sen mahdollisesta antioksidanttiaktiivisuudesta [39, A40]. Antioksidanttipotentiaali arvioidaan antioksidanttien kyvyllä pelkistää rauta(Fe3) ferrikloridissa rauta(Fe2 plus ). Yleensä pelkistävät ominaisuudet johtuvat siitä, että kasviuutteissa on reduktoneja, joiden tiedetään toimivan katkaisemalla vapaaradikaaliketjun luovuttamalla vetyatomin [41].

Kuvio 2D esittää annos-vastekäyrän E. fragilis -uutteiden pelkistysvoimalle. Tiedetään, että mitä suurempi absorbanssi 700 nm:ssä, sitä suurempi on pelkistyskyky. Tässä tutkimuksessa CEE ja sen viisi fraktiota osoittivat huomattavaa pelkistysvoimaa pitoisuudesta riippuvaisella tavalla.

EAF osoitti maksimaalista antioksidanttiaktiivisuutta (EC{0}},136± 0.{{10}}13 mg/ml) verrattuna VC:hen (EC{{4). }}.083± 0.005 mg/ml). Tätä seurasi tarkasti WBF (EC50=0.180 ± 0,028 mg/ml), DMF (EC50=0.319 ± 0.031 mg/ml), CEE (EC50=0.334±0.029mg/ml) ja WF(EC50=0.398±0.064 mg/ml) .HF perässä osoittaen pienimmän vähennystehoaktiivisuuden (EC5s0 =0.626±0,068 mg/ml) muihin fraktioihin verrattuna. Nämä havainnot viittaavat siihen, että EAF voi sisältää erilaisia ​​yksittäisiä yhdisteitä, joilla on tehokas ja voimakas vähentämisteho. Tutkijat ovat havainneet, että etyyliasetaattiuutteet voivat toimia vahvoina antioksidantteina [42].

Positiivinen korrelaatio havaittiin vähentävän tehon ja sekä TP- että TF-sisällön välillä (r=0.975; p<0.01 and="" r="0.987;"><0.01; respectively).these="" correlations="" confirmed="" the="" contribution="" of="" phenolic="" compounds="" in="" the="" reducing="" power="">

2.6.5. Fosfomolybdeenimääritys

CEE:n ja sen fraktioiden TAC sekä VC arvioitiin käyttämällä fosfomolybdeenimääritystä ja ilmaistiin EC:inä 0, joka on pitoisuus, joka tarjoaa 0,5 absorbanssin. Menetelmä perustui Mo(VI):n pelkistämiseen Mo(V):ksi uutteilla vihreän fosfaatti/Mo(V)-kompleksin muodostamiseksi happamassa pH:ssa maksimiabsorptiolla 695 nm:ssä [43].

As shown in Figure 2E, the total antioxidant capacity of CCE/fractions and VC correlated well with increasing concentrations in the range of 0.1 to 1 mg/mL.Of the CEE fractions, the ECs0 values ranged from 0.159±0.019 to 0.604±0.073 mg/mL, with a descending order of EAF>WBF> DMF> CEE >WF>HF(s<0.05), which="" indicates="" that="" eaf="" and="" hf="" had="" the="" highest="" and="" lowest="" antioxidant="" activity,="" respectively.="" this="" activity="" could="" be="" due="" to="" the="" presence="" in="" eaf="" of="" various="" phenolic="" compounds="" that="" might="" possess="" antioxidant="" activity.="" vc,="" which="" is="" the="" positive="" control,="" displayed="" the="" lowest="" ec5o="" value="" (0.095±="" 0.008="" mg/ml)="" in="" comparison="" to="" all="">

Erittäin merkittävä korrelaatio havaittiin antioksidanttiaktiivisuuden ja sekä TP- että TF-pitoisuuksien välillä (r=0.978 molemmille;p<0.01) and="" is="" shown="" as="" presented="" in="">

2.6.6. -Karoteeni-linoleaattimallijärjestelmä

Karoteeni-linolihappomallissa erittäin tyydyttymättömät karoteenimolekyylit värjäytyvät nopeasti linolihapon hapettumisen aiheuttamien linoleaattivapaiden radikaalien vuoksi [44]. Täydennys antioksidanteilla voisi minimoida karoteenin hapettumisen neutraloimalla linoleaattivapaita radikaaleja ja siten estämällä karoteenin valkaisua [45].

Antioxidant activity of CCE/fractions and BHT, as measured by the β-carotene-linoleate model, are shown in Figure 2F. All tested extracts showed concentration-dependent scavenging activity. The EAF, which contained the highest amount of phenolics and flavonoids contents, showed a significant effect in inhibiting β-carotene bleaching, reaching 74.75%at a concentration of 1mg/mL. WBF, CCE, DMF, HF, and WF inhibited the oxidation of β-carotene by 51.61,58.12,50.09,41.39, and 31.66% respectively, at the same concentration. Overall, decreasing antioxidant activity was depicted as EAF> WBF> CEE>DMF>HF>WF.

EAF näytti pienimmän IC50-arvon (IC50=0.127 ± 0.{{10}}42 mg/ml) verrattuna BHT:hen (ICs { {5}}.{13}}49 ± 0.001 mg/ml). WBF. CCE. DME. ME. ja HF näyttivät verrattain korkeammat ICs0-arvot 0,5±0,111 mg/ml, 0,998 ± 0,101 mg/ml, 1,073±0,084 mg/ml, 1,402±0,058 mg/ml ja 2,209 ± 0,081 mg/ml, vastaavasti.

Merkittävä positiivinen korrelaatio havaittiin -karoteenihapetuksen poistamisen ja molempien TP-pitoisuuksien välillä (r= 0.850;p<0.05) and="" tf="" content="" (r=""><0.05)(table 5).="" this="" result="" suggests="" that="" eaf="" may="" contain="" some="" antioxidants="" that="" can="" inhibit="" the="" formation="" of="" hydroperoxide="" and="" stop="" the="" radical-chain="" reaction="">

The involvement of reactive oxygen species (ROS) in several pathological situations has been growing recently. Bioactive compounds are gaining interest thanks to their potent antioxidant activity, but their complexity imposes the development of many methods to evaluate the antioxidant activity and the effectiveness of these chemical compounds. Thus, in this study, CEE and its fractions have been investigated for their antioxidant potential using six assays: DPPH, ABTS, H>O, RP, TAC ja -karoteeni. Näin ollen osoitimme, että CEE:n ja sen fraktioiden voimakkaat antioksidanttiaktiivisuudet osoittivat korkeampaa puhdistusaktiivisuutta, ja tämä voi johtua vahvasti niiden koostumuksesta fenolihaposta ja flavonoideista, kuten gallushaposta, rutiinista ja kversetiinistä.