Osa 1 Cistanche Tubulosa -uutteen masennuslääkkeen kaltaiset vaikutukset kroonisiin ennakoimattomiin stressirotteihin suoliston mikrobiotan homeostaasin palauttamisen kautta

Yang Li1, Ying Peng1, Ping Ma1, Hanlin Yang1, Haiyan Xiong1, Mengyue Wang1, Chongsheng Peng1, Pengfei Tu2 ja Xiaobo Li1*

1 Farmasiakoulu, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, Kiina, 2 State Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs, School of Farmaseutical Sciences, Peking University, Peking, Kiina

Kasvava näyttö osoittaa, että neuropsykiatriset häiriöt, kuten masennus, liittyvät suoliston mikrobiomiin suolisto-aivo-akselin kautta.Cistanches Herbatunnetaan hyvin "munuais-yang" -puutoksen hoidosta perinteisessä kiinalaisessa lääketieteessä (TCM) ja sitä on käytetty hermostoa rappeuttavien sairauksien hoitoon viime vuosina. Tässä tutkimuksessa perustettiin kroonisen ennakoimattoman stressin (CUS) aiheuttaman masennuksen malli tutkimaanCistanche tubulosaUute (CTE) käyttäytymistokeista, monoamiinin välittäjäaineista ja neurotrofisista tekijöistä hippokampuksessa ja paksusuolessa, suoliston mikrobiotan koostumuksesta ja lyhytketjuisten rasvahappojen (SCFA) tuotannosta. Lisäksi korrelaatioanalyysiä käytettiin arvioimaan toiminnallista suhdetta muuttuneen suoliston mikrobiotan, muuttuneiden välittäjäaineiden ja neurotrofiinien välillä hippokampuksessa ja paksusuolessa sekä SCFA-yhdisteiden häiriintyneen pitoisuuden välillä. CTE paransi merkittävästi masennuksen kaltaista käyttäytymistä rotilla CUS:n alla. CTE:llä palautettiin 5-hydroksitryptamiinin (5-HT) ja aivoista peräisin olevan neurotrofisen tekijän (BDNF) ekspression tasot CUS-rotissa. Suoliston mikrobiston suhteellista runsautta sekä asetaatin ja heksaanihapon pitoisuuksia voidaan myös muuttaa CTE-käsittelyllä. Lisäksi osoitimme, että CTE:n käyttö CUS-rotissa johti vahvaan korrelaatioon häiriintyneen suoliston mikrobiston koostumuksen, hippokampuksen välittäjäainetasojen ja neuroaktiivisten metaboliittien SCFA:iden tuotannon välillä. Kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittavat, että CTE on mahdollinen masennusoireiden hoitokeino palauttamalla suoliston mikrobiotan homeostaasi mikrobiota-suoli-aivo-akselin häiriöille, mikä avaa uusia mahdollisuuksia neuropsykofarmakologian alalla.

Avainsanat: Cistanche tubulosa, masennuslääke, krooninen arvaamaton stressi, suoliston mikrobiota, mikrobiota-suoli-aivo-akseli

Lisätietoja saat ottamalla yhteyttä:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticolalla on monia vaikutuksia, napsauta tästä saadaksesi lisätietoja

JOHDANTO

Cistanches Herba(kiinaksi Rou Cong-Rong) on ​​virallisesti kirjattu kuivatuiksi meheviksi varreksiCistanche deserticola(YC Ma) jaCistanche tubulosa(Schrenk) Kiinan farmakopeakomissiossa (2015). Se on tunnettu perinteinen kiinalainen lääketiede (TCM) munuaisten vajaatoiminnan, impotenssin, naisten hedelmättömyyden, sairaalloisen leukorrean, runsaan metrorragian,

ja seniili ummetus (Chinese Pharmacopoeia Commission, 2015). Aiemmat tutkimukset ovat paljastaneet useita tärkeimpiä kemiallisia ainesosiaCistanches Herbamukaan lukien fenyylietanoidiglykosidit (PhG:t), iridoidit ja iridoidiglykosidit, lignaanit, alditolit, oligosakkaridit ja polysakkaridit. Farmakologinen analyysi on osoittanut, että Cistanches Herballa on laaja valikoima neuroprotektiivisia, immunomodulatorisia, anti-inflammatorisia ja hepatoprotektiivisia vaikutuksia (Jiang ja Tu, 2009; Fu et al., 2017). PhG:itä on pidetty Cistanches Herban tärkeimpinä aktiivisina ainesosina, joilla on erilaisia ​​farmakologisia vaikutuksia, kuten hermoja suojaavia, immunomodulatorisia, anti-inflammatorisia, hepatoprotektiivisia, antioksidantteja jne. (Jiang ja Tu, 2009; Fu et al., 2017).Cistanches Herbanauhoitettiin alun perin yrttilääketieteen klassikkoon (kiinaksi "Shennong Bencao Jing"), tunnettuun lääkekasveja käsittelevään kirjaan, joka on kirjoitettu noin vuosina 200–250 jKr. ja seitsemän (yli syöminen, viha, kosteus, kylmyys, huoli, tuuli ja sade ja pelko) vaimennusta" (Huang, 1982). Nykyään Cistanches Herba on laajalti hyväksytty yrttitonniksi yleisen heikkouden hoitoon (Fu et al., 2017).C. tubulosaglykosidikapseleita (Memoregain®) käytetään Alzheimerin taudin hoitoon (Guo et al., 2013). Toimintahäiriöinen dopaminerginen järjestelmä on yksi masennuksen monoamiinihypoteesin tärkeimmistä patogeneeseista (Duman et al., 1997; Krishnan ja Nestler, 2008). Ekinakosidi (yksi PhG:t) ja PhGs alkaenCistanche salsaon todettu suojaavan dopaminergisiä hermosoluja 1-metyyli-4-fenyyli-1,2,3,6-tetrahydropyridiinin (MPTP) aiheuttamalta dopamiinin (DA) hermotoksisuudesta, joka voi lisätä DA:ta tasot C57-hiirten striatumissa (Tian ja Pu, 2005; Geng et al., 2007). Lisäksi katalpoli ja geniposidi ovat kaksi tyypillistä iridoidia Cistanches Herbassa, ja niiden on todettu parantavan kroonista ennakoimattoman stressin (CUS) aiheuttamaa masennuksen kaltaista käyttäytymistä palauttamalla hypotalamus-aivolisäke-lisämunuaisen (HPA) akselin toimintahäiriöt ja katalpoli voi säädellä aivojen toimintaa. johdettu neurotrofisen tekijän (BDNF) ilmentyminen (Cai et al., 2015; Wang et al., 2015). Lisäksi uusin julkaisu antaa tuoreen todisteen siitä, että Cistanches Herba -keite lyhensi merkittävästi liikkumattomuusjaksoa hiiren hännän ripustustestissä, mikä viittaa vahvasti siihen, että Cistanches Herballa on potentiaalisia masennuslääkkeiden kaltaisia ​​ominaisuuksia (WangD. et al., 2017).

Perinteinen kiinalainen lääketiede herättää yhä enemmän huomiota masennuksen hoitona sen suhteellisen kohtalaisten sivuvaikutusten vuoksi (Sarris et al., 2011; Feng et al., 2016). Erityyppiset TCM:t, kuten yksittäiset yhdisteet raakalääkkeestä (ginsenosidi Rb1, ginsenosidi Rg3 ja Yuanzhi-1) (Jin et al., 2015; Kang et al., 2017; Wang GL et al., 2017) ), yksittäiset kiinalaiset lääkeaineet (Panax ginseng juuri, Acorus tatarinowii -juurikot ja Morinda officinalis) (Dang et al., 2009; Han et al., 2013; Xu et al., 2016) ja TCM-keitteet (Kai-Xin- San, Chaihu-Shu-Gan-San, Xiaoyaosan ja Xiaochaihutang) (Dai et al., 2010; Su et al., 2011; Su et al., 2014; Yan et al., 2016) on tutkittu syvällisesti ja osoitettu kääntää tai lieventää masennuksen kaltaisia ​​oireita. Esimerkiksi Kai-Xin-Sanin havaittiin lievittävän huomattavasti CUS:n aiheuttamien masennusrottien oireita lisäämällä välittäjäaineiden, neurotrofisten tekijöiden ja niitä vastaavien reseptorien määrää ja edistämällä synaptotagmiinin ja dendriittisen selkärangan tiheyden ilmentymistä (Yan et al. ., 2016).

Siitä huolimatta aiemmat TCM-tutkimukset perustuvat masennuslääkkeiden kaltaisten käyttäytymistestien tuloksiin ja keskittyvät tavanomaiseen farmakologiseen vaikutusmekanismiin. Suun kautta annetun TCM:n masennuslääketehon ja suoliston mikrobiotan välistä yhteyttä ei ymmärretä hyvin. Kasvava näyttö tukee sitä, että suoliston mikrobiotalla on ratkaiseva rooli aivotoimintojen, erityisesti masennuksen ja muiden stressiin liittyvien häiriöiden, säätelyssä (Foster ja Neufeld, 2013; Sherwin et al., 2017). Esimerkiksi krooninen stressi johtaa rotan suoliston mikrobirakenteen säätelyhäiriöihin, jolloin Firmicutes/Bacteroidetes -suhde laskee, ja tarkemmin sanottuna Lactobacilluksen suhteellinen runsaus vähenee ja Oscillibacter lisääntyy (Meng et al., 2017). Lisäksi masentuneiden potilaiden epäsäännöllisen mikrobiston ulosteensiirto mikrobittomille hiirille antoi näille eläimille masennuksen kaltaisen fenotyypin, mikä osoittaa, että säädellyt suolen mikrobiota aiheuttaa käyttäytymis- ja fysiologisia masennuksen ja ahdistuksen oireita (Kelly et al., 2016; Zheng et al. ., 2016). Eläinkokeissa joidenkin mikrobiotamodulaattoreiden, kuten probioottien ja prebioottien, havaittiin parantavan kroonisesti stressaantuneiden hiirten masennuksen kaltaista käyttäytymistä parantamalla suoliston mikrobiotaa (Bravo et al., 2011; Bharwani et al., 2017; Burokas et al., 2017). ).

Kun otetaan huomioon suoliston mikrobiotan ja sairauden kehityksen välinen yhteys sekä suoliston mikrobiotan rakenteen plastisuus, päätimme tutkia suoliston mikrobiotan vaikutuksia masennuksen välittämiseen, mikä herätti huomiomme ja sitä tutkittiin (Chang et al., 2017; Xu et al. ., 2017). Tämän saavuttamiseksi suoritettiin 16S-rRNA-geenisekvensoinnin yhdistetty metastat-analyysi (White et al., 2009) suoliston mikrobiotan koostumuksen analysoimiseksi. Esillä olevassa tutkimuksessa,C. tubulosavalittiin arvioimaan sen masennuslääkkeen kaltaisia ​​vaikutuksia, koska sillä on korkeampi PhG-taso verrattunaC. deserticola. Rotan CUS-indusoitu masennuksen malli perustettiin tutkimaan vaikutustaC. tubulosaUute (CTE, joka koostuu 48,6 prosentista PhG:itä, 6,9 prosenttia iridoidiglykosideja ja 2 0,0 prosenttia sakkarideja kokonaismäärästä) käyttäytymistokeissa, monoamiinin välittäjäaineet ja neurotrofiset tekijät hippokampuksessa ja paksusuolessa, suoliston mikrobiston koostumus ja lyhyt ketjurasvahappojen (SCFA) tuotanto. Lisäksi toiminnallinen suhde muuttuneiden suoliston mikrobiotan muuttaneiden välittäjäaineiden ja neurotrofiinien välillä sekä hippokampuksessa että paksusuolessa, ja SCFA-yhdisteiden häiriintynyttä pitoisuutta tutkittiin. Korrelaatioanalyysiä käytettiin todistamaan, että CTE kohdistuu suoliston mikrobiotaan masennuksen hoidossa moduloimalla mikrobiota-suoli-aivo-akselia.

Cistanchevoi parantaa immuniteettia

MATERIAALIT JA MENETELMÄT

Materiaalit

Fluoksetiini (FLX) ostettiin yhtiöltä Aladdin Industrial Inc. (Shanghai, Kiina). 5-hydroksitryptamiini (5-HT), norepinefriini (NE) ja BDNF ELISA -sarjat ostettiin Nanjing Jiancheng Bioengineering Institutesta (Nanjing, Kiina). HPLC-laatuinen asetonitriili ostettiin Merckiltä (Darmstadt, Saksa). Deionisoitua vettä valmistettiin tislatusta vedestä käyttämällä Milli-Q-vedenpuhdistusjärjestelmää (Millipore, Bedford, MA, Yhdysvallat). Kaikki muut käytetyt reagenssit ja kemikaalit olivat analyyttistä laatua.

Kuivatut varretC. tubulosakerättiin Hetian Countysta (Xinjiang, Kiina). Professori Xiaobo Li varmentaa tositteen näytenäytteet, ja ne talletettiin Shanghai Jiao Tong -yliopiston (Shanghai, Kiina) farmasian koulun herbaarioon. Homogeeninen jauhettuC. tubulosavarret suspendoitiin kymmenkertaiseen 70-prosenttiseen etanoliin ja kuumennettiin palautusjäähdyttäen kolme kertaa, kukin 1 tunnin ajan 100 asteessa. Uutteet suodatettiin käyttäen sideharsoa, haihdutettiin tyhjössä 65 asteessa ja lyofilisoitiin. Näyte liuotettiin uudelleen ja erotettiin sitten makrohuokoisella hartsilla D101. Adsorption jälkeen vedellä eluoitunut fraktio heitettiin pois. CTE saatiin sen jälkeen, kun se oli eluoitu 40-prosenttisella etanolilla, sitten se haihdutettiin tyhjössä 65 asteessa ja lyofilisoitiin.

CTE:n kemiallisen koostumuksen analyysi

PhG:iden suhteellinen pitoisuus CTE:ssä määritettiin UV-spektrofotometrialla aallonpituudella 330 nm käyttäen ekinakosidia standardina. Iridoidien ja iridoidiglykosidien suhteellinen pitoisuus mitattiin UV-spektrofotometrialla kaksoisaallonpituusmenetelmällä PhG:iden aiheuttamien spektrihäiriöiden välttämiseksi (spektroskooppiseen kvantifiointiin käytettiin 237 nm:tä, referenssiaallonpituudena käytettiin isosbestipistettä 280 nm), käytettiin geniposidia. vakiona. CTE:n kokonaishiilihydraattipitoisuus määritettiin fenoli-rikkihappokolorimetrisellä menetelmällä glukoosin ollessa standardi (Chow ja Landhausser, 2004).

CTE:n tärkeimmät kemialliset aineosat karakterisoitiin UPLC-Q-TOF-MS:llä. UPLC-Q-TOF-MS-analyysi suoritettiin Waters ACQUITY UPLC -järjestelmällä (Waters Corp., Milford, MA, Yhdysvallat) ACQUITY UPLC BEH C18 -kolonnilla (100 mm x 2,1). mm id, 1,7 µm, Waters Corp., Yhdysvallat) gradienttieluoimalla käyttämällä 0,1 % muurahaishappoasetonitriiliä (A) ja 0,1 % muurahaishappoa vedessä (B) virtausnopeus 0,4 ml/min. Gradienttiprofiili oli: 0-5 min (A: 5-20 prosenttia ), 5-7,5 min (A: 20-30 prosenttia ), 7.5-10 min ( A: 30-70 prosenttia ), 10-11 min (A: 70-100 prosenttia ), ja pidettiin 1,5 minuuttia. Gradientti kierrätettiin takaisin 5 prosenttiin 0,5 minuutissa ja pidettiin 2,5 minuuttia seuraavaa ajoa varten. Injektiotilavuus oli 3 [il. Pylväsuunin lämpötila asetettiin 35 asteeseen.

Massaspektrometria suoritettiin käyttämällä Waters Vion IMS -massaspektrometriä (Waters Corp., Milford, MA, Yhdysvallat). Ionisointi suoritettiin negatiivisessa sähkösumutustilassa (ESI). MS-parametrit olivat seuraavat: kapillaarijännite, 2.0 kV; kartiojännite, 20 V; lähdelämpötila, 120 astetta ; desolvataatiolämpötila, 500 astetta ; kartio- ja desolvataatiokaasuvirtaukset, 50 ja 1, 000 L/h, vastaavasti. Tarkkaa massan mittaamista varten lukkomassana käytettiin leusiinienkefaliinia [MH]-ionin muodostamiseksi (m/z 554,2615). MSE (Mass SpectrometryElevatedEnergy) -koe kahdella skannaustoiminnolla suoritettiin seuraavasti: toiminto 1 (matala energia): m/z 50-1, 000, 0,25 s skannausaika, 0,02 s skannausten välinen viive , 6 eV törmäysenergia; toiminto 2 (suuri energia): m/z 50-1,000, 0,25 s skannausaika, 0,02 s skannausten välinen viive, törmäysenergian ramppi 20-45 eV. Tiedot käsiteltiin UNIFI 1.8.1 -ohjelmistolla (Waters Corp., Milford, MA, Yhdysvallat).

Eläinkokeet

Urospuoliset Sprague-Dawley-rotat (200 土 20 g) hankittiin Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Companysta (Peking, Kiina) ja sijoitettiin Shanghai Jiao Tong -yliopiston (Shanghai, Kiina) Laboratory Animal Centeriin. Eläimet pidettiin ryhmissä kontrolloidussa huoneenlämpötilassa (25 °C 2 astetta, 55 °C 10 prosenttia suhteellinen kosteus) 12:12 tunnin valo-pimeä-jaksolla. Rotille annettiin vapaa pääsy tavalliseen laboratoriorottien ruokaan ja veteen 1 viikon ajan. Eläinten tilat ja protokollat ​​hyväksyttiin Shanghai Jiao Tong -yliopiston (Shanghai, Kiina) eläinetiikkakomiteassa.

Yhden viikon totuttelun jälkeen 40 naiivia rottaa altistettiin 72 tunnin sakkaroosiharjoittelulle ja sakkaroosin perustason testaukselle. Rotat jaettiin viiteen ryhmään (n=8) niiden sakkaroosien mieltymysten perusteella sakkaroosin perustestissä (lisäkuva S1). Kontrolliryhmälle ja CUS-ryhmälle annettiin suolaliuosta (10 ml/kg). Muissa kolmessa ryhmässä CTE korkealla annoksella (CTEH) (400 mg/kg), pienen annoksen (CTEL) (200 mg/kg) ja FLX (10 mg/kg) annettiin mahalaukunsisäisesti 1 tunti ennen CUS-menettelyä (klo 8.00-9.00) 4 viikon aikana.

Krooninen arvaamaton stressi kehitettiin aiemmin kuvatulla tavalla (Willner, 1997; Xue et al., 2013), paitsi stressittömässä kontrolliryhmässä, rotille sovellettiin useita stressitekijöitä: yön yli jatkuva matalan intensiteetin stroboskooppinen valaistus (120 välähdystä/ min), valkoinen kohina (100 dB) 1 h, veden puute 24 h, tyhjät vesipullot 1 h (veden puutteen jälkeen), ruokapuute 24 h, pakkouinti (5 min), fyysinen rajoitus ({{11) }} h), likainen häkki 24 h (200 ml vettä 100 g sahanpurukuivaimessa), hännän puristus (1 min), 45 asteen häkin kallistus 24 h, shokki 30 min ja yön yli valaistus (12 h). Stressiä käytettiin jatkuvasti ja satunnaisesti 4 viikon ajan, jonka yksityiskohdat on kuvattu lisätaulukossa S1. Ruokaa ja vettä olivat vapaasti saatavilla ei-stressoituneille kontrollirotille, jotka pysyivät häiriintymättöminä toisessa huoneessa, lukuun ottamatta 14 tunnin deprivaatiojaksoa ennen jokaista sakkaroositestiä. Yksi rotta kuoli CUS-toimenpiteen aikana. Pakkouintitesti (FST) suoritettiin sen jälkeen

4 päivää akuuttia antoa ja 28 päivän stressin jälkeen suoritettiin sakkaroosipreferenssitesti (SPT) (päivä 29), avoimen kentän testi (OFT) (päivä 31) ja uutuussuppressoitu ruokintakoe (NSFT) (päivä 33). CUS- ja käyttäytymistestien suunnittelun pääpiirteet on esitetty lisäkuvassa S2.

Pakkouintitesti suoritettiin aiemmin kuvatulla tavalla (Porsolt et ai., 1978). Toimenpide koostui esitestauksesta ja testiistunnoista, joissa käytettiin samoja laitteita ja olosuhteita (halkaisija 20 cm, korkeus 45 cm, sisältäen 25 cm vettä pidettynä 26 asteessa). Esitestauksen aikana rotat pakotettiin uimaan 15 minuuttia; 24 tuntia myöhemmin rotat asetettiin samaan laitteeseen 5 minuutin uintikokeeseen. Uintikäyttäytyminen sisällä

5 minuuttia tarkkailtiin videokameralla ja liikkumattomuuden kesto mitattiin ja analysoitiin.

SPT:tä varten rotat koulutettiin ensin nauttimaan 1 % (v/v) sakkaroosiliuosta 72 tunnin ajan ennen SPT:tä. Sakkaroosin perustesti ennen CUS-menettelyä ja SPT CUS:n lopussa suoritettiin aiemmin kuvatulla tavalla (Xue et al., 2013).

Avokenttätesti suoritettiin CUS-menettelyn lopussa, laitteisto ja menetelmä olivat samat kuin aiemmin yksityiskohtaisesti (Xue et al., 2013). Kuljetun kokonaismatkan tallentamiseen käytettiin videoseurantajärjestelmää (Shanghai Mobile Datum Information Technology Co., Ltd.).

Uutta vaimentunut ruokintatesti arvioitiin aiemmin kuvatulla tavalla (Xue et al., 2013) ja syömisen aloittamisen latenssi 5 minuutin sisällä tallennettiin ja analysoitiin.

Neurotransmitterien ja neurotrofisten tekijöiden mittaus

Käyttäytymistestien jälkeen jokaiselta rotalta otettiin vähintään neljä ulostepellettiä, jotka asetettiin steriileihin kartiomaisiin putkiin ja pakastettiin välittömästi -80 °C:seen mikrobiyhteisö- ja SCFA-analyysiä varten. Sen jälkeen rotat tapettiin; hippokampus ja paksusuoli eristettiin ja punnittiin välittömästi. Kudosnäytteet pestiin suolaliuoksella, pakastettiin nestemäisessä typessä ja säilytettiin -80 °C:ssa varastointia varten. Peräkkäisen sulatuksen jälkeen -20 °C:ssa ja 4 °C:ssa kudosnäytteet homogenisoitiin suolaliuoksessa ja sentrifugoitiin 25 minuuttia nopeudella 2 500 rpm/4 °C. Saatu supernatantti kerättiin ja säilytettiin 4°C:ssa käyttöön asti. 5-HT:n tasot hippokampuksessa ja paksusuolessa, NE:n tasot hippokampuksessa ja BDNF:n tasot hippokampuksessa määritettiin kaupallisilla ELISA-pakkauksilla valmistajan ohjeiden mukaisesti (Hou et al., 2017).

Cistanchevoi lievittäämunuainensairaus

Suoliston mikrobiston koostumusprofiilianalyysi

Suoliston mikrobiotan kokonais-DNA ulostenäytteistä uutettiin aiemmin kuvatulla tavalla (Wei et al., 20{{20}}4). Kukin ulostenäyte (0,2 g) sekoitettiin 1 ml:aan PBS:ää ja homogenoitiin täysin kahdesti, sitten sentrifugoitiin 200 g:llä 6 minuuttia. Supernatanttiin lisättiin 20 x 20 % PVP:tä ja sentrifugoitiin 300 g:ssä 6 minuuttia. Saatua supernatanttia sentrifugoitiin sitten 12,{11}} g 6 minuuttia ja solupelletit kerättiin. Solupelletit pestiin PBS:llä ja sitten suspendoitiin uudelleen 300 ul:aan lysaatteja I (150 mM NaCl, 100 mM EDTA・Na2・2H2, pH 8,0). Suspensioon sekoitettiin 100 ui lysotsyymiliuosta (100 mg/ml) ja 20 ui 1 % RNaasia, 37°C:ssa lämminkylvyssä 30 minuuttia, sitten lisättiin 300 ui lysaattia II (100 mM NaCl, 500 mM Tris.0), pH 8, emäs. . Solususpensio sekoitettiin varovasti 50 x 20 prosentin SDS:n kanssa, jäähauteessa 5 minuuttia. Sitten DNA puhdistettiin uuttamalla peräkkäin 1 % PVP:llä, Tris-tasapainotetulla fenolilla ja kloroformi-isoamyylialkoholilla (tilavuus/tilavuus/tilavuus/tilavuus, 3,125:25:24:1) ja kloroformi-isoamyylialkoholilla (tilavuus/tilavuus, 24). :1), jota seuraa saostus -20 °C:ssa 2 tunnin ajan kahdella tilavuudella etanolia ja 50 [il 3 M NaAc:a. DNA kerättiin sentrifugoimalla, ilmakuivattiin ja liuotettiin 100 ul:aan steriiliä deionisoitua vettä. Nukleiinihapon puhtaus testattiin käyttämällä NanoDrop 2000c spektrofotometriä (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Yhdysvallat). Koko genomi-DNA alistettiin sitten PCR-monistukseen käyttämällä alukkeita, jotka ovat spesifisiä 16S-rRNA-geenin V3-V4-alueille: eteenpäin aluke 338F (5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3') ja käänteinen aluke 806R (5). '-GGACTACHVGGGTWTCTAAT- 3'). PCR-amplikonit puhdistettiin Agencourt AMPure -helmillä (Beckman Coulter, Indianapolis, IN, Yhdysvallat) ja kvantifioitiin käyttämällä PicoGreen dsDNA Assay Kit -sarjaa (Invitrogen, Carlsbad, CA, Yhdysvallat). Yksittäisen kvantifiointivaiheen jälkeen amplikonit yhdistettiin yhtä suurena määränä, ja paripään 2 x 300 bp sekvensointi suoritettiin käyttämällä Illumina MiSeq -alustaa MiSeq Reagent Kit v3:n kanssa Shanghai Personal Biotechnology Co., Ltd:ssä (Shanghai, Kiina). Pariliitoslukemat koottiin käyttämällä FLASH-ohjelmistoa (versio 1.2.7), raakasekvenssilukemat laadukkaasti trimmattiin QIIME-ohjelmistolla (versio 1.8.0) yhteensopimattomien viivakoodien ja pituuskynnysten alle jäävien sekvenssien poistamiseksi. Myöhemmin suodatetut sekvenssit ryhmiteltiin operatiivisiin taksonomisiin yksiköihin (OTU) 97 prosentin sekvenssin samankaltaisuuden kynnyksellä käyttämällä QIIME:tä UCLUSTin kanssa. Beta-diversiteetti suoritettiin QIIME:llä painotettua UniFrac-pääkoordinaattianalyysiä (PCoA) varten. Lopuksi Meta stats -ohjelmistoa käytettiin vertaamaan eroja suoliston mikrobien taksonomisessa koostumuksessa eri ryhmien välillä.

SCFA:iden pitoisuusanalyysi

SCFA-yhdisteiden (mukaan lukien asetaatti, propionaatti, butyraatti, isobutyraatti, valeriaanahappo, isovaleriinihappo ja heksaanihappo) pitoisuus rotan ulostenäytteissä määritettiin GC{{0}}-kaasukromatografilla (Shimadzu, Japani), joka oli sovitettu DB-FFAP-kolonnilla (30 mx 0,25 mm x {{10}},25 cm, Agilent, Yhdysvallat). Asetaatin, propionaatin, butyraatin, isobutyraatin, valeriaanahapon, isovalerihapon ja heksaanihapon standardiliuokset valmistettiin 1, 0.4, 0.2, 0.1, {{ 21}}.05, 0,01 ja 0,005 mg/ml eetterin kanssa (mukaan lukien 2- metyylivaleriaanahappo 0,1 mg/ml sisäisenä standardina). Kukin ulostenäyte (0,2 g) sekoitettiin 0,8 ml:aan deionisoitua vettä vorteksoimalla ja sentrifugoimalla 5, 000 rpm 20 minuuttia 4°C:ssa, 450 il supernatanttia lisättiin 50 il 50-prosenttisella H2SO4:lla ja 500 l:lla sisäistä standardia. liuoksella, vorteksoimalla 1 minuutin ajan ja sentrifugoimalla 12, 000 rpm 10 minuuttia, sitten seos laitettiin 4°C:seen 30 minuutiksi. Supernatantti otettiin GC-analyysiä varten. SCFA:iden analyysi suoritettiin aiemmin kuvatulla tavalla (Wang et al., 2016).

Tilastollinen analyysi

Kaikki tiedot esitettiin keskiarvoina 土 SEM. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttämällä SPSS 21.{1}} -ohjelmistoa (SPSS Inc., Chicago, IL, Yhdysvallat) yksisuuntaisella ANOVA:lla, jota seurasi Dunnettin testi tai Studentin t-testi. Tiedot jätettiin pois analyyseistä, jos keskipoikkeama oli suurempi kuin kaksi. Arvoja p < 0,05="" pidettiin="" tilastollisesti="" merkittävinä.="" pearsonin="" korrelaatioanalyysiä="" käytettiin="" suoliston="" mikrobiotan,="" scfa:iden,="" hippokampuksen="" 5-ht-,="" ne-="" ja="" bdnf-tasojen="" sekä="" paksusuolen="" 5-ht:n="" suhteellisen="" runsauden="" välisen="" yhteyden="">

Cistanchevoi parantaa vastustuskykyä ja alentaa verenpainetta

TULOKSET

CTE:n kemiallisen koostumuksen analyysi

CTE:n kemiallinen koostumus analysoitiin ensin kattavasti. Kuten taulukosta 1 käy ilmi, PhG:t olivat CTE:n pääkomponentti suhteellisella pitoisuudella 48,6 prosenttia, iridoideja ja iridoidiglykosideja 6,9 prosenttia ja sakkaridien kokonaismäärä oli 20,0 prosenttia. Nämä

CTE:n komponentit karakterisoitiin sitten käyttämällä UPLC-Q-TOF-MS:ää. Yhteensä 27 ainesosaa havaittiin ja tunnistettiin, mukaan lukien 20 PhG-aineosaa, viisi iridoidia ja iridoidiglykosidia ja kaksi oligosakkaridia. Yksityiskohtaiset tiedot, mukaan lukien retentioaika, tarkat MS- ja MS/MS-fragmentti-ionit, on lueteltu tukitiedoissa (lisätaulukko S2). CTE:n UPLC-Q-TOF-MS kokonaisionikromatogrammi (TIC) on esitetty lisäkuvassa S3.

CTE paransi CUS-rottien masennuskäyttäytymistä

CUS-rotilla kokonaisliikkumattomuusaika FST:ssä ja syömislatenssi NSFT:ssä vähenivät merkittävästi CTE-hoidolla, ja sakkaroosien mieltymys SPT:ssä ja kokonaismatka OFT:ssä lisääntyivät.

Kuvio 1A havainnollistaa CTE:n akuutteja vaikutuksia liikkumattomuusaikaan FST:ssä CUS-rotilla. Verrattuna CUS-malliryhmään, CTE:n akuutti suun kautta antaminen 3- päivän aikana vähensi merkittävästi liikkumattomuuden kokonaisaikaa FST:ssä [yksisuuntainen ANOVA, F(3,26)=4.983, p {{7} }.007]. Posthoc-analyysi paljasti, että hallinto

TAULUKKO 1|C. tubulosa -uutteen kemiallinen koostumus suuren annoksen ryhmässä (Dunnettin testi, p < 0.05)="" ja="" pieniannoksisessa="" ryhmässä="" (dunnettin="" testi,="" p="">< 0,05)="" osoitti="" huomattavan="" vähenemisen="" kokonaisliikkumattomuusaika="">

CTE:n vaikutukset sakkaroosipreferenssiin SPT:ssä CUS-rotilla on esitetty kuvassa 1B. 28 päivän stressimenettely aiheutti merkittävän laskun sakkaroosin mieltymyksissä CUS-malliryhmässä verrattuna ei-stressiintyneisiin kontrollirotteihin [yksisuuntainen ANOVA, F(4,34)=3.993, p {{8 }}.{{10}}09; Dunnettin testi, p < 0,05],="" mikä="" osoittaa,="" että="" cus-malli="" on="" kehitetty="" onnistuneesti.="" positiivisena="" kontrollina="" flx-ryhmä="" lisäsi="" merkitsevästi="" sakkaroosin="" mieltymystä="" cus-rotilla="" [yksisuuntainen="" anova,="" f(4,34)="3.993," p="0.009;" dunnettin="" testi,="" p="">< 0,05],="" joka="" osoittaa="" cus-mallin="" ennustavan="" validiteetin.="" cte:n="" krooninen="" oraalinen="" antaminen="" suuriannosryhmässä="" osoitti="" keskeisiä="" vaikutuksia="" sakkaroosin="" mieltymykseen="" [yksisuuntainen="" anova,="" f(4,34)="3.993,p=0.009;" dunnettin="" testi,="" p="">< 0,01],="" joka="" palautti="" sen="" normaalille="" tasolle="" cus-rotissa.="" pienen="" annoksen="" ryhmässä="" cte="" osoitti="" nousevaa="" trendiä,="" mutta="" vaikutus="" ei="" ollut="" tilastollisesti="" merkitsevä="" (dunnettin="" testi,="" p="">

Kuten kuvasta 1C on esitetty, OFT:n kokonaismatkaa käytettiin myös CTE:n vaikutusten arvioimiseen CUS-rotissa. Verrattuna ei-stressirotteihin CUS-malliryhmän kokonaisetäisyys oli paljon lyhyempi [yksisuuntainen ANOVA, F(4,34)=7.845, p=0.0{{ 19}01; Dunnettin testi, p < 0.001]="" 4-viikon="" cus-altistuksen="" jälkeen="" ja="" positiivinen="" kontrolli="" flx-hoito="" lisäsivät="" kokonaisetäisyyttä="" cus-rotilla="" [yksisuuntainen="" anova,="" f(4,34)="7.845," p="0.0001;" dunnettin="" testi,="" p="">< 0,05].="" cte:n="" päivittäinen="" oraalinen="" antaminen="" suurella="" ja="" pienellä="" annoksella="" osoitti="" selvää="" vaikutusta="" kokonaisetäisyyteen="" cus-rotilla="" [yksisuuntainen="" anova,="" f(4,34)="7.845," p="0.0001" ;="" dunnettin="" testi,="" p="">< 0,01="" suuren="" annoksen="" ryhmässä,="" p="">< 0,001="" alhaisen="" annoksen="" ryhmässä,="" vastaavasti].="" täydentävä="" kuva="" s4="" näyttää="" aktiivisuusratakartan="">

Kuvio 1D esittää CTE:n vaikutukset syömislatenssiin NSFT:ssä CUS-rotilla. Kaksikymmentäkahdeksan päivää kestänyt stressimenettely lisäsi merkittävästi syömisen aloittamisen latenssia CUS-malliryhmässä verrattuna ei-stressoituneisiin kontrollirotteihin [yksisuuntainen ANOVA, F(4,33)=3.434, p { {8}}.{{10}}19; Dunnettin testi, p < 0,05],="" mikä="" osoittaa,="" että="" cus-malli="" on="" kehitetty="" onnistuneesti.="" cte:n="" pitkäaikainen="" oraalinen="" anto="" suurella="" annoksella="" osoitti="" selviä="" vaikutuksia="" syömisen="" aloittamisen="" latenssiin="" verrattuna="" cus-ryhmään="" (studentin="" t-testi,="" t="2.759," p="">< 0,05),="" kun="" taas="" pieni="" cte-annos="" osoitti="" ei="">

CTE palautti välittäjäaineiden ja neurotrofisten tekijöiden tason CUS-rotissa

CTE:n vaikutukset {{{{10}}}}HT- ja NE-tasoihin CUS-rottien hippokampuksessa on esitetty kuvissa 2A, B. Neljän viikon stressimenettely aiheutti merkittävän 5-HT:n laskun [yksisuuntainen ANOVA, F(4,34)=17.13, p=0.0001; Dunnettin testi, p < 0,001]="" ja="" ne="" [yksisuuntainen="" anova,="" f(4,34)="6.376,p=0.0006;" dunnettin="" testi,="" p="">< 0,001]="" konsentraatio="" cus-rottien="" hippokampuksessa="" verrattuna="" kontrolliryhmään,="" ja="" masennuslääke="" flx="" palautti="" merkittävästi="" 5-ht-tasot="" hippokampuksessa="" [yksisuuntainen="" anova,="" f(4,34)="" {="" {25}}.13,="" p="0.0001;" dunnettin="" testi,="" p="">< 0,001].="" cte:n="" suun="" kautta="" antamisen="" jälkeen="" suuren="" annoksen="" ryhmässä="" havaittiin="" merkittävää="" 5-ht-tason="" nousua="">

ANOVA, F(4,34)=17.13, p=0.0001; Dunnettin testi, p < 0.001],="" kun="" taas="" ne-pitoisuudet="" eivät="" muuttuneet.="" samoin="" bdnf:n="" ilmentyminen="" väheni="" merkittävästi="" cus-malliryhmässä="" verrattuna="" ei-stressirottiin="" (studentin="" t-testi,="" t="4.171," p="">< 0,01)="" (kuva="" 2c).="" sekä="" cte:n="" pitkäaikainen="" oraalinen="" anto="" suurella="" annoksella="" (opiskelijan="" t-testi,="" t="2.548," p="">< 0,05)="" että="" flx="" (opiskelijan="" t-testi,="" t="2.263," p="">< 0,05)="" )="" lisäsi="" bdnf-ilmentymistä="" verrattuna="" cus-malliryhmään.="" cte="" pienellä="" annoksella="" ei="" osoittanut="" merkittävää="" vaikutusta="">

{0}}HT-taso CUS-rottien paksusuolessa oli erilainen kuin hippokampuksessa, eikä 4-viikon stressitoimenpiteellä ollut vaikutusta paksusuolen 5-HT:hen (kuva 2D ). Sitä vastoin CTE:n oraalinen anto suurella annoksella stimuloi paksusuolen 5-HT-tasoja verrattuna CUS-malliryhmään (Studentin t-testi, t=2.173, p < 0,05).="" cte="" pienellä="" annoksella="" ei="" osoittanut="" vaikutusta="" paksusuolen="">

CTE sääteli CUS-rottien suolen mikrobikoostumusta

CTE:n vaikutus CUS-rottien suoliston mikrobikoostumukseen arvioitiin 16S rRNA-geenin sekvensointiin perustuvalla menetelmällä. Havaittiin, että 28 päivän CTE:n oraalinen anto muutti CUS-rottien suoliston mikrobikoostumusta ja vaikutti erilaisiin

mikrobien taksonomiset tasot rottaryhmissä (luokka 1, luokkataso 1, perhetaso 1, sukutaso 8 ja lajitaso 2). Tämä viittaa siihen, että suoliston mikrobiyhteisöllä voi olla rooli CTE:n masennusta ehkäisevässä vaikutuksessa. Yksityiskohtaiset tiedot merkittävästi muuttuneista suoliston mikrobitaksoneista eri taksonomisilla tasoilla on esitetty taulukossa 2.

MiSeq-sekvensointi tuotti yhteensä 2 132 980 raakalukemaa laadunvalvonnan, kohinan poiston ja kimeeran poistoprosessin jälkeen. Seuraavaksi lukemat ryhmiteltiin OTU:ihin, jotka määritettiin taksoneille syrjästä lajitasolle. Beetan monimuotoisuusanalyysin tutkimus suoritettiin tutkimaan bakteeriyhteisöjen samankaltaisuutta viiden rottaryhmän välillä. PCoA, joka perustuu suoliston mikrobiotan painotettuihin UniFrac-etäisyyksiin viidestä tutkimusryhmästä, on esitetty kuvassa 3A. PCoA:n beetan monimuotoisuusanalyysi osoitti mikrobiyhteisön selkeän eron kontrolliryhmästä ja CUS-malliryhmästä, kun taas CTE-ryhmä, jolla oli suuri annos, suuntautui olemaan lähempänä kontrolliryhmää CUS-ryhmään verrattuna.

Metastatic analysis was used to investigate the differences in gut microbial taxonomic composition among different groups. At the phylum level, the most dominant microbial taxa in the five rat groups were Firmicutes and Bacteroidetes (Figure 3B). Lactobacillus, Ruminococcus, Blautia, Bacteroides, and Prevotella were the most highly abundant microbial taxa at the genus level (Figure 3C). The two dominant phyla, Firmicutes and Bacteroidetes, accounted for a combined relative abundance of >90 prosenttia. Kuten lisäkuvissa S5A, B on esitetty, 4 viikon stressimenettely aiheutti ei-merkittävän trendin kohti kohonnutta Firmicutes-tasoa ja ei-merkittävää Bacteroidetesen vähenemistä CUS-malliryhmässä verrattuna kontrolliryhmään. CTE:n päivittäisen suuren ja pienen annoksen antamisen jälkeen Firmicutes- ja Bacteroidetes-bakteerien suhteellinen runsaus palasi samalle tasolle kuin vertailuryhmässä, vaikkakaan ilman tilastollista merkitystä. Ja vaikka samanlaisia ​​muutoksia havaittiin Firmicutes / Bacteroidetes -suhteessa rottaryhmien välillä, tilastollisia eroja ei esitetty (lisäkuva S5C). CUS-malliryhmässä havaittiin ei-merkittävä suuntaus kohti alentunutta syanobakteeritasoa verrattuna kontrollirottiin, joka ei ollut stressaantunut; kun taas CTE:n antaminen suurella annoksella johti merkittävästi syanobakteerien suhteellisen runsauden lisääntymiseen verrattuna CUS-ryhmään (lisäkuva S5D).

Suvun tasolla Bacteroides ja Ruminococcus olivat kaksi runsainta mikrobitaksonia, joiden suhteellinen runsaus oli noin 30 prosenttia kaikissa viidessä rottaryhmässä. Neljän viikon stressimenettely aiheutti Bacteroides-bakteerien suhteellisen runsauden merkittävän vähenemisen ja Ruminococcus-bakteerin merkittävän lisäyksen CUS-malliryhmässä verrattuna stressittömään kontrollirottiin (kuviot 4A, B). Pitkäaikainen CTE:n antaminen johti Bacteroides-bakteerien runsauden merkittävään lisääntymiseen sekä Ruminococcus-bakteerin merkittävään vähenemiseen verrattuna CUS-rottiin. Lisäksi kuusi Parabacteroides-, Butyricimonas-, Deinococcus-, Weissella-, Trichococcus- ja Brachybacterium-sukua osoitti tilastollisesti merkitseviä eroja CUS-malliryhmän ja kontrolliryhmän välillä (kuvat 4C-H). 28 päivän CTE-hoidon jälkeen edellä mainittujen kuuden suvun suhteellinen runsaus muuttui vastaavasti tasolle, joka oli samanlainen kuin kontrolliryhmässä.

Deinokokkien alhainen runsaus eri taksonomisilla tasoilla, mukaan lukien luokkatasolla (Deinococci), luokkatasolla (Deinococcales), perhetasolla (Deinococcaceae) ja sukutasolla (Deinococcus), havaittiin CUS-rottaryhmässä, kun taas sitä ei havaittu kontrollissa. ryhmä ja hallintoryhmät (kuviot 5A-D).

Lajitasolla Weissella beninensis oli paljon alhaisempi CUS-ryhmässä kuin kontrolliryhmässä, ja suhteellisen runsauden merkittävä lisääntyminen havaittiin CTE:n suuren annoksen antamisen jälkeen (kuva 5E). Sitä vastoin CTE:n antaminen kumosi Brachybacterium-konglomeraatin suhteellisen runsauden merkittävän kasvun, joka havaittiin CUS-rotissa (kuvio 5F).

CTE-moduloidut SCFA:t CUS-rotissa

SCFA-pitoisuudet (mukaan lukien asetaatti, propionaatti, butyraatti, isobutyraatti, valeriaanahappo, isovalerianihappo ja heksaanihappo) rotan ulostenäytteissä analysoitiin GC:llä, ja ne on esitetty kuvassa 6. Asetaatin tasot [yksisuuntainen ANOVA, F( 4,32)=2.721, p=0.0467; Dunnettin testi, p < 0.05]="" ja="" heksaanihappo="" [yksisuuntainen="" anova,="" f(4,30)="3.028," p="" {{15="" }}.0328;="" dunnettin="" testi,="" p="">< 0,05]="" lisääntyi="" merkittävästi="" cus-malliryhmän="" rotilla="" verrattuna="" kontrolliryhmään.="" pitkäaikaisen="" cte:n="" suuren="" annoksen="" antamisen="" jälkeen="" asetaatti="" (studentin="" t-testi,="" t="2.182," p="">< 0,05)="" ja="" heksaanihappo="" [yksisuuntainen="" anova,="" f(4,30)="3" .028,="" p="0.0328;" dunnettin="" testin="" p="">< 0,05]="" pitoisuudet="" olivat="" pääosin="" alentuneita="" verrattuna="" cus-ryhmään,="" mikä="" osoittaa,="" että="" cte="" saattaa="" käyttää="" masennusta="" ehkäisevää="" aktiivisuuttaan="" moduloimalla="" häiriintynyttä="" neuroaktiivista="" metaboliittia="" scfa:ita.="" cte:n="" anto="" pienen="" annoksen="" ryhmässä="" osoitti="" laskevaa="" suuntausta,="" mutta="" ei="" merkittävää="" vaikutusta="" asetaatti-="" ja="">

Suoliston mikrobiston, neurotransmitterien ja neurotrofiinien korrelaatioanalyysi hippokampuksessa, 5-HT paksusuolessa ja SCFA:t

Pearsonin korrelaatiokertoimet kehitettiin Pearsonin korrelaatiokertoimien tutkimiseksi sukutason muuttuneiden suolen mikrobiotan, aivotursissa ja paksusuolen muuttuneiden välittäjäaineiden ja neurotrofiinien sekä häiritsevän SCFA-pitoisuuksien toiminnallisen suhteen tutkimiseksi (Meng et al., 2017). Niiden väliset korrelaatiot (r > 0.4 tai r < -0.4,="" p="">< 0.05)="" on="" esitetty="" kuvassa="" 7.="" kertoimet="" osoittivat="" vahvaa="" korrelaatiota="" muuttuneen="" suoliston="" mikrobiota="" koostumuksen="" ja="" pitoisuuden="" välillä="" suvun="" tasolla.="" seitsemän="" tyyppistä="" scfa:ta="" ja="" masennukseen="" liittyviä="" monoamiinin="" välittäjäaineita="" (5-ht="" ja="" ne).="" ruminococcus-bakteerien="" runsaus="" osoitti="" merkittävän="" negatiivisen="" korrelaation="" 5-ht-pitoisuuden="" kanssa="" hippokampuksessa,="" mikä="" tarkoittaa,="" että="" cus-menettely="" johtaa="" ruminococcus-bakteerin="" suhteellisen="" runsauden="" kasvuun="" ja="" 5-ht-pitoisuuksien="" vähenemiseen.="" cte-hoidon="" jälkeen="" ruminococcus-bakteerin="" suhteellinen="" runsaus="" väheni="" kontrolliryhmän="" tasolle="" ja="" 5-ht-tasojen="" havaittiin="" parantuneen.="" lisäksi="" bacteroides-bakteerien="" suhteellinen="" runsaus="" korreloi="" positiivisesti="" 5-ht-tason="" kanssa="" hippokampuksessa="" ja="" liittyi="" negatiivisesti="" butyraatin,="" isobutyraatin,="" valeriaanahapon,="" isovalerihapon="" ja="" heksaanihapon="" pitoisuuteen;="" parabacteroidien="" runsaus="" osoitti="" merkittävän="" positiivisen="" korrelaation="" 5-ht-tason="" kanssa="" hippokampuksessa="" ja="" propionaattipitoisuudessa,="" kun="" taas="" se="" osoitti="" negatiivista="" korrelaatiota="" isobutyraatti-="" ja="" isovaleriinihappopitoisuuksien="" kanssa;="" merkittävästi="" positiivinen="" yhteys="" butyricimonas-bakteerien="" suhteellisen="" runsauden="" ja="" ne-tason="" välillä="" hippokampuksessa="" havaittiin="" myös,="" ja="" deinococcus-bakteerin="" suhteellinen="" runsaus="" korreloi="" positiivisesti="" asetaattipitoisuuden="" kanssa.="" tämä="" osoitti,="" että="" cte="" saattaa="" käyttää="" masennusta="" ehkäisevää="" vaikutustaan="" ​​muuttamalla="" suoliston="" mikrobiston="" koostumusta,="" häiritsemällä="" hippokampuksen="" välittäjäainetasoja="" ja="" palauttamalla="" neuroaktiivisia="" metaboliitteja="" scfa:t.="" yksityiskohtaiset="" tiedot="" korrelaatioanalyysistä="" on="" esitetty="" lisätaulukossa="">