Osa 1: Akteosidirepressoitu Microglia M1 -polarisaatio inhiboidun NF-κB-signalointireitin ja AMPK-välitteisen mitokondrioiden toiminnan palautumisen kautta

Yhteystiedot: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Sähköposti:audrey.hu@wecistanche.com

Pls napsauta tästä päästäksesi osaan 2

Abstrakti:

Tausta:Alzheimerin tauti (AD)on yleisin dementian tyyppi. Sillä aikaaakteosidi cistanche-yrtistä(ACT), yhdiste, joka on eristetty Cistanchetubulosa, sillä on hermostoa suojaavia ominaisuuksia. Mikrogliapolarisaation säätelyn taustalla oleva mekanismi on kuitenkin edelleen huonosti määritelty.Menetelmät:Tässä AlCl3--indusoitua AD-mallia seepran toukissa käytettiin paljastamaan ACT:n terapeuttinen teho. BV-2-soluja käytettiin osoittamaan ACT:n rooli mikrogliapolarisaatiossa. RNA-sekvenssi, HPLC-Q-TOF-MS, Western blot ja molekyylitelakointi yhdistettiin sen mekanismin vahvistamiseksi.Tulokset:ACT paransi merkittävästi seepran kokeellista dyskinesiaa ja hermoston häiriöitä. Myöhemmin se tukahdutti M1-polarisaation ja edisti M2-fenotyyppiä LPS-indusoiduissa BV-2-soluissa. Osoitimme ensin, että ACT:llä oli syvällinen transkriptiovaikutus, joka sisälsi in§ammation, arginiinin biosynteesin sekä pantotenaatin ja CoA:n biosynteesin säätelyn, mikä korreloi mitokondrioiden toiminnan kanssa. TOIMIA(akteosidi cistanche-yrtistä) käsittely vähensi mikroglia M1 polarisaatiota estämällä NF-KB-signalointireittiä. Ja aineenvaihduntareitit vahvistettiin edelleen HPLC-Q-TOF-MS:llä. Lisäksi ACT oikaisi liiallisen ROS:n palauttaakseen mitokondrioiden toiminnan AMPK-välitteisen PGC-1- ja UCP-2-ylössäätelyn kautta, mikä on sopusoinnussa metabolisten muutosten kanssa. Mielenkiintoista on, että ACT voi sitoutua suoraan sekä NF-KB:hen että AMPK:hen, kuten molekyylitelakka osoittaa.Johtopäätökset:Tutkimus tarjosi ACT:n infusiivisen mekanismin ja havainnollistaa uutta mitokondrioiden toimintahäiriöön perustuvaa näkökulmaa paljastamaan aineenvaihdunnan ja mikrogliapolarisaation välistä yhteyttä.

Tausta:

Alzheimern sairautta(AD) on yleinen hermostoa rappeuttava sairaus, johon liittyy kognitiivisia häiriöitä ja dyskinesia[1]. Sille on ominaista vakava hermosolujen menetys, seniilit plakit ja hermosolujen vyyhtymä[2]. AD:n patogeneesi on moniulotteinen ja liittyy neuroin§ammaatioon. Neuroin§ammaatiota ohjaa gliasolujen aktivaatio, joka liittyy läheisesti AD:n kehittymiseen[3, 4]. Neuroin§ammaation etenemisen ja pahenemisen aikana mikrogliaa pidetään avaintekijänä. Mikrogliat ovat keskushermoston ensisijaisia ​​immuunisoluja. Se liittyy läheisesti prosessien sarjaan, joka sisältää aivojen kehityksen, ylläpitää neutraalia ympäristöä sekä reagoi vammoihin ja korjauksiin[1]. Lisäksi mikroglia voidaan stimuloida M1-fenotyyppiin ja pro-in§immatoristen sytokiinien ilmentyminen lisääntyy, kun esiintyy neuroin§ammaatioon liittyviä sairauksia, kuten AD[5]. Tutkimukset osoittavat myös, että polarisoitumiseen M1-fenotyyppiin liittyy usein aineenvaihduntahäiriöitä[6], mikä aiheuttaa energia-aineenvaihdunnan epätasapainoa ja mitokondrioiden toimintahäiriöitä[7]. Nämä haitalliset muutokset ovat peräisin hermoston rappeutumisesta, jopa AD:sta.

akteosidi cistanche-yrtistä(ACT), fenyylietanoidiglykosidi, on pääasiassa peräisin Cistanchetubulosa. Yhä useammat todisteet ovat osoittaneet, että ACT:llä oli lukuisia farmakologisia vaikutuksia, mukaan lukien hermoja suojaava[8], tulehduksia estävä[9] ja antioksidanttivaikutus[10]. Erityisesti ACT:n on raportoitu parantavan oppimisen ja muistin heikkenemistä sekä lisäävän energia-aineenvaihduntaa streptotsotosiinin aiheuttamissa rotissa[11]. Sen on myös ehdotettu estävän hermosolujen apoptoottista solukuolemaa ja mitokondriovaurioita kokeellisissa autoimmuuni-enkefalomyeliittihiirissä [12]. Vähemmän tutkimuksia on kuitenkin keskittynyt ACT:n vaikutukseen mikroglian M1/M2 polarisaatioon. Erityisesti erilaisia ​​mekanismeja, kuten mitokondrioiden toiminnan korjaaminen ja solujen aineenvaihdunnan säätely, ei ole suoritettu. Lisäksi ACT:n mekanismi, joka vaikutti mikroglian M1/M2-polarisaatioon, on jäänyt tutkimatta.

Tämän raportin tarkoituksena oli tutkia ACT:n terapeuttista tehokkuutta sekä ACT:n taustalla olevaa molekyylimekanismia AD:ssa. Tässä ACT osoitti merkittävää hermostoa suojaavaa vaikutusta AlCl3--indusoiduissa AD-seepran toukissa. Lisäksi ACT esti tehokkaasti M1-polarisaatiota ja edisti M2-fenotyyppiä LPS-indusoiduissa BV-2-soluissa. RNA-sekvensointi (RNA-Seq) integroituna metabolomiikkamenetelmään ymmärtääkseen paremmin ACT:n taustalla olevan mekanismin mikrogliapolarisaation säätelyssä. Tutkittiin aineenvaihdunnan ja mikrogliapolarisaation välistä ylikuulumista mitokondrioiden toiminnan kannalta. Tämä tutkimus tarjoaa uutta kunnioitusta ACT:n lisätutkimukselle mahdollisena terapeuttisena aineena AD:n hoidossa.

Menetelmät:

Eläinten ja mallien ryhmittely:

Villityypin seepra (AB-kanta, 4 kuukautta vanha) valittiin tähän tutkimukseen (Nanjing Qi Wu Biotechnology Co., Ltd.). Niitä pidettiin 14/10 tunnin valo/pimeyden syklissä 28 asteessa edellisen menetelmän mukaisesti[13]. Luonnollinen lannoite ja normaalisti kehittyneet alkiot luotiin ja viljeltiin 3 päivää hedelmöityksen jälkeen (dpf) valaistusinkubaattorissa. Kaikki seeprakokeet suoritettiin Kiinan farmaseuttisen yliopiston eläineettisen komitean valvonnassa.

Seepran toukat jaettiin kuuteen ryhmään ja niitä käsiteltiin 3 dpf - 7 dpf: kontrolliryhmä, malliryhmä, malli plus donepetsiilihydrokloridi (DPZ) ryhmä, malli plus ACT ryhmät. Kontrolliryhmää pidettiin väliaineessa, jossa oli 0,2 prosenttia DMSO:ta, ja malliryhmää käsiteltiin 150 µM AlCl3:lla (pH 5,8). Malli plus DPZ-ryhmä käsiteltiin yhdessä AlCl3:lla ja 8 μM DPZ:llä. Malli plus ACT-ryhmät käsiteltiin yhdessä AlCl3:lla ja eri ACT-pitoisuuksilla (200, 100, 50 µM). TOIMIA(akteosidi cistanche-yrtistä)(HPLC-puhtaus suurempi tai yhtä suuri kuin 98 prosenttia) saatiin yhtiöltä Baoji Herbest Bio-Tech Co., Ltd. (Baoji, Kiina). AlCl3·6H2O ja DPZ ostettiin Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., LTD:ltä. (Shanghai, Kiina).

Käyttäytymisanalyysi

Seepran toukkien liikkeet tallennettiin ViewPoint-käyttäytymisanalysaattorilla (Zebralab 2018, ViewPoint Life Sciences Co., Ltd.) 28 asteessa. Brie§y, käyttäytymisparametrit ja tulosten käsittely olivat yhdenmukaisia ​​aiemmin luomamme menetelmän kanssa[13]. Tässä valittiin keskinopeus (AS), nopeuden muutos (ΔS), dyskinesian palautumisaste (DRR) ja vastetehokkuus (RE, prosenttia) seepran dyskinesian palautumisen arvioimiseksi.

Käsittelyn jälkeen 3 dpf - 7 dpf seepran toukat kerättiin AChE- ja ChAT-aktiivisuuden mittaamiseksi. Valmistajan protokollan perusteella aktiivisuus havaittiin entsyymikytkettyjen immunosorbenttimääritysten (ELISA) kitteillä (MLBIO biotechnology Co. Ltd., Shanghai, Kiina). Ja eri näytteiden proteiinipitoisuudet määritettiin BCA-menetelmällä.

BV-2 solut kylvettiin 6-kuoppamaljaan erikseen (n=6/ryhmä). Käsittelyn jälkeen väliaine poistettiin ja solut pestiin kolme kertaa kylmällä PBS:llä. Sitten välittömästi alttiina nestemäiselle typelle solujen aineenvaihdunnan tukahduttamiseksi. Solut otettiin talteen kylmällä 80-prosenttisella metanolilla (1 ml/kuoppa) ja suspensio siirrettiin 2 ml:n Eppendorf-putkeen. Proteiinin saostumisen helpottamiseksi vorteksoi voimakkaasti 1 minuutin ajan ja sentrifugoi 13, 000 rpm 15 minuuttia 4 asteessa. Solususpensio siirrettiin uuteen 2 ml:n Eppendorf-putkeen ja kuivattiin typpivirran alla ja säilytettiin -80 asteessa analyysiin asti. Kuivattu jäännös liuotettiin 150 µl:aan esijäähdytettyä 25-prosenttista asetonitriiliä. Sekvenssianalyysin vakauden ja tarkkuuden varmistamiseksi yhdistettiin yhtä suuret tilavuudet (10 μL) jokaista solunäytettä laadunvalvontanäytteiksi (QC). Metaboliitin havaitsemisen aikana nämä näytteet injektoitiin jokaisen kuuden solunäytteen jälkeen niiden stabiilisuuden varmistamiseksi. 1 µl:n alikvootti injektoitiin HPLC-Q-TOF-MS:ää varten.

HPLC-Q-TOF-MS-analyysi suoritettiin Agilent 1290 HPLC-järjestelmällä, joka oli yhdistetty Agilent 6530 Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF) -massaspektrometriin (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Erotus suoritettiin ACQUITY UPLC BEH C18 -kolonnilla (2,1 × 100 mm, 1,7 μm). Liikkuva faasi koostui 0,1 % muurahaishappo-vedestä (v/v; A) ja asetonitriilistä (B).

§ow-nopeus asetettiin arvoon {{0}},4 ml/min seuraavilla optimaalisilla gradienttieluointiolosuhteilla: 0 - 2 min, 5 prosenttia B; 2 - 20 min, 5 - 95 prosenttia B (positiivinen ionitila); 0 - 2 min, 5 prosenttia B; 2 - 20 min, 5 - 95 prosenttia B (negatiivisen ionin tila). Massaspektrometrin toimintaparametrit asetettiin seuraavasti: kaasun lämpötila, 320 astetta; kuivauskaasu, 10 l/min; sumutin, 35 psi; VCap, 4000 V; fragmentti, 120 V.

Raakadataa käytettiin MassHunter Workstation Softwaren versiolla B.07.00 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Raakadata esikäsiteltiin XCMS-alustalla. Normalisoidun datan pääkomponenttianalyysi (PCA) ja osittainen pienimmän neliösumman erotteluanalyysi (PLS-DA) suoritettiin MetaboAnalystilla (https://www.metaboanalyst.ca). Yhdessä kirjallisuuden kanssa eroavat metaboliitit (VIP > 1, T-testi P< 0.05)="" were="" identi¦ed="" on="" hmdb="" (https://hmdb.ca).="" finally,="" pathway="" analysis="" was="" conducted="" with="">