Osa 1: Akteosidi vastustaa interleukiini-1 -indusoituja katabolisia prosesseja mitogeeniaktivoitujen proteiinikinaasien ja NFkB-solusignaalireitin kautta

Yhteystiedot: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Sähköposti:audrey.hu@wecistanche.com

HyangI Lim, 1 Do Kyung Kim, 1 Tae-Hyeon Kim, 1 Kyeong-Rok Kang

Nivelrikko (OA) on yleisin rappeuttava nivelsairaus, johon liittyy kroonista nivelkipua, jonka aiheuttaa nivelruston progressiivinen rappeutuminen nivelen nivelissä.Acteoside, kofeoyylifenyylietanoidiglykosidilla, on erilaisia biologisia vaikutuksia, kuten antimikrobinen, anti-inflammatorinen, syöpää ehkäisevä, antioksidantti, sytoprotektiivinen ja hermostoa suojaava vaikutus. Lisäksi suun kautta antaminenakteosidisuurilla annoksilla ei aiheuta genotoksisuutta. Tämän vuoksi tämän tutkimuksen tavoitteena on varmistaa antikataboliset vaikutuksetakteosidinivelrikkoa ja sen antikatabolista signalointireittiä vastaan.Acteosideei vähentänyt normaaleina soluina käytettyjen hiiren fibroblasti L929 -solujen ja rotan primaaristen kondrosyyttien elinkykyä.Acteosidevastusti IL-1 -indusoitua proteoglykaanien häviämistä rustosoluissa ja nivelrustossa estämällä rustoa hajottavan entsyymin, kuten matriisin metalloproteinaasi- (MMP-) 13, MMP-1 ja MMP{, ekspressiota ja aktivaatiota {6}}. Lisäksi akteosidi tukahdutti tulehduksellisten välittäjien, kuten indusoituvan typpioksidisyntaasin, syklo-oksigenaasin-2, typpioksidin ja prostaglandiini E2:n, ilmentymisen primaarisissa rotan rustosoluissa, joita oli käsitelty IL-1:lla. Myöhemmin akteosidi vähensi tulehdusta aiheuttavien sytokiinien ilmentymistä primaarisissa rotan kondrosyyteissä, joita oli käsitelty IL-1:lla. Lisäksi akteosidi ei estänyt vain mitogeenin aktivoimien proteiinikinaasien fosforylaatiota primaarisissa rotan kondrosyyteissä, joita oli käsitelty IL-1:lla, vaan myös NFkB:n translokaatiota sytosolista tumaan sen fosforylaatiota vaimentamalla. Suun kautta antaminen 5 ja 10 mg/kg akteosidia heikensi nivelruston progressiivista rappeutumista nivelrikkoisessa hiirimallissa, jonka synnytti mediaalisen meniskin epävakauttaminen. Löytömme osoittavat senakteosidion lupaava mahdollinen antikatabolinen aine tai lisäaine nivelruston progressiivisen rappeutumisen vaimentamiseen tai estämiseen.

cistanche-acteoside

cistanche-akteosidi

1. Esittely

Nivelrikko (OA) on yleisin rappeuttava nivelsairaus, johon liittyy kroonista nivelkipua, jonka aiheuttaa nivelruston progressiivinen rappeutuminen nivelen nivelissä [1]. Elinajanodotteen pidentymisestä johtuen OA:n, johon liittyy liikkuvuuden menetys ja krooninen nivelkipu, jonka aiheuttaa nivelruston progressiivinen rappeutuminen nivelnivelissä, arvioidaan olevan 18 prosenttia naisilla vaihdevuosien jälkeen ja 9,6 prosenttia miehillä [2 ]. Vaikka OA:n maailmanlaajuinen levinneisyys lisääntyy vuosittain, OA:n patofysiologinen etiologia on edelleen tuntematon. Se voi johtua hyvin monimutkaisista ja monitekijäisistä riskitekijöistä, kuten ikääntymisestä, sukupuolesta, geneettisestä perinnöstä, traumaattisista nivelvaurioista ja vakavasta mekaanisesta nivelkuormituksesta. Lisäksi neuropatologisia yhteyksiä nivelruston progressiivisen rappeutumisen ja kroonisen nivelkivun kehittymisen välillä ei tunneta [3]. Tästä syystä OA-potilaiden kliinisen hoidon tavoitteena on ylläpitää kehon liikkuvuutta ja mekaanista niveltoimintaa helpottamalla kroonista nivelkipua käyttämällä farmakologisia ja ei-farmakologisia lähestymistapoja ja nivelleikkauksia. Tarve kehittää tehokkaita interventioita tai täydennyksiä, joilla on pitkäaikainen biologinen turvallisuus, OA:n ehkäisemiseksi tai lieventämiseksi elämänlaadun ylläpitämiseksi ylläpitämällä ikääntyneiden nivelten mekaanista toimintaa, kasvaa.

Kuten kuvasta 1 näkyy, akteosidi (CAS-nro 61276-17-3; C29H36O15) on kofeoyylifenyylietanoidiglykosidi, joka on eristetty useista yrttikasveista, kuten Verbascum chlorides [4], Buddleja globosa [5] ja Plantago australis [6]. Akteosidilla on erilaisia biologisia vaikutuksia, kuten antimikrobinen [5], anti-inflammatorinen [7], syöpää [8], antioksidantti [9], sytoprotektiivinen [9] ja hermostoa suojaava vaikutus [10]. Lisäksi akteosidin suun kautta antaminen suurina annoksina ei aiheuta genotoksisuutta [11].

Tästä syystä oletimme, että anti-inflammatorisella biologisella turvallisuudella varustetulla akteosidilla on antikatabolisia vaikutuksia, jotka liittyvät nivelruston suojaamiseen nivelruston progressiiviselta rappeutumiselta estämällä katabolisia tekijöitä, kuten tulehdusta aiheuttavat sytokiinit, synteettiset entsyymit ja nivelen tulehdusten välittäjät. . Tästä syystä tämän tutkimuksen tavoitteena oli tutkia akteosidien aiheuttamia antikatabolisia vaikutuksia ja sen solujen signaalireittiä sekä in vitro käyttäen primaarisia kondrosyyttejä, jotka on eristetty rotan polvinivelen nivelrustosta, että in vivo käyttäen kirurgisesti luotua OA-eläinmallia. mediaalisen meniskin epävakaus hiirten polvinivelessä.

cistanche-acteoside

akteosidistacistanche

2. Menetelmät

2.1. Soluviljely. Primaariset rotan kondrosyytit eristettiin rotan (5-päivän ikäinen; Sprague–Dawley) polvinivelten nivelrusto Institutionalin hyväksymän protokollan (CIA-CUC2019-A0027) mukaisesti. Chosunin yliopiston eläinten hoito- ja käyttökomitea, Gwangju, Korean tasavalta. Eristettyjä primaarisia rotan kondrosyyttejä pidettiin Dulbeccon Modiﬁed Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) (Thermo Scientiﬁc, Rockford, IL, USA), jota oli täydennetty 10 prosentilla fetal bovine seerumilla (FBS) (Life Technologies) , Grand Island, NY, USA), antibiootit (50 U/ml penisilliiniä ja 50 ug/ml streptomysiiniä) ja 50 ug/ml askorbiinihappoa. Normaali hiiren fibroblasti L-929 -solulinja ostettiin American Type Culture Collectionilta (ATCC). ATCC:n antamien ohjeiden mukaan L-929-soluja viljeltiin Eaglen vähimmäisväliaineessa, joka sisälsi 10 prosenttia FBS:ää, ja kasvatettiin kostutetussa inkubaattorissa 37 asteessa 5 prosentin CO2:n kanssa.

2.2. Solujen elinkelpoisuusmääritys. Dimetyylitiatsolyylidifenyylitetratsoliumsuolan (MTT) määritys suoritettiin normaalisoluina käytettyjen hiiren fibroblastisolulinjan L929 solujen ja akteosidilla käsiteltyjen primaaristen rotan kondrosyyttien elinkyvyn arvioimiseksi. Lyhyesti sanottuna L929-soluja ja primäärisiä rotan kondrosyyttejä viljeltiin solutiheydellä 8 x 105 solua/ml viljelylevyillä 24 tuntia ja sitten niitä käsiteltiin 2,5, 5, 10, 25, 50 ja 100 µM akteosidilla 24 tunnin ajan. MTT-liuoksella käsittelyn jälkeen sekä L929-soluja että kondrosyyttejä viljeltiin edelleen 4 tuntia. Inkuboinnin jälkeen muodostuneet MTT-kiteet suspendoitiin kokonaan dimetyylisulfoksidiin ja mitattiin absorbanssi 570 nm:ssä käyttämällä spektrometriä (Epoch microplate spectrophotometer, BioTek®, Winooski, VT, USA) solujen elinkelpoisuuden arvioimiseksi.

2.3. Cell Live/Dead Assay. Solujen eloonjääminen suoritettiin käyttämällä Cell Live/Dead -testisarjaa (Molecular Probes, Carlsbad, CA, USA), joka koostuu vihreästä kalseiini-AM:sta elävien solujen leimaamiseen (vihreällä fluoresenssilla) ja etidiumhomodimeeristä-1 kuolleiden leimaamiseen. solut (punaisella fluoresenssilla). Lyhyesti sanottuna sekä L929-soluja että primäärisiä rotan kondrosyyttejä viljeltiin solutiheydellä 8 × 105 solua/ml kammiolevyillä (Nunc® Lab-Tek® Chamber Slide™ -järjestelmä; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) 24 tuntia ja käsiteltiin sitten 50 ja 100 µM akteosidia 24 tunnin ajan. Viljelyn jälkeen suoritettiin solujen eloonjäämismääritys valmistajan ohjeiden mukaisesti. Sen jälkeen värjäytyneet solut kuvattiin käyttämällä fluoresenssimikroskooppia (Eclipse TE200; Nikon Instruments, Melville, NY).

2.4. Dimetyylimetyleenisininen (DMMB) -määritys. DMMB-määritys suoritettiin proteoglykaanipitoisuuden muutoksen arvioimiseksi primaarisissa rotan kondrosyyteissä, joita oli käsitelty akteosidilla 21 päivän ajan IL-1:n läsnä ollessa tai poissa ollessa. Primaaristen rotan kondrosyyttien ominaisuuksien säilyttämiseksi 21 päivän ajan, primaariset rotan kondrosyytit (2 x 106 solua) suspendoitiin 1 ml:aan 1,2-prosenttista alginaattia ja sitten kapseloitiin tiputtamalla solu/alginaattisuspensio 105 mM CaCl2-liuokseen. Primaarisia alginaattiin kapseloituja rotan kondrosyyttejä viljeltiin 24 tuntia DMEM/F12:ssa (joka sisälsi 10 prosenttia FBS:ää, 50 U/ml penisilliiniä, 50 ug/ml streptomysiiniä ja 50 ug/ml askorbiinihappoa) ja mukautettiin sitten 24 tuntia DMEM/F12-prosenttisessa liuoksessa. mini-insuliini-transferriini-seleeni (mini-ITS) ja 50 ug/ml askorbiinihappoa. Myöhemmin kondrosyyttejä käsiteltiin 50 tai 100 µM akteosidilla 1 ng/ml IL-1 läsnäollessa tai poissa ollessa 21 päivän ajan. Päivänä 21 primaariset rotan kondrosyytit kerättiin proteoglykaanipitoisuuden arvioimiseksi käyttämällä DMMB-määritystä, kuten aiemmin on kuvattu [12]. Lisäksi proteoglykaanipitoisuuden kvantifioimiseksi solua kohden ja primääristen rotan kondrosyyttien proliferaation arvioimiseksi solumäärät mitattiin DNA-määrityksellä käyttäen PicoGreeniä (Molecular Probes, Carlsbad, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

2.5. Rotan nivelrustokudosten ex vivo -elinviljely. Nivelrustokudokset eristettiin 5-päivän ikäisten Sprague-Dawley-rottien polvinivelistä ja viljeltiin sitten DMEM/F12:ssa, jota oli täydennetty 10 prosentilla FBS:llä. Seuraavaksi nivelrusto

näytteet käsiteltiin 100 µM akteosidilla10 ng/ml IL-1 läsnäolo tai puuttuminen 7 päivän ajan. Viljelyjakson lopussa näytteet kerättiin ja kiinnitettiin 4-prosenttiseen paraformaldehydiin 72 tunnin ajan histologista analyysiä varten.

2.6. Histologinen analyysi. Histologinen analyysi käyttäen safraniini-O:ta ja nopeaa vihreää värjäystä suoritettiin proteoglykaanin häviämisen varmistamiseksi nivelrustossa, jota käsiteltiin 100 µM akteosidilla 10 ng/ml IL-1 läsnäollessa tai poissa ollessa 7 päivän ajan. Lyhyesti sanottuna kiinteät nivelrustonäytteet poistettiin kalkkia etyleenidiamiinitetraetikkahapossa ja upotettiin sitten parafiiniin. Sen jälkeen valmistetut parafiinilohkot, jotka sisälsivät nivelrustoa, leikattiin sarjassa 5 μm:n paksuisiksi ja asetettiin objektilaseille. Tämän jälkeen suoritettiin safraniini-O ja nopea vihreä värjäys proteoglykaanin häviämisen arvioimiseksi nivelruston pohjaaineessa. Lisäksi suoritettiin hematoksyliini- ja eosiinivärjäys nivelruston yleisen morfologian tarkkailemiseksi.

2.7. Western Blotting. Western blot -analyysi suoritettiin katabolisten tekijöiden, mukaan lukien MMP-13, MMP-1, MMP-3, indusoituvan typpioksidisyntaasin (iNOS) ja syklo-oksigenaasin-2 (COX) ilmentymisen tutkimiseksi. -2) ja solujen signalointimolekyylien, kuten mitogeenin aktivoimien proteiinikinaasien ja ydintekijä-kappa B:n (NFkB) muuttaminen. Lyhyesti, rotan primaarisia kondrosyyttejä käsiteltiin 50 tai 100 µM akteosidilla 10 ng/ml IL-1 läsnäollessa tai poissa ollessa 24 tunnin ajan. Sen jälkeen rotan primaariset kondrosyytit kerättiin sentrifugoimalla ja lyysattiin käyttämällä lyysipuskuria (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lisäksi NFkB:n tuman translokaation varmistamiseksi rotan primaarisia kondrosyyttejä käsiteltiin 50 tai 100 µM akteosidilla 10 ng/ml IL-1 läsnäollessa tai poissa ollessa 24 tunnin ajan. Sen jälkeen sytosoli- ja ydinfraktiot uutettiin käyttämällä NE-PER™ Nuclear and Cytoplasmic -uuttoreagensseja (Thermo Sciﬁc, Rockford, IL, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Primaarisista rotan kondrosyyteistä uutetun kokonaisproteiinin konsentraatio määritettiin käyttämällä bikinkoniinihappoproteiinimäärityssarjaa (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lisäksi käsitelty väliaine kerättiin kondrosyyteistä erittyneiden rustoa hajottavien entsyymien tasojen havaitsemiseksi. Yhtä suuret määrät proteiinia ja käsiteltyä alustaa elektroforeesittiin natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (SDS-PAGE) ja siirrettiin sitten nitroselluloosakalvoille. Sen jälkeen suoritettiin Western blot -testi käyttämällä kohdistettuja primäärisiä vasta-aineita MMP-13, MMP-1, MMP-3, iNOS, COX-2, phosphoERK1/2, total-ERK1 vastaan. /2, fosfop38, kokonais-p38, fosfori JNK, kokonais-JNK, fosfoNFkB, kokonais-NFkB, - aktiini ja laminaatti B. Immunoreaktiiviset vyöhykkeet visualisoitiin käyttämällä tehostettua kemiluminesenssijärjestelmää (Thermo Sci- entific, Rockford, IL, USA) valmistajan ohjeet ja kuvannut sitten Microchemi-laitteella (DNR Bioimaging Systems, Jerusalem, Israel).

2.8. Kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktio (qPCR) ja kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (qRT-PCR). Primaarisia rotan kondrosyyttejä käsiteltiin 50 tai 100 µM akteosidilla 10 ng/ml IL-1 läsnäollessa tai poissa ollessa 24 tunnin ajan. Sen jälkeen kokonais-RNA eristettiin primaarisista rotan kondrosyyteistä käyttämällä TRIzol-reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. RNA:n kokonaispitoisuus mitattiin käyttämällä NanoDrop 2000 -laitetta (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA). cDNA:n syntetisoimiseksi käänteiskopioitiin 1 ug RNA:ta käyttäen ThermoScript-käänteistranskriptio-PCR-järjestelmää (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. cDNA:n qPCR suoritettiin käyttämällä 2x TOPsimple™ DyeMIX-Taqia (Enzynomics, Soul, Korean tasavalta) ja spesifisiä alukkeita TaKaRa PCR Thermal Cycler Device -laitteella (TaKaRa Bio Inc., Shiga, Japani). Sen jälkeen PCR-tuotteille suoritettiin elektroforeesi agaroosigeelillä kohdegeenien ilmentymistasojen määrittämiseksi. Glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasia (GAPDH) käytettiin endogeenisenä kontrollina. Lisäksi qRT-PCR:ää varten cDNA monistettiin käyttämällä Eco™ Real-Time PCR-järjestelmää (illumine Inc., San Diego, CA, USA). -Aktiinia käytettiin endogeenisenä kontrollina. QPCR:ssä ja qRT-PCR:ssä käytettyjen alukkeiden sekvenssit on koottu taulukoihin 1 ja 2, vastaavasti.

cistanche (akteosidi) hyöty: parantaa immuniteettia

3. Tulokset

3.1. Akteosidi ei vaikuta L929-solujen ja rotan primaaristen kondrosyyttien elinkykyyn. Normaalisoluina käytettyä hiiren fibroblastisolulinjaa L929 käsiteltiin 2,5, 5, 10, 25, 50 ja 100 µM akteosidilla 24 tunnin ajan. Sen jälkeen suoritettiin MTT-määritys akteosidin sytotoksisuuden arvioimiseksi L929-soluissa. Kuten kuviossa 2(a) esitetään, L929-solujen suhteelliseksi elinkelpoisuudeksi määritettiin 94:8±8 prosenttia, 93:6±7 prosenttia, 100±5 prosenttia, 103:9±5 prosenttia, 126:1±8 prosenttia. ja 122:7±4 prosenttia 2,5, 5, 10, 25, 50 ja 100 µM akteosidilla verrattuna kontrolliin (100:02 ± 3 prosenttia). Lisäksi akteosidin sytotoksisuuden varmistamiseksi rotan primaarisissa rustosoluissa suoritettiin MTT-määritys, kuten on esitetty kuviossa 2(b). 2,5, 5, 10, 25, 50 ja 100 µM akteosidilla käsiteltyjen primaaristen rotan kondrosyyttien elinkykyisiksi määritettiin 114 ± 4 prosenttia, 117:8 ± 6 prosenttia, 123:9 ± 5 prosenttia, 132:6 ± 4 prosenttia, 153:1±7 prosenttia ja vastaavasti 142:1±6 prosenttia verrattuna kontrolliin (100:4±5 prosenttia). Lisäksi akteosidin vaikutuksen vahvistamiseksi sekä L929-solujen että primääristen rotan kondrosyyttien elinkykyyn suoritettiin Cell Live/Dead -määritys, kuten kuvassa 2(c) esitetään. Punaisena fluoresenssina värjäytyneiden kuolleiden solujen määrä ei lisääntynyt L929-soluilla eikä primaarisilla rotan kondrosyyteillä, joita oli käsitelty 50 ja 100 µM akteosidilla 24 tunnin ajan. Nämä tiedot osoittivat johdonmukaisesti, että määritetty akteosidiannos ei vaikuttanut L929-solujen ja rotan primaaristen kondrosyyttien elinkykyyn. Siten 50 µM akteosidia ja 100 µM akteosidia, jotka ovat myrkyttömiä annoksia sekä L929-soluissa että primaarisissa rotan kondrosyyteissä, käytettiin varmistamaan sen antikataboliset vaikutukset in vitro -tutkimuksissa, joissa käytettiin primaarisia rotan kondrosyyttejä.

3.2. Akteosidi vastustaa IL-1 -indusoitua proteoglykaanin menetystä rotan primaarisissa kondrosyyteissä. Primaarisia alginaattihelmiin upotettuja rotan kondrosyyttejä käsiteltiin 50 ja 100 µM akteosidilla 1 ng/ml IL- 1:n läsnä ollessa tai poissa ollessa 21 päivän ajan. Sen jälkeen suoritettiin DMMB-määritys proteoglykaanipitoisuuden muutoksen arvioimiseksi, kuten kuviossa 3(a) esitetään. Suhteelliset proteoglykaanipitoisuudet määritettiin 88:3±18:1 prosentiksi ja 86:8±16:3 prosentiksi primaarisissa rotan kondrosyyteissä, joita oli käsitelty 50 ja 100 µM akteosidilla, verrattuna kontrolliin (103:8 ± 16:3). 32:3 prosenttia). Vaikka akteosidi alensi suhteellista proteoglykaanipitoisuutta, nämä tulokset eivät olleet merkittäviä. Suhteellinen proteoglykaanipitoisuus laski kuitenkin merkittävästi 37:1±14:7 prosenttia primaarisissa rotan kondrosyyteissä, joita käsiteltiin 1 ng/ml IL-1:lla, mutta 50 ja 100 µM akteosidi alensi proteoglykaanipitoisuutta merkittävästi suhteessa 57:12:4. prosenttia ja 64 ± 14:5 prosenttia, vastaavasti, kun läsnä on 1 ng/ml IL-1. Sen jälkeen sen tarkistamiseksi, estääkö akteosidi IL-1 -:n aiheuttamaa proteoglykaanin häviämistä, rotan polvinivelistä leikattua nivelrustoa käsiteltiin 100 µM akteosidilla 10 ng/ml IL-1:n läsnä ollessa tai ilman sitä 7 päivän ajan. Sen jälkeen suoritettiin histologiset arvioinnit käyttämällä H&E-värjäystä ja safraniini-O:ta ja nopeaa vihreää värjäystä kuvan 3(b) mukaisesti. Morfologista muutosta ei havaittu käyttämällä H&E-värjäystä; safraniini-O ja nopea vihreä värjäys paljasti kuitenkin, että punaiseksi värjäytyvä proteoglykaani ei muuttanut nivelrustoja, joita käsiteltiin 100 µM akteosidilla verrattuna kontrolliin. Kuitenkin 10 ng/mlLIL-1 indusoi vakavaa proteoglykaanin menetystä nivelrustossa, ja 100 µM akteosidi hillitsi merkittävästi proteoglykaanin menetystä nivelrustossa, jota käsiteltiin 10 ng/ml IL- 1:lla. Yhdessä nämä tiedot osoittavat johdonmukaisesti, että akteosidilla on antikatabolinen vaikutus, joka hidastaa nivelruston rappeutumista estämällä IL{53}}-indusoidun proteoglykaanin häviämisen.

3.3. Akteosidilla on antikatabolinen vaikutus, joka estää MMP:n ilmentymisen ja aktivoitumisen primaarisissa rotan kondrosyyteissä, joita on käsitelty IL-1:lla. Sen tutkimiseksi, liittyykö akteosidien aiheuttama antikatabolinen vaikutus MMP:n ilmentymisen ja aktivoitumisen estymiseen, primaarisia rotan kondrosyyttejä käsiteltiin 50 ja 100 µM akteosidilla 10 ng/ml IL-1:n läsnä ollessa tai poissa 24 tunnin ajan. Sen jälkeen MMP:iden muutoksia tutkittiin. Kuten kuvasta 4(a) näkyy, vaikka rustoa hajottavien entsyymien, kuten MMP-13, MMP-1 ja MMP-3, ilmentyminen lisääntyi merkittävästi primaarisen rotan käsitellyssä elatusaineessa. 10 ng/ml IL-1:lla käsiteltyjen kondrosyyttien kohdalla akteosidi vähensi sitä annoksesta riippuvalla tavalla. Lisäksi sekä qPCR:n (Kuva 4(b)) että qRT-PCR:n (Kuva 4(c)) tulokset paljastivat, että IL-1 lisäsi merkittävästi MMP:iden, kuten MMP-13, MMP{, mRNA-tasoja. {22}} ja MMP-3 rotan primaarisissa kondrosyyteissä. Ne kuitenkin vähenivät annoksesta riippuen primaarisissa rotan kondrosyyteissäkäsitelty 50 ja 100 µM akteosidilla. Lisäksi 50 ja 100 µM akteosidi tukahdutti tehokkaasti MMP:iden aktivoitumisen rotan primaarisissa kondrosyyteissä, joita oli käsitelty 10 ng/ml IL-1:lla (kuvio 4(d)). Yhdessä nämä tiedot osoittavat johdonmukaisesti, että akteosidilla on antikatabolinen vaikutus, joka estää rustoa hajottavien entsyymien ilmentymisen ja aktivoitumisen.

3.4. Akteosidi estää IL1 --indusoitujen katabolisten tulehdusvälittäjien ja proinflammatoristen sytokiinien ilmentymistä ja tuotantoa rotan primaarisissa kondrosyyteissä. Sen määrittämiseksi, onko akteosidilla ehkäisevä vaikutus OA:ta vastaan, primaarisia rotan kondrosyyttejä käsiteltiin 50 ja 100 µM akteosidilla 10 ng/ml IL-1:n läsnä ollessa tai ilman sitä 24 tunnin ajan. Sen jälkeen tutkittiin muutoksia tulehduksellisissa välittäjäaineissa, edustavissa katabolisissa tekijöissä, kuten iNOS, COX{8}} ja PGE2. IL-1 nosti merkittävästi iNOS-, COX{10}}- ja PTGS{11}}-mRNA-tasoja rotan primaarisissa rustosoluissa.

Ne kuitenkin vähenivät annoksesta riippuen primäärisissä rotan kondrosyyteissä, joita oli käsitelty akteosidilla (kuvio 5(a)). Lisäksi akteosidi ei ainoastaan tukahduttanut iNOS:n ja COX-2:n ilmentymistä IL-1:lla käsitellyissä primaarisissa rotan kondrosyyteissä (kuva 5(b)), vaan myös vähensi merkittävästi NO:n ja PGE2:n suhteellista tuotantoa, kuten on esitetty. kuvioissa 5(c) ja 5(d), vastaavasti. Nämä tiedot viittaavat siihen, että akteosidi suppressoi tulehduksellisten välittäjien aiheuttamien proinflammatoristen sytokiinien ekspressiota, jotka toimivat katabolisina tekijöinä indusoiden nivelruston progressiivista rappeutumista. Siksi 50 µM akteosidin aiheuttaman proinflammatoristen sytokiinien ilmentymisen muutoksen tutkimiseksi primaarisissa rotan kondrosyyteissä, joita oli käsitelty 10 ng/ml IL- 1:lla, suoritettiin sytokiinisarja kuvan 6 mukaisesti. kemoattraktantti- (CINC-) 2, CINC-3, ciliaarinen neurotrofinen tekijä (CNTF), fraktalkiini (CX3CL1), IL-1, IL- 1, leptiini, monosyyttien kemoattraktanttiproteiini{{22} } (MCP-1), makrofagien tulehdusproteiini- (MIP-) 3 ja -hermokasvutekijä (NGF) primaarisissa rotan kondrosyyteissä, joita hoidettiin IL-1:lla verrattuna pelkkään IL-1:aan. Yhdessä nämä tiedot viittaavat johdonmukaisesti siihen, että akteosidi estää nivelruston progressiivista rappeutumista estämällä tulehdusvälittäjien ja tulehdusta edistävien sytokiinien IL-1 --indusoituja katabolisia vaikutuksia rotan primaarisissa rustosoluissa.

3.5. Akteosidi estää MAPK- ja NFkB-fosforylaatiota IL-1-käsitellyissä rotan primaarisissa kondrosyyteissä. Akteosidien aiheuttamiin antikatabolisiin vaikutuksiin liittyvien solujen signalointireittien tutkimiseksi MAPK:n ja NFkB:n tulehduksellista sytokiini-IL-1-muutosta vastaan, rotan primaarisia kondrosyyttejä käsiteltiin 50 ja 100 µM IL{8-akteosidin läsnä ollessa. }} 24 tunnin ajan. Sen jälkeen kokonaisproteiini uutettiin ja sille suoritettiin elektroforeesi SDS-PAGE-geelillä Western blot -testin suorittamiseksi. Kuten kuvasta 7 näkyy, MAPK:t, kuten ERK1/2, p38 ja JNK, fosforyloituivat merkittävästi IL-1:lla käsitellyissä rotan kondrosyyteissä, kun taas 50 ja 100 µM akteosidi eivät merkittävästi indusoineet MAPK:n fosforiaation. kontrolli primaarisessa rotan kondrosyytissä. Kuitenkin 50 ja 100 µM akteosidi tukahdutti annosriippuvaisesti IL-1 --indusoidun MAPK:n fosforylaation primaarisissa rotan kondrosyyteissä. Lisäksi akteosidi vähensi asteittain NFkB:n fosforylaatiota primaarisissa rotan rustosoluissa, joita oli käsitelty 10 ng/ml IL-1:lla, annoksesta riippuvaisella tavalla. Nämä tiedot osoittavat, että MAPK- ja NFkB-solujen signalointireitit liittyvät läheisesti akteosidien aiheuttamiin antikatabolisiin vaikutuksiin IL-1:a vastaan primaarisissa rotan kondrosyyteissä.

3.6. Akteosidi estää NFkB:n siirtymistä sytosolista tumaan estämällä IL-1 --indusoitua NFkB-fosforylaatiota rotan primaarisissa kondrosyyteissä. Sen tutkimiseksi, estääkö akteosidi NFkB:n siirtymistä sytosolista tumaan, primaarisia rotan kondrosyyttejä käsiteltiin 50 ja 100 ug/ml akteosidilla 10 ng/ml IL-1 läsnäollessa tai poissa ollessa. Kuten kuviossa 8(a) esitetään, NFkB siirtyi merkittävästi ytimeen 10 ng/ml IL-1:lla käsiteltyjen rotan primaaristen kondrosyyttien sytosolista. Kuitenkin akteosidi esti sitä merkittävästi annoksesta riippuvalla tavalla. Lisäksi, vaikka NFKB-taso nousi tumafraktiossa, joka oli uutettu primaarisista rotan kondrosyyteistä, joita oli käsitelty 10 ng/ml IL-1:lla, akteosidi laski sitä annoksesta riippuen, kuten kuvassa 8(b) esitetään. NFkB-taso laski sytosolifraktiossa, joka oli uutettu primaarisista rotan kondrosyyteistä, joita käsiteltiin 10 ng/ml IL-1:lla, mutta akteosidi nosti sitä annoksesta riippuen. Yhdessä nämä tiedot osoittavat johdonmukaisesti, että akteosidien aiheuttamat antikataboliset vaikutukset IL-1:a vastaan ovat osallisena sytosolista ytimeen tapahtuvan translokaation estämisessä NFKB-signalointireitin modulaatiossa primaarisissa rotan rustosoluissa.

3.7. Akteosidi vaimentaa nivelruston progressiivista rappeutumista kirurgisissa DMM-indusoiduissa polvinivel-OA-eläimissä. Akteosidien aiheuttamien antikatabolisten vaikutusten selvittämiseksi in vivo annettiin BALB/c-hiirten polvinivelelle suoritetun kirurgisen DMM:n tuottamille OA-indusoiduille eläimille suun kautta 5 ja 10mg/kg akteosidia liuotettuna 5-prosenttiseen etanoliin. joka toinen päivä 8 viikon ajan. Sen jälkeen polvinivelet arvioitiin histologisesti käyttämällä safraniini-O:ta ja nopeaa vihreää värjäystä, kuten kuvassa 9 on esitetty. Proteoglykaanin menetys ja nivelruston pinnan vauriot lisääntyivät merkittävästi polvinivelessä, joka oli leikattu DMM-indusoiduista OA-eläimistä. Kuitenkin akteosidin oraalinen anto suppressoi proteoglykaanin häviämistä ja vähemmän nivelruston vaurioita verrattuna pelkkään vehikkeliin. Lisäksi Mankinin arvosanapisteet paranivat merkittävästi OA-eläinryhmässä (n =5, 3± 0:7), jotka saivat vain vehikkeliä, verrattuna Naiiviin (n =5, 0). :67 ± 0:5). Suun kautta annettu 5 ja 10mg/kg akteosidia OA-eläinryhmälle (n =5) kuitenkin alensi Mankinin arvosanaa 2±0:7 ja 1:67±0:5. , verrattuna vain ajoneuvoon. Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että akteosidin oraalinen anto heikentää nivelruston progressiivista rappeutumista nivelnivelissä, joissa on katabolisia tiloja.