Loiset, infektiot ja rokotus synteettisiin minimisoluihin

ABSTRAKTI: Synteettiset minimaaliset solut tarjoavat hallittavan ja muokattavan mallin biologisille prosesseille. Vaikka synteettiset solut ovat paljon yksinkertaisempia kuin mikään elävä luonnollinen solu, ne tarjoavat alustan keskeisten biologisten prosessien kemiallisten perusteiden tutkimiseen. Tässä näytämme synteettisen solujärjestelmän isäntäsolujen kanssa, jotka ovat vuorovaikutuksessa loisten kanssa ja läpikäyvät vaihtelevan vakavuuden omaavia infektioita. Osoitamme, kuinka isäntä voidaan muokata vastustamaan infektiota, tutkimme resistenssin kantamisen metabolisia kustannuksia ja näytämme rokotteen, joka immunisoi isännän patogeeneja vastaan. Työmme laajentaa synteettisten solujen suunnittelutyökaluja osoittamalla isäntä-patogeenivuorovaikutuksia ja immuniteetin hankkimismekanismeja. Tämä tuo synteettiset solujärjestelmät askeleen lähemmäksi kattavan mallin tarjoamista monimutkaisesta, luonnollisesta elämästä.

cistanche-edut miehille - vahvistavat immuunijärjestelmää

JOHDANTO

Muutaman viime vuosikymmenen aikana synteettisen biologian ala on kasvanut räjähdysmäisesti, mikä mahdollistaa synteettisten solujen rakentamisen, jotka muistuttavat ja mallintavat luonnollista biologista elämää. Solureittien ja -käyttäytymisen mallintaminen synteettisissä soluissa tarjoaa monia etuja eläviin soluihin verrattuna, kuten yksinkertaisemman ja määritellymmän reaktioympäristön, solun proteomisen ja kemiallisen koostumuksen täydellisen hallinnan, kyvyn jakaa häiritseviä biologisia reittejä ja prosesseja sekä ylläpitää tärkeitä biologisia järjestelmiä, joita ei esiinny in vitro -reaktiojärjestelmissä.1,2 Nämä ainutlaatuiset synteettisten soluteknologioiden hyödykkeet ovat jo mahdollistaneet biologisten olosuhteiden ja kulkureittien simuloinnin eloperäisessä in vitro -bioreaktorissa (synteettisessä solussa) ja parantaneet ymmärrystä monet tutkimusalueet, mukaan lukien molekyylien ahtautuminen, 3 lipidi-proteiinidynamiikka, 4 minimaalinen aineenvaihdunta,5 ja monet muut biologisen elämän kriittiset näkökohdat.2 Näistä elämänmaisista synteettisistä soluista, joilla on ainutlaatuiset ominaisuudet, on tulossa nopeasti parempia malleja ja ne tuovat enemmän valoa soluelämän salaperäinen sisäinen toiminta.6,7 Nämä läpimurrot eivät rajoitu yksisoluprosesseihin; liposomipopulaatioiden väliset tekniset vuorovaikutukset ovat myös osoittautuneet tehokkaaksi tekniikaksi. Esimerkiksi synteettisen solujärjestelmän suunnittelu, joka jäljittelee petoeläin-saalis -suhdetta, on kehitetty käyttämällä valoa signaalina näiden synteettisten solupopulaatioiden välillä.8 Toinen monimutkainen työ on kehitetty, joka mahdollistaa signaalin leviämisen synteettisessä solupisaramatriisissa, mahdollistaen fluoresenssin leviämisen spatiaalisesti väestön keskuudessa.9 Synteettisten solujen ja synteettisten solujen välisten vuorovaikutusten lisäksi viime aikoina on tapahtunut edistystä myös synteettisten solujen ja elävien solujen rajapinnoissa. On esimerkiksi osoitettu, että synteettinen solu, joka on suunniteltu olemaan vuorovaikutuksessa hermosolujen kantasolun kanssa, pystyy indusoimaan hermojen erilaistumista sekä toimimaan yleisenä alustana, joka pystyy olemaan vuorovaikutuksessa muiden solutyyppien kanssa.10 Kehittämisessä on tapahtunut lukemattomia edistysaskeleita. signaalin etenemisen ja rajapinnoina toimivien synteettisten solujen, joista suurta osaa tarkastellaan seuraavissa katsauksissa.11−13 Lyhyesti sanottuna on olemassa kokonaisia ​​tutkimusaloja, jotka liittyvät solupopulaatioiden vuorovaikutusten matkimiseen synteettisten solujen mallijärjestelmässä. Tästä huolimatta ei ole tehty tutkimusta, joka käyttää synteettisiä soluja infektion, loisten tai rokotuksen mallintamiseen. Aivan kuten synteettisiä soluja käytetään yleisesti monimutkaisten biologisten prosessien mallintamiseen yksinkertaistetulla ja kontrolloidulla tavalla, on olemassa potentiaalia mallintaa näitä monimutkaisia ​​organismien välisiä vuorovaikutuksia. Tämän tärkeys näkyy uraauurtavassa tutkimuksessa, joka tuotti menestyksekkäästi aktiivisia faagipartikkeleita soluvapaalla proteiiniekspressioalustalla.14 Pyrimme tuomaan tämän konseptin makrotasolle suunnittelemalla synteettisiä solupopulaatioita, jotka voivat aktiivisesti infektoida toisiaan ja kaapata isäntäsolun genomi, aivan kuten elävät virukset ja loiset. Kyky soveltaa ja suunnitella synteettisiä soluja näiden sairauksien käyttäytymisen mallintamiseen on arvokas työkalu tiedeyhteisölle.

Tässä työssä esittelemme synteettisten solusairauksien mallinnusjärjestelmäämme. Suunnittelimme isäntäsolun, joka voisi saada tartunnan toisesta synteettisten loissolujen populaatiosta, ja tutkimme resurssien kilpailua, genomin kaappausta ja metabolista uudelleenkäyttöä, joka tapahtuu tällaisen infektion aikana. Mallimme myös menetelmän, joka mahdollistaa isännän pelastamisen infektion jälkeen, sekä rokotuskeinon, jonka avulla isäntä voi vastustaa tautia aiheuttavien synteettisten solujen infektiota. Lyhyesti sanottuna esittelemme uuden sairauden ja infektiomallin alustan synteettisille soluille. Tämän tekniikan avulla synteettisiä soluja voidaan alkaa käyttää alkeellisina malleina sairauksille, infektioille ja rokotukselle (kuva 1).

Kuva 1. Parasiitti, infektio ja siirrostusjärjestelmä synteettisissä minimaalisissa soluissa. (a) "Isäntä" on synteettinen solu, joka ilmentää vihreää fluoresoivaa proteiinia (GFP). Ulkokalvon pinnalla isäntä kantaa ssDNA-tageja. Ainoat terveeseen isäntään transloituneet proteiinit ovat isännän omia proteiineja plasmideista, joilla isäntä luotiin. (b) "Loinen" on liposomi, joka on täytetty plasmidi-DNA:lla, joka koodaa mCherryn fluoresoivan proteiinin geeniä, ja loisen liposomin pinta on koristeltu ssDNA-tunnisteella (komplementti isännän pinnalla olevaa merkkiä vastaan). "Infektio" alkaa isännän ja loisen liposomien fuusiolla, jota välittävät niiden pinnalla olevat komplementaariset DNA-merkit. Infektion jälkeen isäntä ilmentää sekä alkuperäistä isäntägeeniä (GFP) että loisgeeniä (mCherry). (c) "Infektio" alkaa "patogeeni"-liposomeilla, jotka sisältävät MunI-restriktioentsyymin geenin, jotka fuusioituvat isäntäliposomien kanssa. Isäntä ilmentää patogeenigeeniä MunI ja MunI-restriktioentsyymi pilkkoo isäntä-DNA:ta. Tämä johtaa siihen, että natiivi isäntägenomi pilkkoutuu, mikä muuttaa suurimman osan isäntäproteiinin ilmentymisestä GFP:stä patogeenin koodaamaksi proteiiniksi MunI:ksi. (d) "Tapattava infektio" on isännän liposomin (GFP-genomin kanssa) fuusio patogeeniliposomin kanssa, joka sisältää aHL:ää, kalvoproteiinia, koodaavan geenin. Infektion jälkeen isäntä ilmentää aHL:ää, joka muodostaa kalvohuokosia aiheuttaen isännän ravinteiden vuotamista ja pysäyttäen tehokkaasti isännän aineenvaihdunnan. (e) "Immunisaatio" on isännän inkubointi ssDNA:n kanssa, joka sisältää sekvenssin, joka on yhteensopiva isännän liposomien pinnalla olevien fuusiomerkkien kanssa. Immunisoiva DNA muodostaa dupleksin isäntä-DNA-merkkien kanssa, mikä estää muiden DNA-oligojen hybridisoitumisen näihin merkkiaineisiin. Tämä estää patogeenisten liposomien fuusion isäntään. Tämä on konseptin todiste, ja kaaviot ovat havainnollistavia, ja ne esittävät suhteellisia määriä isännästä ja erilaisista patogeeneista ekspressoitua proteiinia. Kunkin järjestelmän todelliset tiedot esitetään seuraavissa kuvissa.

TULOKSET JA KESKUSTELU

Tässä työssä käytämme sanoja: isäntä, loinen, infektio, tappava, rokote ja rokote kaikki elottomien, synteettisten solujärjestelmien yhteydessä. "Tappavalla" infektiolla tarkoitamme merkittävää translaation vähenemistä synteettisten solujen populaatiossa. Kaikki tässä työssä tehdyt kokeet suoritettiin synteettisillä soluilla, jotka eivät ole elossa, eivät replikoidu itsestään eivätkä kehitty. Tämä on mallijärjestelmä luonnollisille biologisille ominaisuuksille ja prosesseille.

cistanche-lisäaine hyödyttää - lisää vastustuskykyä

Napsauta tästä nähdäksesi Cistanche Enhance Immunity -tuotteet

【Kysy lisää】 Sähköposti:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Synteettisen solun tarttuminen synteettisellä loissolulla kaappaa isäntäresurssit.

Infektiota jäljittelevän synteettisen solujärjestelmän käsitteen testaamiseksi aloitimme rakentamalla mallijärjestelmän loiselle. Käytimme yksinkertaisinta loisen käsitettä, joka voidaan muodostaa uudelleen tässä elottomassa biokemiallisessa järjestelmässä: loinen, joka kaappaa osan isännän resursseista. Tässä tapauksessa isännän metaboliaa edustaa GFP-proteiinin ilmentyminen ja loista edustaa mCherry-proteiinin ilmentyminen. Tässä järjestelmässä hyödynsimme aiemmin osoitettua lineaarisen proteiinin ilmentymisen ilmiötä, joka riippui DNA-templaatin pitoisuudesta TxTl:ssä.15,16 Ensin ryhdyimme löytämään optimaalisen plasmidin kokonaispitoisuuden, jolla GFP:n ja mCherryn DNA:n suhde vastaa näiden proteiinien havaitun fluoresenssin suhde. Määritimme mielivaltaisesti GFP-geenin "isännäksi" ja mCherry-geenin "loiseksi". Nämä nimet eivät tarkoita mitään erityistä tässä nimenomaisessa kokeessa, mutta osoittavat isännän ja loisen myöhemmissä synteettisissä solukokeissa. Tässä käytämme näitä nimiä helpottaaksemme näiden konseptikokeiden yhdistämistä myöhempiin synteettisiin soluinfektiokokeisiin, joissa käytetään samoja plasmideja. Sekoitimme GFP- ja mCherry-plasmideja, jolloin molemmat geenit olivat T7-promoottorin ohjauksessa vaihtelevilla plasmidisuhteilla ja plasmidin kokonaispitoisuudella näytteissä 1, 5, 10 tai 15 nM (kuvio 2b). Tulokset seurasivat odotettua lähes lineaarista suhdetta plasmidin pitoisuuden ja rekisteröidyn fluoresenssin intensiteetin välillä, ja paras yhteensopivuus fluoresenssin ja plasmidin pitoisuussuhteiden välillä havaittiin yhteensä 10 nM plasmidilla. Havaittu suhde osoittaa, että plasmidit, joiden proteiinit ovat samanlaisia ​​kooltaan ja aminohappokoostumukseltaan (kuvio S1), kilpailevat samasta TxTl-resurssien poolista niiden ilmentymisestä. Kahden plasmidin suhteellisen konsentraation muuttaminen johtaa muutoksiin ekspressiotehokkuudessa, joka on suunnilleen verrannollinen plasmidien suhteeseen. Tämä osoittaa, että se olisi hyvä malli loisinfektion jäljittelemiseen: loisen genomi (mCherry-plasmidi) kilpailee isäntägenomin (GFP-plasmidi) kanssa. Seuraavaksi päätimme testata tapausta, jossa jompikumpi plasmideista oli vahvemman promoottorin hallinnassa, mikä jäljitteli puolueellista resurssien allokaatioskenaariota. Säilyttääksemme resurssien kilpailunäkökulman tulevissa "parasiitti"-infektiokokeissa, pidimme molemmat geenit saman RNA-polymeraasipromoottorin (T7 RNA-polymeraasi, T7 RNAP) alla, mutta vaihtelimme sen vahvuutta. Käytimme vahvaa T7 RNAP -promoottoria T7Max, joka osoittaa merkittävästi korkeamman transkription tuoton, mikä johtaa vastaavasti korkeampiin translaatiosaantoihin, TxTl:ssä.17 Testasimme reaktiokokoonpanon, joka oli identtinen aiemmin kuvatun kanssa: kaksi plasmidia eri suhteissa, testattiin vaihtelevalla lopullisella kokonaismäärällä. plasmidipitoisuudet. Toinen plasmideista oli vahvan T7Max-promoottorin hallinnassa, kun taas toinen oli kanonisen T7-promoottorin alaisena. Molemmissa testitapauksissa T7Max-plasmidin ilmentyminen oli riittävän voimakasta, jotta proteiinin fluoresenssi geenistä T7Max:n alla ei merkittävästi lisääntynyt plasmidin lisääntyneen kokonaispitoisuuden myötä (kuvio 2c, 2d). Sillä ei näyttänyt olevan väliä, ajoiko T7Max GFP:tä vai mCherryä, molemmat proteiinit reagoivat vahvemmalle promoottorille samanlaisella suhteellisella nousulla. Tämä tarjosi lupaavan mallin infektiolle "vahvemmalla" loisella (T7Max-geeniä kantava loinen isäntään T7:n alla) ja käänteisellä, vahvemmalla isännällä, joka vastustaa heikompaa loista (isäntä, jonka genomi on alle T7Max, ja loinen, joka kantaa T7-geeniä). Näiden periaatteellisten kokeiden rohkaisemana siirryimme synteettisiin solukokeisiin.

"Infektio" on kaikissa tapauksissa isännän ja loisen synteettisen solun fuusio. Fuusiota helpottavat liposomien pinnalla olevat DNA-merkit käyttämällä edellä kuvattua DNA-indusoituvaa fuusiojärjestelmää.18 Lyhyesti sanottuna synteettiset solut luotiin Escherichia coli TxTl:llä POPC- ja kolesterolikalvon sisällä, ja ulompi lehtinen koristeltiin. yksijuosteisella DNA:lla, joka on ankkuroitu kalvoon kolesterolimodifikaatiolla. Jos liposomipari, joissa on komplementaarisia merkkejä, kohtaa, DNA-merkit hybridisoituvat, tuoden kalvot yhteen ja aloittaen kalvofuusion, jota seuraa onteloiden sekoittuminen. Kokeissamme isäntäsynteettinen solu on liposomi, joka sisältää TxTl:n ja T7 RNAP:n plasmidin koodaaman GFP:n genomin lisäksi. GFP-fluoresenssin seuranta toimii isännän aineenvaihdunnan "terveyden" välityspalvelimena. Saapuva loinen sisältää genomin plasmidin muodossa, joka koodaa mCherryä, täydellistä translaatiojärjestelmää, mutta ei T7-RNA-polymeraasia. Tämä varmistaa, että kaikki havaitut muutokset isännän aineenvaihdunnassa johtuvat loisen tuomista geeneistä eivätkä loisen ja isännän liposomien fuusiosta, mikä laimentaa isännän sytoplasmaa. Loisinfektiokokeet suoritettiin isäntäkalvolla, joka oli leimattu Marina Blue DHPE:llä, sinisellä kalvolipidivärillä. Tämä antoi meille mahdollisuuden normalisoida havaitun isännän ja loisen geenin fluoresenssin siniseksi fluoresenssiksi, normalisoimalla tulokset näytteessä olevan isäntäkalvon fluoresenssin kokonaismäärään. Tämä selittää näytteen kokonaistilavuuden laimennukset loisliposomien lisäämisen jälkeen. Loiskalvot eivät olleet fluoresoivasti leimattuja. Kaikkiin kokeisiin liitettiin kontrollinäyte, jossa vain yksi populaatio oli läsnä isäntänä, mutta mCherry-plasmidin kanssa, jotta voitaisiin näyttää teoreettiset maksimi mahdolliset mCherryn ilmentymistasot, jos se oli populaation ainoa geeni. Ensimmäisessä koesarjassa sekoitimme isännän ja loisen geenien kanssa sekä tavallisen T7-promoottorin ohjauksessa.joten sekä isäntä- että loisgeenit olivat yhtä "vahvoja". Sekoittimme isännän loiseen niin, että loinen oli 25, 50 tai 75 % koko liposomipopulaatiosta. Kaikissa tapauksissa isännän GFP-fluoresenssi väheni loisen läsnä ollessa, ja vastaavasti loisen mCherry-fluoresenssi kasvoi (kuva 2e). Näytteet, joissa oli vain loinen eikä isäntää, eivät tuottaneet fluoresenssia kummassakaan värissä, kuten odotettiin. Kaikissa tapauksissa DNA-välitteinen liposomifuusio ei ole 100-prosenttisesti tehokas;18,19 Siksi isännän fluoresenssin suhteellinen lasku ja loisen fluoresenssin lisääntyminen eivät olleet niin suuria kuin odotettu teoreettinen arvo, joka perustuu isännän ja loisen väliseen suhteeseen. Toisin sanoen infektio ei ollut 100 % tehokas. Tämä DNA:n indusoiman fuusiojärjestelmän huikea laatu oli tässä tapauksessa järjestelmän hyödyllinen ominaisuus. Kuten luonnollisen infektion tapauksessa, synteettinen solufuusiovälitteinen infektio ei vaikuttanut kaikkiin isäntiin, eivätkä kaikki loiset löytäneet isäntäänsä. Seuraavaksi tutkimme kahta tapausta, joissa isäntä ja loinen eivät vastanneet tasaisesti genomiensa vahvuudessa. Yhdessä tapauksessa isäntägenomi oli T7-promoottorin hallinnassa, kun taas loisen genomi oli T7Max-promoottorin alaisena (kuva 2f), ja päinvastaisessa skenaariossa isäntägenomi oli T7Max-promoottorin alla ja loisen genomi T7-promoottorin alla. (Kuva 2g). Jos kyseessä oli heikompi isäntä, jota vahvempi loinen hyökkäsi, suhteellinen lisäys lois-mCherry-fluoresenssissa ja vastaava lasku isännän GFP-fluoresenssissa olivat paljon voimakkaampia kuin edellisessä tapauksessa, jossa isäntä ja loinen olivat tasaisesti yhteensopivia. Kuten odotettiin, kun isäntä oli vahvempi kuin loinen, oli totta päinvastoin: mCherryn fluoresenssitasot olivat alhaisemmat ja GFP-fluoresenssin suhteellinen lasku oli pienempi kuin tasaisesti sovitetussa tapauksessa. Tämä havainnollistetaan parhaiten vertaamalla yhtä datapistettä samoissa infektioolosuhteissa: 75 % loissuhteella. Tasaisesti sovitetut isäntä- ja loispopulaatiot johtavat loisen fluoresenssiin, joka on hieman suurempi kuin isäntä. Kun loinen on vahvempi, loisen fluoresenssi on merkittävästi suurempi kuin isäntä. Ja kun isäntä on vahvempi, loisen fluoresenssi on hieman pienempi kuin isäntä. Nämä korostetut datapisteet on merkitty keltaisella tähdellä kuvassa 2e−g. Suoritimme kontrollikokeen isännällä, joka oli infektoitunut "oireettomalla" loisella, loisella, jolla oli plasmidi T7-promoottorilla, mutta ei proteiinia koodaava sekvenssi (poistimme mCherry-kasetin plasmidista) (kuvio 2h). Isännän GFP-fluoresenssi pienenee minimaalisesti korkeammilla loistasoilla, mikä osoittaa, että pieni määrä isäntäresursseja on omistettu lyhyen ei-koodaavan RNA:n transkriptioon parasiittiplasmidista. Nämä tiedot vahvistavat myös sen, että isännälle aiheutuvan loisinfektion pääasiallinen metabolinen taakka on translaation, ei transkription, resurssien hyödyntäminen. Tämä havainto on linjassa aiempien havaintojen kanssa, joiden mukaan translaatio on vaihtelevampi ja rajoittavampi resurssi soluttomissa järjestelmissä.20 Kaiken kaikkiaan nämä kokeet tarjoavat mallin infektiolle loisella, joka kaappaa isännän aineenvaihduntaresurssit synteettisten solukäyttäytymisten jäljittelemällä. luonnollisen isäntä-loisen suhteen.

Kuva 2. Loisinfektio kaappaa isännän resurssit. (a) Isännän synteettinen soluliposomi sisältää soluttoman translaatiojärjestelmän ja GFP:tä koodaavan plasmidin. Isännän pinta on koristeltu ssDNA-tunnisteilla. Loisen liposomi sisältää mCherryä koodaavan plasmidin, jossa on translaatiojärjestelmä, mutta ei RNA-polymeraasia (joten loinen ei voi ilmentää mCherryä). Loisen pinta on koristeltu ssDNA-tunnisteilla, jotka täydentävät isännän pinnalla olevia merkkejä. DNA-tunnisteet helpottavat isännän ja loisen liposomien fuusiota, ja isäntä ilmentää sekä omaa genomista GFP:tä että mCherryä sisältävää loisgenomia. (b-d) Periaatteen todistaminen isäntä- (GFP) ja loisen (mCherry) genomeille, jotka kilpailevat samoista synteettisistä soluresursseista. Nämä kokeet tehdään liuoksessa TxTl, ei liposomeissa. Kaksi plasmidia, jotka koodaavat GFP:tä ja mCherryä, sekoitettiin lämpökartan vasemmalla puolella olevien plasmidikuvakkeiden osoittamassa suhteessa, jolloin näytteen kokonais-DNA-konsentraatio ilmoitettiin lämpökartan yläpuolella olevalla rivillä. Fluoresenssi mitattiin vihreällä (GFP) ja punaisella (mCherry) kanavalla. Kukin plasmidi testattiin kahdessa muunnelmassa erivahvuisilla promoottoreilla: T7:llä ja vahvemmalla T7Max-promoottorilla. Yksittäiset tiedot kaikista lämpökartoista on esitetty kuvissa S2−S4. Edustavia yksilöllisiä aikajaksoja T7-isännän ja loisen proteiiniekspressiolle on esitetty kuvissa S5-S7 ja T7Max-loisen kuvauksissa S8-S10. (e−g) Isännän infektio loisella. Jokaisessa kokeessa isännän liposomit sekoitetaan loisen liposomien kanssa. Loisen fuusio isäntään tuottaa lois-mCherry-DNA:ta, joka ilmentyy isännän GFP-DNA:n rinnalla. Testattiin erilaisia ​​isännän ja loisen suhteita, kuten pylväskaavioiden alla olevista kuvakkeista käy ilmi. Isäntägenomi T7-promoottorin alla infektoitiin loisella, jonka genomi oli T7-promoottoripaneelin alla (e) ja loisella, jonka genomi oli T7Max-promoottoripaneelin alla (f), isäntä tehtiin myös T7Max-genomilla ja infektoitiin loisen kanssa T7-genomipaneelilla (g). Edustavia yksilöllisiä aikakulkuja proteiinin ilmentymiselle on esitetty kuvassa S11. Samanlaiset kokeet korkeammilla ja alhaisemmilla kokonaislipidipitoisuuksilla esitetään kuvassa S12. Kokoekskluusiopuhdistusjäljet, jotka osoittavat rakkuloiden stabiilisuuden jälkifuusion jälkeen, on esitetty kuvassa S13. (h) Infektio yhteensopimattoman loisen kanssa: loinen kantaa T7-promoottoria, mutta ei koodaavaa DNA:ta. Virhepalkit osoittavat SEM, n=3. Fluoresenssiarvot paneeleissa (e-h) normalisoidaan kalvovärin siniseen fluoresenssiin tulosten normalisoimiseksi isäntäsolujen pitoisuuteen. Kaikki näytesarjat, jotka on merkitty "isäntä-GFP-infektoituneeksi", ovat kokeita, joissa isännällä ja loisella oli pinnalla komplementaarisia DNA-merkkejä, jotka mahdollistivat liposomien fuusion, jota kutsutaan infektioksi. Sarjamerkityt "isäntä GFP terve" -näyttelynäytteet, joissa isäntä ja loinen sekoitettiin esitetyissä suhteissa, mutta ne eivät sisältäneet komplementaarisia fuusiomerkkejä, mikä teki tartunnan mahdottomaksi. Paneeleissa oleva timantti (e-h) osoittaa yhden tietyn infektiotilan, joka parhaiten kuvaa eroja isännän ja loisen ilmentymisvoimakkuuksissa paneeleissa (e-g) ja isännän immuniteetin etuja paneelissa (h). Tähdellä merkittyjen isäntä- ja loisten arvojen suora vertailu on esitetty kuvassa S14. Tiedot infektiosta loisella ilman plasmidia on esitetty kuviossa S15.

Synteettisen solun infektio voi tuhota isäntägenomin.

Yllä kuvattu loinen ekspressoi genomia koodaavaa mCherryä käyttämällä isännän resursseja, mutta isäntä säilytti osan aineenvaihdunnastaan ​​ja jatkoi GFP:n ilmentämistä infektiosta huolimatta. Seuraavaksi päätimme tutkia järjestelmää, jossa infektio johtaa isännän aineenvaihdunnan täydelliseen hallintaan loisen toimesta isäntägenomin tuhoamisen kautta (kuva 3a). Sellaisen skenaarion luomiseksi tutkimme plasmidin restriktioentsyymidigestiota TxTl:ssä. Periaatteen todistamiskokeissa MunI-restriktioentsyymi ekspressoitiin TxTl:ssä ilman liposomeja. MunI-plasmidi sekoitettiin GFP-plasmidin kanssa eri suhteissa. Jos GFP-plasmidi ei sisällä MunI-restriktiokohtia, havaitun GFP-fluoresenssin suhteellisen pieni väheneminen voidaan selittää aiemmin kuvatulla kilpailulla näiden kahden plasmidin välillä TxTl-resursseista. Jos GFP-plasmidissa on MunI-restriktiokohta, GFP-fluoresenssi laskee merkittävästi, ja lasku skaalataan suhteessa MunI:tä koodaavan plasmidin kasvavaan määrään (kuvio 3b). MunI-ilmentymistä seurattiin Western Blot -menetelmällä ja skaalattiin suhteellisesti plasmidipitoisuuteen (kuvio 3c).

cistanche tubulosa - parantaa immuunijärjestelmää

Näiden tulosten rohkaisemana aloitimme infektiokokeen synteettisillä soluilla. Isäntä kantoi GFP-plasmidia ja patogeeni kantoi MunI-plasmidia. GFP- ja MunI-plasmidien pitoisuus asetettiin arvoon 2 mM, selvästi alle TxTl:n plasmidin kyllästymiskonsentraation.21 Tarkoituksenamme oli pysyä plasmidin kokonaispitoisuuden alapuolella, jossa isännän ja loisen ilmentyminen olisi tarpeeksi korkea kilpailemaan suoraan rajallisista resursseista ( kuten yllä kuvatussa yksinkertaisen loisen tapauksessa), tarkoituksena sen sijaan enimmäkseen mitata isäntägenomia aktiivisesti tuhoavan loisen entsyymin vaikutusta. Kuten aiemmin kuvatuissa parasiittikokeissa, isäntä sisälsi bakteerien TxTl- ja T7-RNA-polymeraasia, patogeeni kantoi vain soluuutetta ilman T7-RNA-polymeraasia, ja sekä isäntä että patogeeni leimattiin komplementaarisilla DNA-fuusioleimoilla. Isäntäkalvo leimattiin Marina Blue DHPE:llä fluoresenssitulosten normalisoimiseksi isännän liposomien konsentraatioon. Isäntä ja taudinaiheuttaja sekoitettiin eri suhteilla, jolloin patogeeni oli 25, 50 tai 75 % koko populaatiosta. "Infektoituneen" isännän fluoresenssi, jossa isäntä ja patogeeni sisälsivät komplementaarisia fuusiomerkkejä, väheni patogeenin lisääntyessä. GFP-fluoresenssi "terveestä" isännästä, jossa patogeeni ei sisältänyt komplementaarisia fuusiomerkkejä, ei vähentynyt minkään patogeenin määrän läsnä ollessa. Näytteet, joissa oli vain patogeeni, eivät johtaneet mitattavissa olevaan fluoresenssiin (kuvio 3d). Patogeenisen MunI-proteiinin ilmentyminen kvantifioitiin käyttämällä Western Blot -analyysiä infektoituneen isännän näytesarjan tuloksilla (kuvio 3e). Seuraavaksi tutkimme infektiota isännässä, joka oli immuuni patogeenille: isäntä-GFP-plasmidissa ei ollut MunI-restriktiokohtaa (kuvio 3f). Isännän fluoresenssi infektion jälkeen väheni, mutta se ei ollut läheskään yhtä merkittävää kuin aikaisemmassa tapauksessa isännässä, jonka genomissa oli MunI-kohta. MunI-patogeeniproteiini ilmentyi tasoilla, jotka olivat verrattavissa aikaisempiin infektiokokeisiin (kuva 3g), joten isännän metabolinen kuormitus oli samanlainen. Infektoituneen isännän fluoresenssin lasku näissä kokeissa johtuu siitä, että MunI:tä ekspressoiva patogeeni kaappaa osan isäntäresursseista, mutta koska plasmidin kokonaispitoisuus on paljon pienempi kuin aikaisemmissa yksinkertaisissa patogeenikokeissa, isännän fluoresenssin lasku on vähemmän merkittävää. Tämä koe vahvistaa myös, että MunI-kohdan omaavan isännän fluoresenssin lasku (kuvio 3d) johtui kuviossa S22 esitetyistä proteiinin ilmentymisajan kuluista. (g) MunI:n ilmentymistä seurattiin Western blot -analyysillä paneelissa (f) näytetyille näytteille, jotka on esitetty sarjassa "GFP-infektoitunut". Virhepalkit kaikissa paneeleissa osoittavat SEM, n=3. Fluoresenssiarvot paneeleissa (d, f) normalisoidaan tulosten normalisoimiseksi isäntäsolujen konsentraatioon käytetyn kalvovärin siniseksi fluoresenssiksi. Fluoresenssi paneelissa (b) normalisoidaan 0 mM MunI-plasmidiksi kullekin näytesarjalle. Paneeleissa (d, f) olevat timanttisymbolit korostavat yhtä erityistä tilaa, joka kuvaa parhaiten eroja infektiovasteissa isännässä, joka on herkkä patogeenipaneelille (d) ja immuuni patogeenipaneelille (f). Kaikki näytesarjat, jotka on merkitty "GFP-infektoituneeksi", ovat kokeita, joissa isännällä ja patogeenilla oli pinnalla komplementaarisia DNA-merkkejä, jotka mahdollistivat liposomien fuusion, jota kutsutaan infektioksi. Sarja, jossa on merkintä "GFP terve", näyttää näytteitä, joissa isäntä ja patogeeni sekoitettiin esitetyissä suhteissa, mutta ne eivät sisältäneet komplementaarisia fuusiomerkkejä, mikä teki tartunnan mahdottomaksi.

Kuva 3. Infektio tuhoaa isäntägenomin ja kaappaa isäntäresurssit. (a) Isäntäsolut sisältävät GFP:tä koodaavan plasmidin, jossa on kaksi MunI-restriktiokohtaa; patogeeni sisältää MunI-restriktioentsyymiä koodaavan plasmidin. Isännän ja patogeenin fuusion jälkeen isäntä TxTl ilmentää MunI-restriktioentsyymiä, joka sitten pilkkoo isännän genomin. (b) Infektion periaatteentodistekokeet: GFP-plasmidi valmistettiin MunI-restriktiokohtien kanssa ja ilman. GFP-plasmidi sekoitettiin MunI-plasmidin kanssa ja GFP:n ilmentyminen rekisteröitiin. Nämä kokeet suoritettiin liuoksessa TxTl ilman liposomeja. Infektiokokeen periaatteen todiste, jossa MunI-entsyymi lisättiin ulkoisesti sen sijaan, että se ekspressoituisi TxTl:ssä, on esitetty kuvioissa S16 ja S17. Edustavia proteiinien ilmentymisaikakuluja on esitetty kuviossa S18. (c) MunI-ilmentymistä seurattiin Western blot -analyysillä; MunI-vyöhykkeen intensiteetti kvantifioitiin samoissa näytteissä kuin fluoresenssitulokset, jotka on esitetty paneelissa (b) sarjalle "MunI-kohta puuttuu". Kuvassa S19 on esitetty edustava MunI-restriktioentsyymin Western blot. (d) isännän GFP-fluoresenssi sekoitettuna patogeeniliposomien kanssa datakaavion alla esitetyssä suhteessa. Isäntä-GFP-plasmidissa on kaksi MunI-restriktiokohtaa. Edustavia proteiinien ilmentymisaikakuluja on esitetty kuvassa S20. Tiedot infektiokokeista yhteensopimattomilla fuusiotunnisteilla on esitetty kuvassa S21. (e) MunI:n ilmentymistä seurattiin Western blot -analyysillä kokeen avulla näytteille, jotka on esitetty sarjassa "GFP-infektoitunut" paneelissa (d). (f) isännän GFP-fluoresenssi sekoitettuna patogeeniliposomien kanssa datakaavion alla esitetyssä suhteessa. Isäntä-GFP:llä ei ole MunI-restriktiokohtia, mikä antaa sille immuniteetin patogeeniproteiinia vastaan. Edustavia proteiinien ilmentymisaikakuluja on esitetty kuviossa S22. (g) MunI:n ilmentymistä seurattiin Western blot -analyysillä paneelissa (f) näytetyille näytteille, jotka on esitetty sarjassa "GFP-infektoitunut". Virhepalkit kaikissa paneeleissa osoittavat SEM, n=3. Fluoresenssiarvot paneeleissa (d, f) normalisoidaan tulosten normalisoimiseksi isäntäsolujen konsentraatioon käytetyn kalvovärin siniseksi fluoresenssiksi. Fluoresenssi paneelissa (b) normalisoidaan 0 mM MunI-plasmidiksi kullekin näytesarjalle. Paneeleissa (d, f) olevat timanttisymbolit korostavat yhtä erityistä tilaa, joka kuvaa parhaiten eroja infektiovasteissa isännässä, joka on herkkä patogeenipaneelille (d) ja immuuni patogeenipaneelille (f). Kaikki näytesarjat, jotka on merkitty "GFP-infektoituneeksi", ovat kokeita, joissa isännällä ja patogeenilla oli pinnalla komplementaarisia DNA-merkkejä, jotka mahdollistivat liposomien fuusion, jota kutsutaan infektioksi. Sarja, jossa on merkintä "GFP terve", näyttää näytteitä, joissa isäntä ja patogeeni sekoitettiin esitetyissä suhteissa, mutta ne eivät sisältäneet komplementaarisia fuusiomerkkejä, mikä teki tartunnan mahdottomaksi.

Synteettisen solun infektio voi olla "tappava", heikentävä isäntäsoluresursseja, ja tällaiset infektiot voidaan "hoitella" pelastaakseen.

Yllä olevat lois- ja patogeenikokeet osoittivat, että synteettisiä soluja voidaan käyttää mallina infektiolle, jossa patogeeni kaappaa isännän resurssit. Seuraavaksi päätimme tutkia skenaariota, jossa infektio saa aikaan isännän aineenvaihdunnan lakkaamisen patogeenisen proteiinin ilmentymisen jälkeen. Tässä tapauksessa patogeeni on verrattavissa tappavaa toksiinia ilmentävän bakteerin aiheuttamaan infektioon, josta on vähennetty isännän tai loisen replikaationäkökohta, koska nämä synteettiset solut eivät replikoidu (kuvio 4a). Tämän järjestelmän suunnitteluun valitsimme hemolysiinin (aHL), luonnollisen toksiinin ja kalvoproteiinin, jota käytetään laajalti synteettisessä solutekniikassa luomaan epäspesifisiä kalvohuokosia.22,23 Arvostamme tämän valinnan ironiaa, koska Staphylococcus aureus ilmentää aHL:ää luonnollisesti. toksiinia, ja proteiini käytettiin myöhemmin kehittämään kalvokuljetusta ja pidentämään synteettistä soluaineenvaihduntaa.24 Tässä palataan aHL:n käyttöön sen luonnollisen roolin vuoksi infektion tuottamana haitallisena toksiinina. Toinen merkittävä synteettiseen solutekniikkaan liittyvä esimerkki aHL:n toksisuuden käyttämisestä luonnollisen solukuoleman aiheuttamiseen tulee synteettisten solujen soveltamisesta syövän hoitoteknologiana.25 Periaatteena todettiin, että aHL:n korkean pitoisuuden ilmentäminen synteettisissä solurakkuloissa johtaa solusisällön vuotamiseen ja GFP:n ilmentymisen merkittävään vähenemiseen solun sisällä. Tämä vaikutus voidaan kääntää, jos liposomien ulkopinta sisältää kaikki pienet molekyylit, joita tarvitaan TxTl:lle (kuva 4b). Isäntä-patogeeni -mallijärjestelmässämme isäntä sisältää GFP:tä koodaavan plasmidin ja patogeeni sisältää aHL:ää koodaavan plasmidin. Kaikkien infektiokokeiden suunnittelu on samanlainen kuin edellä kuvatut lois- ja patogeeniskenaariot, jolloin patogeeni ei sisällä T7 RNAP:tä ja sekä isäntä että patogeeni on koristeltu DNA-fuusioleimoilla. Mielenkiintoista on, että havaitsimme, että pienemmillä patogeenipitoisuuksilla (patogeeni on 25 tai 50 % koko populaatiosta) isännän fluoresenssi laskee vain hieman. Patogeenipitoisuuden lisääminen 75 %:iin johtaa kuitenkin merkittävään isännän GFP-fluoresenssin laskuun (kuvio 4c). Arvelemme, että tämä tulos saattaa johtua suhteellisen hitaasta ravinteiden vuotamisesta synteettisistä soluista pienemmällä aHL-pitoisuudella. GFP-fluoresenssi mitattiin vasta 12 tunnin inkubaation jälkeen ja GFP on erittäin stabiili proteiini. Siksi on mahdollista, että alhaisemmilla aHL-pitoisuuksilla (pienempi patogeenimäärä) aHL:n aiheuttama ravinteiden vuoto oli riittävän hidasta, jotta isäntäsolut kerääntyivät merkittäviä määriä GFP:tä ennen kuin aHL:n aiheuttaman vuodon vaikutukset lamaantuivat. aineenvaihdunta. Erottaaksemme yksinkertaisen kilpailun tulokset isännän ja loisen genomien välisestä resursseista, suoritimme "tartunnan pelastuskokeita", joissa ulkopuolinen puskuri sisälsi kaikki pienet molekyylit, jotka muodostavat TxTl-energia-, aminohappo- ja suolaseokset. Tämä asetettiin samalla tavalla kuin kuvassa 4b testattu "ravinteiden ulkopuolella". Isännän fluoresenssin lasku näissä kokeissa oli samanlainen kuin aikaisemmissa "infektio ilman pelastusta" näytteissä, joissa patogeenin tasot olivat 25 ja 50 %. Isännän fluoresenssin lasku 75 %:ssa patogeenista oli merkittävästi pienempi kuin väheneminen, joka havaittiin näytteissä ilman pelastusta (kuvio 4d). Suuri ero tuloksissa kokeessa, jossa oli 75 % loisista, kun datapisteet kuvan 4 paneeleissa (c, d) on korostettu tähdellä, näyttää tukevan hypoteesiamme, että korkeammat aHL-pitoisuudet aiheuttavat vahinkoa reaktion varhaisessa vaiheessa. Pienemmillä patogeenipitoisuuksilla vuoto on riittävän hidasta, jotta isäntä-GFP kerääntyy (kuten nähdään sekä pelastusravinteiden kanssa että ilman), joten havaittu GFP-fluoresenssi laskee tartunnan jälkeen lähinnä resursseista käytävän kilpailun vuoksi. Suuremmilla patogeenipitoisuuksilla GFP-fluoresenssi näytteissä, joissa on ulkoisia ravinteita, laskee pääasiassa resurssien kilpailun vuoksi. Nämä kokeet osoittavat, että voimme muokata synteettisiä soluja mallintamaan infektiota, mikä johtaa kahteen eri tulokseen: itse infektion metaboliseen rangaistusseen (vähentynyt GFP resurssien kilpailun vuoksi) ja "tappavampaan" infektioon, joka johtuu isäntien proteiiniekspression poistamisesta. Tämän havainnon rohkaisemana päätimme tutkia järjestelmää, jossa synteettiset solut voisivat aktiivisesti vastustaa patogeenistä infektiota, ja tutkia tällaisen vasteen metabolista haittaa.

cistanche-edut miehille - vahvistavat immuunijärjestelmää

Synteettiset solut voivat puolustautua infektioita vastaan ​​käyttämällä bakteerien inspiroimaa strategiaa.

Inspiroituneena restriktioendonukleaasien tunnetusta tehtävästä suojella bakteereja vieraalta DNA:lta, pyrimme käyttämään tätä strategiaa synteettisissä soluissa. Laajensimme kuvassa 2 esitettyä loisjärjestelmää: GFP:n lisäksi lisäsimme MunI:tä sisältävää plasmidia isäntään. Loinen sisälsi mCherryä, kuten aiemmissa kokeissa. mCherry-plasmidi sisältää MunI-restriktiokohdan (kuvio 5a). Ensin suoritimme periaatetodistekokeita arvioidaksemme MunI:n ilmentämisen metabolista kuormitusta isännässä. Näissä kapseloimattomissa TxTl-kokeissa tarkkailimme GFP:n ilmentymistä ja mCherryn ilmentymistä, kumpaakin sekoitettuna kasvavaan määrään joko MunI- tai EcorI-plasmidia. Kaikki geenit olivat saman T7-promoottorin hallinnassa. GFP-geenissä oli EcorI, mutta ei MunI-restriktiokohta ja mCherry-geenissä oli MunI, mutta ei Ecorl-restriktiokohta. Kun restriktioentsyymiplasmidi sekoitettiin fluoresoivan proteiiniplasmidin kanssa ilman tunnistuskohtaa tälle restriktioentsyymille, fluoresoivan proteiinin ilmentyminen väheni suhteessa restriktioentsyymiplasmidin lisääntymiseen, mikä osoittaa näiden kahden plasmidin välistä kilpailua TxTl-resursseista, kuten aiemmin osoitettiin GFP:lle. ja mCherry kuvassa 2. Nämä leikkaamattomat parit olivat GFP MunI:n kanssa (kuva 5b) ja mCherry EcorI:n kanssa (kuva 5e). Kun fluoresoiva proteiini yhdistettiin restriktioentsyymin kanssa, joka kykeni leikkaamaan tuon fluoresoivan proteiinin geenin, fluoresenssi väheni merkittävästi lähes taustatasoille suuremmilla restriktioentsyymiplasmidipitoisuuksilla. Nämä leikkausparit olivat GFP EcorI:llä (kuva 5c) ja mCherry MunI:llä (kuva 5d). Tämä osoitti fluoresenssin laskua huomattavasti enemmän kuin pelkkä kilpailu resursseista ja samanlainen kuin kuviossa 3 esitetyssä infektioskenaariossa. MunI:n ilmentyminen GFP:n läsnä ollessa vähentää GFP:n ilmentymistä. Jos käytämme GFP:tä isännän "perusaineenvaihdunnan" välityspalvelimena, MunI voidaan nähdä isännän metabolisena kuormituksena.

Kuva 4. Isäntä on altis "tappavalle" infektiolle, mutta isäntä voidaan pelastaa. (a) Isäntä sisältää GFP-plasmidin ja patogeeni sisältää plasmidin, joka koodaa hemolysiinin (aHL) kalvokanavaa. Infektion jälkeen isäntä ekspressoi aHL:ää, joka muodostaa kalvoon huokosia, mikä aiheuttaa ravinteiden vuotamista ja johtaa isännän metabolisen aktiivisuuden vähenemiseen. (b) Periaatetodistus isäntää ilmentävälle aHL:lle (ei infektiota, isäntä luotiin sekä 5 nM GFP:llä että ilmoitetulla määrällä aHL-plasmidia). Isäntä inkuboitiin puskurissa ravinteiden kanssa tai ilman niitä (kaikki energia-, suola- ja aminohapposekoituksen komponentit käytettiin isäntäsoluttoman translaatiojärjestelmän valmistukseen). Optimaalinen pelastusravinnepitoisuus määritettiin kokeellisesti, tiedot esitetään kuvassa S23. (c) Isännän infektio patogeenillä, vaihtelevilla määrillä patogeenia isäntäsolua kohden. Pienten molekyylien vuoto "terveistä" ja "tartunnan saaneista" soluista mitattiin suoraan käyttämällä pienimolekyylistä väriainetta, tiedot on esitetty kuvissa S24 ja S25. (d) Näiden kaltaiset kokeet on esitetty paneelissa (c), mutta ulkopuskuri sisältää pienimolekyylisiä ravinteita, jotka ovat samanlaisia ​​kuin paneelissa (b) esitetyt "ravinteet ulkopuolella". Virhepalkit kaikissa paneeleissa osoittavat SEM, n=3. Fluoresenssiarvot paneelissa (b-d) normalisoidaan kalvovärin siniseen fluoresenssiin, jota käytetään normalisoimaan signaali isäntäsolujen pitoisuuteen. Timanttisymbolit paneeleissa (c, d) korostavat yhtä erityistä tilaa, joka kuvaa parhaiten eroja vasteessa infektioon isännästä, jolla ei ole ulkopuolista ravintoainepaneelia (c) ja joka on immuuni taudinaiheuttajalle ulkopuolisten ravintoaineiden paneelin (d) vuoksi. Paneeleille (c, d) sarja "GFP-infektoitunut" on isäntä, joka on fuusioitunut aHL-proteiinia kantavan patogeenin kanssa, ja "GFP terve" on isäntä, joka on fuusioitu patogeeniin, joka ei sisällä plasmidia.

Jatkamme infektiokokeisiin sekoittamalla isäntä (GFP- ja MunI-plasmideilla) loisen kanssa (mCherry-plasmidin kanssa). Kuten aiemminkin, tutkimme skenaarioita, joissa populaatiossa on kasvava määrä loisia (kuva 5f). Vain isäntää ilmentävän mCherryn positiivinen kontrolli (EcorI:llä MunI:n sijasta aineenvaihduntakuormituksen tasapainottamiseksi) loi vertailukohdan patogeeniproteiinin teoreettiselle enimmäismäärälle, joka voi ilmentyä isännässä (kuva 5f). Loisen määrän kasvaessa isännän GFP-fluoresenssi väheni, mutta infektoituneen isännän fluoresenssin lasku oli merkittävästi pienempi kuin aiemmissa kokeissa samalla loisella havaittu GFP-ilmentymisen väheneminen. Tämän infektoituneen isäntää ilmentävän MunI:n GFP:n ja loisen mCherry-fluoresenssia (tietopiste merkitty tähdellä kuvassa 5f) voidaan verrata suoraan samankaltaisiin infektioisäntiin ilman MunI:tä (tietopiste merkitty tähdellä kuvassa 2e). MunI:tä ilmentävässä isännässä isäntä-GFP aloitti täysin alemmalla tasolla ollessaan terve (koska osa resursseista ohjataan MunI:n ilmentämiseen), mutta infektion jälkeen isännän fluoresenssin lasku on paljon vähemmän merkittävää ja isäntä tuottaa paljon vähemmän loisen mCherry-proteiinia. kuin silloin, kun isäntä ei ilmaise MunI:tä. Tämä koe osoittaa, että isäntä käyttää resursseja loisia vastaan ​​​​puolustukseen. Tätä järjestelmää voitaisiin pitää hyvin yksinkertaisena biokemiallisena mallina proteiineja ilmentäville organismeille puolustautumaan tulevia infektioita tai jopa haitallisia ympäristötekijöitä vastaan. Isäntä on alun perin vähemmän vankka (jos otamme GFP:n ilmentymisen isännän terveyden vertailukohtana), mutta tartunnan sattuessa isäntä käyttää lisäresursseja puolustavien proteiinien ilmentämiseen ja tarjoaa suojan infektoivaa loista vastaan. Siksi tässä yksinkertaisessa elottomassa synteettisessä solussa rakensimme esimerkin perustavanlaatuisesta biologisesta asekilpailusta.

Kuva 5. Isäntäsolut suojaavat infektiota vastaan. (a) Isäntäsolut sisältävät kaksi plasmidia: toinen koodaa GFP:tä (ilman MunI-restriktiokohtaa) ja toinen MunI-restriktioentsyymiä ("parasiittiresistenssi"-geeni). Loinen sisältää mCherry-plasmidia samanlaisessa järjestelmässä kuin kuvassa 2 esitetyt kokeet. Infektio välittyy fuusiossa DNA-merkkien kautta isännän ja loisen pinnalla. Infektion jälkeen loisen tuoma mCherry-plasmidi pilkotaan isännän MunI-restriktioentsyymillä. (b−e) Loisen vastustuskyvyn ilmentämisen metabolisten kustannusten mittaaminen. Kokeet tehdään bulkki-TxTl-järjestelmässä, ei kapseloituna vesikkeleihin. Kussakin kokeessa fluoresoiva proteiiniplasmidi (GFP tai mCherry) sekoitettiin restriktioentsyymiplasmidin (MunI tai EcorI) kanssa x-akselilla osoitetussa suhteessa plasmidin kokonaispitoisuuden ollessa 10 mM. GFP:llä on EcorI-rajoituskohta, mutta ei MunI-kohtaa, ja mCherryllä on MunI-rajoituskohta, mutta ei EcorI-rajoituskohta. Trendiviiva on visuaalinen opas, mutta ei tietojen sovitus. Virhepalkit osoittavat SEM, n=3. Kontrollikokeet puhdistetuilla restriktioentsyymeillä sen sijaan, että ne ilmentäisivät niitä plasmidista, esitetään kuviossa S26. Myös liposomien stabiilius, joissa oli lisääntynyt määrä loisplasmidia, mitattiin, tulokset esitetään kuviossa S27. (f) Isännän infektio kasvavalla loisten määrällä. "Isäntä GFP terve" on GFP:n ilmentyminen isäntäsoluista, jotka on fuusioitu loiseen ilman plasmidia. "Isäntä GFP-infektoitunut" on isäntä, joka on fuusioitunut mCherryä kantavaan loiseen. Punainen fluoresenssi on mCherry-fluoresenssia isäntään fuusioidusta loisesta (vain tiedot infektoituneesta isännästä ovat saatavilla. Terveet isäntänäytteet eivät sisältäneet mCherry-plasmidia). Virhepalkit kaikissa paneeleissa osoittavat SEM, n=3. Fluoresenssiarvot normalisoidaan tulosten normalisoimiseksi isäntäsolujen pitoisuuteen käytetyn kalvovärin siniseksi fluoresenssiksi. Timanttisymboli osoittaa loisproteiinin ilmentymisen tietyissä infektio-olosuhteissa, mikä on suoraan verrattavissa datapisteeseen, joka on korostettu tähdellä kuviossa 2e, kokeessa samoissa olosuhteissa, mutta isännästä puuttuu MunI-resistenssigeeni.

Kuva 6. Rokotus suojaa infektioita vastaan. (a) Isäntä sisältää GFP-plasmidin. Patogeeni näissä kokeissa on yksi kolmesta tässä artikkelissa esitetystä infektiokaaviosta: loinen (kuten kuvassa 2), patogeeni, jonka MunI-restriktioentsyymi pilkkoo isännän GFP-genomia (kuten kuvassa 3), tai patogeeni. kantavat kalvokanavaa aHL, mikä aiheuttaa ravinteiden vuotamisen isännästä (kuten kuvassa 4). Kussakin tapauksessa isäntä ja patogeeni sisältävät komplementaarisia DNA-fuusiomerkkejä. Ennen patogeenin tuomista isäntä "siirrostetaan": inkuboidaan ylimääräisten ssDNA-oligojen kanssa, jotka ovat komplementaarisia isännän pinnalla oleville fuusio-DNA-leimoille (merkityt, jotka ovat identtisiä patogeenin kanssa, miinus kolesteroliosa, jota käytetään merkkiaineen ankkuroimiseen isännän kalvoon. taudinaiheuttaja). Inokulaatio saa isännän pinnalla olevat fuusiomerkit muuttumaan kaksijuosteisiksi, mikä tekee fuusion patogeenin kanssa mahdottomaksi. b) Rokotusjärjestelmän periaatteen todistaminen. Liposomipopulaatio, joka kantaa GFP:tä T7-RNA-promoottorin ohjauksessa, mutta ilman T7-RNA-polymeraasia, fuusioidaan liposomien kanssa, jotka sisältävät T7-RNA-polymeraasia. GFP-proteiinia voidaan ilmentää vain, jos nämä kaksi populaatiota yhdistyvät. Toinen tai molemmat sekoitusosapuolista "siirrostettiin" inkuboimalla DNA-leiman kanssa, joka oli yhteensopiva liposomin pinnalla olevien fuusiomerkkien kanssa, mikä teki fuusioleimoista kaksijuosteisia ja siten yhteensopimattomia fuusion kanssa. Edustava aikakulku proteiinin ilmentymiselle on esitetty kuvassa S28. Kontrollikokeet ilman fuusiotunnisteita on kuvassa S29, ja vertailut, joissa on yhteensopimattomia fuusiomerkkejä, esitetään kuvassa S30. Inokulaatiooligo-pitoisuus määritettiin kokeellisesti, tiedot esitetään kuviossa S31. (c) Loisinfektiokokeet. GFP:tä kantava isäntä fuusioitiin mCherryä kantavan loisen kanssa, kuten kuvassa 2 on kuvattu. Isäntä ja loinen sekoitettiin isännän ja loisen vaihtelevalla suhteella; isäntäsolut joko siirrostettiin (kaksijuosteisilla DNA-fuusioleimoilla, jotka eivät olleet yhteensopivia fuusion kanssa) tai niitä ei siirrostettu (täten herkkiä fuusiolle loisen kanssa). mCherry-fluoresenssi raportoidaan vain näytteille, joissa isäntä ei ollut inokuloitu, koska inokuloiduissa isäntänäytteissä ei ollut mitattavissa olevaa mCherry-fluoresenssia. Käänteinen inokulaatio testattiin rokottamalla loinen isännän sijaan, tiedot esitetään kuvassa S32. (d) Infektiokokeet MunI-restriktioentsyymiä kantavalle patogeenille herkän isäntägenomin kanssa, kuten kuvassa 3 on kuvattu. Infektoituneet tietosarjat edustavat isäntää ilman inokulaatiota, ja inokuloidut datasarjat edustavat näytteitä, joissa isäntä on inkuboitu inokulaatiooligojen kanssa. ei siten ole herkkä fuusioitumiselle patogeenin kanssa. (e) Infektiokokeet aHL-geeniä kantavalla taudinaiheuttajalla johtavat siihen, että aHL-kanavat vuotavat ravinteita isäntäsoluista infektion jälkeen, kuten kuvassa 4 on kuvattu. Infektoituneet tietosarjat edustavat isäntää ilman inokulaatiota ja inokuloidut tietosarjat edustavat näytteitä, joissa on isäntä, jota inkuboitiin siirrostusoligojen kanssa, joten se ei ole herkkä fuusiolle patogeenin kanssa. Virhepalkit kaikissa paneeleissa osoittavat SEM, n=3. Fluoresenssiarvot paneeleissa (c−e) normalisoidaan kalvovärin siniseen fluoresenssiin, jota käytetään normalisoimaan tulokset isäntäsolujen pitoisuuteen. Jotkut tässä kuvassa esitetyt tiedot ovat kokeita, joiden kokoonpano on identtinen aikaisemmissa kuvissa esitettyjen kokeiden kanssa (kuten kussakin kuvatekstissä on osoitettu). Nämä kokeet toistettiin tätä kuvaa varten tietojen tuottamiseksi käyttämällä samaa TxTl-erää tulosten suoraa vertaamista varten, eliminoiden TxTl-valmisteiden erien vaihtelua.

Synteettisten solujen siirrostus ehkäisee infektioita.

Yllä kuvatussa esimerkissä osoitimme isännän puolustavan patogeenin genomin vaikutusta ekspressoimalla ylimääräistä proteiinia. Seuraavaksi kysyimme, onko mahdollista mallintaa skenaario, jossa jokin interventio tekee aiemmin herkästä isännästä immuuni infektiolle. Kutsuimme sitä rokotusmalliksi. Vaikka tämän tunnustaminen on kaukana täydellisestä analogiasta, keskityimme siihen, että isäntäsynteettinen solu ei kuluta mitään resursseja immuniteetin tuottamiseen. Immunisaatiomallissamme suunnittelimme hoidon, joka muuttaa infektiolle herkän isäntäsolun soluiksi, jotka eivät voi fuusioitua patogeenin kanssa. Tässä artikkelissa käytetty synteettinen solufuusiojärjestelmä perustuu yksijuosteisiin DNA-leimoihin liposomikalvofuusion indusoimiseksi. Inokuloidaksemme fuusiota patogeenin kanssa, inkuboimme soluja DNA-oligonukleotidin kanssa, joka oli komplementaarinen solujen pinnalla olevalle fuusiooligolle (kuvio 6a). Ensin meidän piti vahvistaa, että siirrostus inkuboimalla täydentävän oligon kanssa toimii fuusion poistamiseksi. Periaatteen todistamiskokeissa valmistettiin kaksi liposomipopulaatiota: yhdessä populaatiossa oli TxTl, jossa oli GFP:tä koodaava plasmidi T7-promoottorin ohjauksessa ja toisessa populaatiossa oli TxTl- ja T7-RNA-polymeraasi, mutta ei plasmidia. Näiden kahden populaation fuusion jälkeen GFP-plasmidi sekoittui T7-RNA-polymeraasin kanssa ja indusoi GFP-ilmentymistä. Jos kahdella populaatiolla oli yksijuosteisia ja komplementaarisia fuusioleimoja, tapahtui fuusio ja GFP-fluoresenssi havaittiin. Jos toista tai molempia populaatioita inkuboitiin fuusiomerkkiin komplementaarisen oligonukleotidin kanssa, liposomifuusiota ei tapahtunut eikä GFP:tä ekspressoitu (kuvio 6b). Inokulaatiojärjestelmän luomisen jälkeen jatkoimme siirrostuksen käyttöönottoa isäntäsynteettisten solujen suojaamiseksi kolmessa aiemmin tässä työssä kuvatuista infektioskenaarioista. Ensin käytimme kuvassa 2 kuvattua loiskenaariota. GFP-genomin sisältävät isäntäsolut ympättiin oligolla, joka oli komplementaarinen isännän pinnalla olevalle fuusioleimalle, ja isäntä sekoitettiin mCherry-parasiittiin. Sekoittimme isännän loiseen eri suhteissa. Kaikissa infektioolosuhteissa loisen mCherry-fluoresenssia ei voitu havaita, jos isäntä oli siirrostettu ja inokuloidun isännän GFP-fluoresenssi ei vähentynyt. Kontrollikokeet siirrostamattomalla isännällä osoittivat odotetusti alenevan isännän GFP-ilmentymisen ja lisääntyneen loisen mCherry-signaalissa (kuvio 6c). Seuraavaksi sovelsimme inokulaatiojärjestelmää tapaukseen, jossa isäntä oli infektoitunut patogeenilla, joka kantaa genomia koodaavaa MunI-restriktioentsyymiä, joka pystyy pilkkomaan isäntien GFP-genomin, kuten kuvassa 3 esitetyissä kokeissa. Inokuloitu isäntä ei osoittanut laskua GFP-fluoresenssissa sen jälkeen, kun se oli sekoitettu kasvavien patogeenimäärien kanssa, kun taas inokuloimaton isäntä infektoitui ja isännän GFP-fluoresenssi väheni suhteessa patogeenin kasvavaan määrään (kuvio 6d). Rokotus oli tehokas myös aHL-patogeeniä vastaan. Inokuloidut isännät eivät osoittaneet fluoresenssin laskua sekoittuessaan patogeenin kanssa, kun taas inokuloimattoman isännän GFP-fluoresenssi väheni merkittävästi infektion myötä (kuvio 6e). Kaikissa tapauksissa tämä yksinkertainen siirrostusmenetelmä, jossa isäntää inkuboitiin DNA-oligon kanssa, joka on komplementaarinen isännän pinnalla olevalle fuusiooligolle, oli riittävä poistamaan patogeenisten synteettisten solujen kyvyn infektoida isäntäsoluja. Siksi osoitimme yksinkertaisen fysikaalis-kemiallisen interventiomallin, joka suojaa isäntäsoluja infektiolta.

cistanche-edut miehille - vahvistavat immuunijärjestelmää

PÄÄTELMÄT

Tässä artikkelissa esittelemme menetelmiä synteettisten minimaalisten solujen käyttämiseksi loisten ja patogeenisten infektioiden mallintamiseen. Työmme taustalla oli kaksinkertainen motivaatio. Halusimme suunnitella monimutkaisia, eläviä soluja synteettisiksi soluiksi, mikä helpottaa tavoitetta suunnitella synteettisiä soluja, jotka muistuttavat enemmän luonnollisia eläviä soluja. Halusimme myös hyödyntää yksinkertaista ja hallittavaa synteettistä solujärjestelmää mallintaaksemme infektio-, rokotus- ja resistenssiprosessien perusominaisuuksia. Vaikka synteettiset solut eivät kehity tai replikoidu itsestään, tämä järjestelmä mahdollistaa infektiodynamiikan tutkimisen yksinkertaisessa ja helposti analysoitavassa mallissa. Toivomme, että tässä kuvatut tartunnan periaatteet auttavat luomaan käytännöllisiä ja soveltuvia malleja eri taudinaiheuttajille ja infektioiden lieventämiseen. Tämän yksinkertaistetun synteettisen solujärjestelmän tutkiminen korosti loisen ja patogeenin välisiä perustavanlaatuisia vuorovaikutuksia. Vaikka synteettiset solut eivät (vielä) ole elossa, eivätkä ne pysty käymään läpi darwinista evoluutiota, tämä järjestelmä antaa meille mahdollisuuden tarkkailla patogeenin ja isännän vuorovaikutusta ilman kykyä kehittää luonnollista immuniteettia tai muuttaa patogeenin virulenssia. Vaikka tässä esitetty isäntäinfektiodynamiikka käyttää bakteeripohjaisia ​​synteettisiä soluja, tämä järjestelmä ei ole luonnostaan ​​rajoittunut bakteerien TxTl:ään. Olisi jopa mahdollista kuvitella, että tässä esitellyllä systeemillä mallinnettaisiin infektiodynamiikkaa luonnollisia ekosysteemejä muistuttavissa populaatioissa hyödyntäen synteettisille soluille ominaista yksinkertaisuutta suurten populaatioiden eri jäsenten välisten vuorovaikutusten täydellisessä hallinnassa ja tutkimisessa.

VIITTEET

(1) Sovellukset. Mater. Tänään 2016, 19, 516–532.

(2) Gaut, NJ; Adamala, KP Luonnollisten soluelementtien uudelleenmuodostaminen synteettisissä soluissa. Adv. Biol. 2021, 5, nro 2000188.

(3) Tan, C.; Saurabh, S.; Bruchez, kansanedustaja; Schwartz, R.; Leduc, P. Molecular Crowding Shapes Gene Expression in Synthetic Cellular Nanosystems. Nat. Nanotekniikka. 2013, 8, 602–608.

(4) Glantz, ST; Berlew, EE; Chow, BY Synteettiset solumaiset kalvorajapinnat dynaamisten proteiini-lipidivuorovaikutusten tutkimiseen, 1. painos; Elsevier Inc, 2019; Voi. 622.

(5) Zhao, J.; Zhang, Y.; Zhang, X.; Li, C.; Du, H.; Sønderskov, SM; Mu, W.; Dong, M.; Han, X. Mimicking Cellular Metabolism in Artificial Cells: Universal Molecule Transport kalvon läpi vesikkelifuusion kautta. Anaali. Chem. 2022, 94, 3811–3818.

(6) Damiano, L.; Stano, P. Synteettisten solujen "elinomaisuudesta". Edessä. Bioeng. Biotechnol. 2020, 8, nro 953.

(7) Salehi-Reyhani, A.; Ces, O.; Elani, Y. Keinotekoiset solujäljitelmät yksinkertaistettuina malleina solubiologian tutkimukseen. Exp. Biol. Med. 2017, 242, 1309–1317.

(8) Chakraborty, T.; Wegner, SV Signalointi solusta soluun valon kautta keinosoluyhteisöissä: hehkuva saalistaja houkuttelee saalista. ACS Nano 2021, 15, 9434–9444.

(9) Dupin, A.; Simmel, FC Signalointi ja eriyttäminen emulsiopohjaisissa moniosastoisissa in vitro -geenipiireissä. Nat. Chem. 2019, 11, 32–39.

(10) Toparlak, OD; Zasso, J.; Bridi, S.; Serra, MD; Macchi, P.; Conti, L.; Baudet, M.-L.; Mansy, SS:n keinotekoiset solut ajavat hermosolujen erilaistumista. Sci. Adv. 2020, 6, nro eabb4920.

(11) Robinson, AO; Venero, OM; Adamala, KP Kohti synteettistä elämää: Biomimetic Synthetic Cell Communication. Curr. Opin. Chem. Biol. 2021, 64, 165–173.

(12) Smith, JM; Chowdhry, R.; Booth, MJ ohjaa synteettistä solujen välistä viestintää. Edessä. Mol. Biosci. 2022, 8, nro 1321.

(13) Elani, Y. Elävien ja synteettisten solujen rajapinta synteettisen biologian nousevana rajana. Angew. Chem., Int. Ed. 2021, 60, 5602−5611.

(14) Rustad, M.; Eastlund, A.; Jardine, P.; Noireaux, V. Infektoivan T4-bakteerin soluton TXTL-synteesi yksittäisessä koeputkireaktiossa. Synth. Biol. 2018, 3, nro ysy002.

(15) Marshall, R.; Noireaux, V. All-E:n transkription ja kääntämisen kvantitatiivinen mallintaminen. colin soluton järjestelmä. Sci. Rep. 2019, 9, nro 11980.

(16) Garamella, J.; Marshall, R.; Rustad, M.; Noireaux, V. All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: Soluttoman synteettisen biologian alusta. ACS Synth. Biol. 2016, 5, 344–355.

(17) Deich, C.; Cash, B.; Sato, W.; Sharon, J.; Aufdembrink, L.; Gaut, NJ; Heili, J.; Stokes, K.; Engelhart, AE; Adamala, KP T7Max -transkriptiojärjestelmä. 2021, 1-28.

(18) Gaut, NJ; Gomez-Garcia, J.; Heili, JM; Cash, B.; Han, Q.; Engelhart, AE; Adamala, KP Ohjelmoitava fuusio ja synteettisten minimisolujen eriyttäminen. ACS Synth. Biol. 2022, 11, 855− 866.

(19) Stengel, G.; Zahn, R.; Höök, F. DNA-indusoitu ohjelmoitava fosfolipidirakkuloiden fuusio. J. Am. Chem. Soc. 2007, 129, 9584−9585.

(20) Chizzolini, F.; Forlin, M.; Yeh Martín, N.; Berloffa, G.; Cecchi, D.; Mansy, SS-soluton käännös on vaihtelevampi kuin transkriptio. ACS Synth. Biol. 2017, 6, 638–647.

(21) Shin, J.; Noireaux, V. E. coli -soluvapaan ilmentämisen työkalupakki: Sovellus synteettisiin geenipiireihin ja keinotekoisiin soluihin. ACS Synth. Biol. 2012, 1, 29–41.

(22) Noireaux, V.; Libchaber, A. Vesikkelibioreaktori askeleena kohti keinotekoista solukokoonpanoa. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004, 101, 17669−17674.

(23) Adamala, KP; Martin-Alarcon, DA; Guthrie-Honea, KR; Boyden, ES Engineering Genetic Circuit vuorovaikutus synteettisten minimaalisten solujen sisällä ja välillä. Nat. Chem. 2017, 9, 431–439.

(24) Noireaux, V.; Bar-Ziv, R.; Godefroy, J.; Salman, H.; Libchaber, A. Kohti keinotekoista solua, joka perustuu geeniekspressioon rakkuloissa. Phys. Biol. 2005, 2, P1-P8.

(25) Krinsky, N.; Kaduri, M.; Zinger, A.; Shainsky-Roitman, J.; Goldfeder, M.; Benhar, I.; Hershkovitz, D.; Schroeder, A. Synteettiset solut syntetisoivat terapeuttisia proteiineja kasvainten sisällä. Adv. Terveydenhuolto Mater. 2018, 7, nro 1701163.

(26) Kwon, YC; Jewett, MC Raakauutteen korkean suorituskyvyn valmistusmenetelmät vahvaan soluttomaan proteiinisynteesiin. Sci. Rep. 2015, 5, nro 8663.

(27) Sun, ZZ; Hayes, CA; Shin, J.; Caschera, F.; Murray, RM; Noireaux, V. Protokollat ​​Escherichia Coli -pohjaisen TXTL-soluvapaan ilmentämisjärjestelmän toteuttamiseksi synteettiselle biologialle. J. Vis. Exp. 2013, 79, 1–15.

(28) Fujii, S.; Matsuura, T.; Sunami, T.; Nishikawa, T.; Kazuta, Y.; Yomo, T. Liposominäyttö kalvoproteiinien in vitro -valintaa ja -kehitystä varten. Nat. Protoc. 2014, 9, 1578–1591.

(29) Löffler, PMG; Ries, O.; Rabe, A.; Okholm, AH; Thomsen, RP; Kjems, J.; Vogel, S. DNA-ohjelmoitu liposomifuusiokaskadi. Angew. Chem., Int. Ed. 2017, 56, 13228−13231.