Kananluun kollageenipeptidien oraalinen saanti hiirten ihon ikääntymistä estäen säätelemällä kollageenin hajoamista ja synteesiä, estämällä tulehdusta ja aktivoimalla lysosomeja

Ota yhteyttäoscar.xiao@wecistanche.comLisätietoja

Abstrakti:Ruokavalion vaikutuksesta ihon ikääntymiseen on tullut mielenkiintoinen tutkimusaihe. Aiemmat tutkimukset ovat keskittyneet pääasiassa meren eliöistä peräisin olevien kollageenipeptidien hyödyllisiin vaikutuksiin ikääntyvälle iholle suun kautta annettuna, kun taas siipikarjasta peräisin olevien kollageenipeptidien hyödyllisiä vaikutuksia ikääntyvälle iholle on raportoitu harvoin. Tässä tutkimuksessa kollageenipeptidejä valmistettiin kanan luusta entsymaattisella hydrolyysillä ja suun kautta annettavien kollageenipeptidien vaikutusta ja vaikutusmekanismia UV:n ja D-galaktoosin aiheuttaman ihon ikääntymisen lievittämisessä. Tulokset osoittivat, että kananluun kollageenilla oli kollageenille tyypillisiä ominaisuuksia ja kananluun kollageenipeptidit (CP:t) olivat pääosin pienimolekyylisiä peptidejä, joiden molekyylipaino oli n.<3000 da.="" in="" vivo="" experiments="" showed="" that="" cps="" had="" a="" significant="" relieving="" effect="" on="" aging="" skin,="" indicated="" by="" the="" changes="" in="" the="" compostion="" and="" structure="" of="" the="" aging="" skin,="" improvement="" of="" skin="" antioxidant="" level,="" and="" inhibition="" of="" inflammation;="" the="" relieving="" effect="" was="" positively="" correlated="" with="" the="" dose="" of="" cps.="" further="" investigation="" showed="" that="" cps="" first="" reduce="" the="" level="" of="" skin="" oxidation,inhibit="" the="" expression="" of="" the="" key="" transcription="" factor="" ap-1(c-jun="" and="" c-fos),="" then="" activate="" the="" tgf-β/smad="" signaling="" pathway="" to="" promote="" collagen="" synthesis,="" inhibit="" the="" expression="" of="" mmp-1/3="" to="" inhibit="" collagen="" degradation,and="" inhibit="" skin="" inflammation="" to="" alleviate="" skin="" aging="" in="" mice.="" moreover,="" the="" skin="" transcriptome="" found="" that="" lysosomes="" activated="" after="" oral="" administration="" of="" cps="" may="" be="" an="" important="" pathway="" for="" cps="" in="" anti-skin="" aging,="" and="" is="" worthy="" of="" further="" research.="" these="" results="" suggested="" that="" cps="" might="" be="" used="" as="" a="" functional="" anti-aging="" nutritional="">

Napsauta tätä saadaksesi lisätietoja

Avainsanat:kollageenipeptidit; ikääntymistä vastaan; ihon transkriptio;kollageenisynteesi;lysosomit

1. Esittely

Terveyden aikakausi, terveellisen ruokavalion tarkka noudattaminen, ravinnon roolin määrittäminen ihon ikääntymisessä ja sen päättäminen, mitä syödä säilyttääkseen nuorekkaan ja terveen ihon, ovat vaikeita ongelmia. Iho on kehon suurin elin, joka koostuu epidermiksestä, verinahasta ja ihonalaisesta kerroksesta. Se toimii esteenä, joka suojaa kehoa ulkoisilta tekijöiltä, ​​ja sillä on myös rooli terveydessä ja kauneudessa[1. Ihon ikääntyminen on monimutkainen prosessi, joka jakautuu kronologiseen ikääntymiseen ja valovanhenemiseen ja johon vaikuttavat sekä sisäiset että ulkoiset tekijät.cistanche-varsiTärkeimpiä ominaisuuksia ovat makromolekyylivaurioiden kerääntyminen soluun, kantasolujen toiminnan heikkeneminen (edistää kudosten uusiutumista) ja ihon fyysisen eheyden asteittainen menetys [2]. Tärkeimmät ihon ikääntymistä aiheuttavat molekyylimekanismit ovat pääasiassa oksidatiivinen stressi, telomeerien lyheneminen, DNA-vauriot, geneettinen mutaatio, mikro-RNA:n säätely, pitkälle edennyt glykaation lopputuotteen kertyminen ja tulehduksia aiheuttava ikääntyminen 3]. Valovanheneminen on ihon epidermaalisen liikakasvua, kuivumista ja solunulkoisen matriisin hajoamista ultraviolettisäteilyn aiheuttamana. Valon ikääntymisen pääasiallinen syy on ultraviolettisäteilyn synnyttämät reaktiiviset happilajit (ROS), jotka välittävät matriksin metalloproteinaasien (MMP) ja tyypin I prokollageenin ilmentymistä signaalireittien, kuten mitogeenin aktivoiman proteiinikinaasin (MAPK) kautta. Tämä johtaa solunulkoisen matriisin (ECM) hajoamiseen ihossa ja fibroblastien apoptoosiin [4]. Viime vuosina ihon terveyden ylläpitämisestä ja ikääntymisen hidastamisesta on tullut suosittua, ja luonnollisten ainesosien, kuten bioaktiivisten peptidien ja polyfenolien, joilla on antioksidanttisia ja ikääntymistä estäviä toimintoja, löytämisestä on tullut tutkimuksen hotspot [5].

Cistanche voi estää ikääntymistä

Kollageenilla on kuitenkin suuri molekyylipaino, ja sitä on vaikea imeytyä suoraan ja käyttää hyväksi, kun taas pienimolekyylisillä kollageenipeptideillä on kollageenihydrolyysin jälkeen vahvempi biologinen aktiivisuus ja korkea absorptionopeus [6]. Samaan aikaan kollageenin laaja käyttö elintarvikkeissa, lääketieteessä, kudostekniikassa, kosmetiikassa ja muilla aloilla on tehnyt kollageenipeptideistä, joilla on pienempi molekyylipaino, korkeampi absorptioteho ja vahvempi biologinen aktiivisuus, uuden suosikin funktionaalisessa ruoassa ja lääketieteellisessä tutkimuksessa [{{1 }}]. Kollageenipeptidit ovat pieniä, ja ne sisältävät 2-20 aminohappotähteitä, jotka on saatu kollageenihydrolyysin jälkeen. Niitä käytetään ravintolisänä ihon ikääntymisen hoitoon niiden mahdollisten anti-inflammatoristen ja antioksidanttisten toimintojen ja immuunisäätelyn sekä antioksidanttien ja proliferaation vaikutusten vuoksi ihon fibroblasteihin [10].

Suun kautta annon jälkeen kollageenipeptidit imeytyvät pienten peptidien muodossa ja kuljetetaan nopeasti vereen ja lopulta munuaisiin, ihoon, niveliin ja muihin kudoksiin varastoitavaksi ja käytettäväksi. 14 päivän kuluttua radioaktiivisuustasot pysyivät korkeina hiirten ihossa, joille oli annettu letkulla C14--leimattuja kollageenipeptidejä.cistanche tubulosa hyödyt ja sivuvaikutuksetElimistö pystyy imeytymään ja hyödyntämään kollageenipeptidit lähes kokonaan, kun taas kollageenin imeytyminen ja käyttöaste on vain 50-60 prosenttia [6,11-13]. Viime vuosina kalan ihosta, kalan suomusta, lehmän luusta, lehmän nahasta ja sian ihosta peräisin olevilla kollageenihydrolysaatteilla on laajalti raportoitu olevan myönteisiä vaikutuksia ihon ikääntymisen lievittämiseen, ja ne ovat saaneet huomattavaa huomiota tutkijoilta. Esimerkiksi hopeakarpin ihosta eristetyt kollageenipeptidit edistävät kollageenin synteesiä ja estävät AP-1-, MMP-1- ja MMP-3-proteiinien ilmentymistä aktivoimalla TGF-/Smad-reittiä. estämään kollageenin hajoamista ja korjaamaan valoikääntyneitä ihosoluja [14]. Naudan kollageenipeptidien oraalinen antaminen voi parantaa ihon rentoutumista, lisätä kollageenipitoisuutta ja antioksidanttientsyymiaktiivisuutta, korjata kollageenikuitua ja normalisoida ihon kollageenisuhdetta ikääntyvillä hiirillä [15]. Eri lähteistä peräisin olevilla kollageenipeptideillä on kuitenkin erilaisia ​​vaikutuksia. Erittäin aktiivisten peptidien määrä ja rakenne veressä kollageenipeptidien oraalisen annon jälkeen riippuvat kollageenin lähteestä [10]. Kanan ihosta uutetun kollageenipeptidin suojaava vaikutus UVA:n aiheuttamaa fibroblastivauriota vastaan ​​oli parempi kuin sian, lehmän tai tilapian ihosta uutetun kollageenipeptidin, ja sen vaikutus vastasi kollageeniperäistä tripeptidiä (Gly-Pro). -Hyp)[16].

Uskonnolliset uskomukset ja sairaudet (kuten hullun lehmän tauti) ovat saaneet ihmiset asteittain siirtämään kollageenin ja sen tuotteiden kehityssuuntaa maan nisäkkäistä siipikarjaan ja meren eliöihin|17I. Siipikarjan prosessoinnin pääasiallisena sivutuotteena kana on luu on lupaava kollageenituotteiden lähde. Se ei ainoastaan ​​vähennä resurssien tuhlausta ja ympäristön saastumista, vaan mahdollistaa myös sivutuotteiden tehokkaan hyödyntämisen. Siksi tässä tutkimuksessa käytimme raaka-aineina kananluun kollageenipeptidejä, joissa nude-hiiriä käsiteltiin D-galaktoosilla ja UV-säteilyllä ihon ikääntymisen indusoimiseksi, mallina arvioida kollageenipeptidin oraalisen annon vaikutusta ihon ikääntymisen lievitykseen. hiiret ja määritä asiaankuuluva mekanismi.

2. Materiaalit ja metodit

2.1. Materiaalit, kemikaalit ja eläimet

Yunnanin maatalousyliopiston (Kunming, Kiina) kanatilat toimittivat käytetyt kanat, jotka erotettiin, kuivattiin ja murskattiin kanan luujauhon saamiseksi. Su-peroksididismutaasi (SOD), katalaasi (CAT) ja glutationiperoksidaasi (GSH-PX) -sarjat ostettiin Soleibao Biotechnology Co., Ltd:ltä (Peking, Kiina). Hydroksiproliini (HYP), interleukiini-1 (IL-1x), matriksimetalloproteinaasi-1/3 (MMP-1/3), tyypin I pro-kollageeni ja hyaluronihappo (HA) Enzyme-linked immunoassay (ELISA) -sarjat ostettiin Nanjing Jiancheng Bioengineering Institutelta (Nanjing, Kiina). Terveet naaraspuoliset karvattomat BALB/C-hiiret (18±2g, kuuden viikon ikäiset) ostettiin Nanijing Junke Bioengineering Corporation, Ltd.:ltä (Nanjing, Kiina) lupanumerolla: SCXK(SU)2016-0010.cistanche tubulosa -uutePepsiini ja papaiini ostettiin Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd:ltä (Shanghai, Kiina), ja muut kemikaalit olivat analyyttistä laatua. Kaikkia hiiriä käsiteltiin Yunnanin maakunnan Laboratory Animal Care -säännösten mukaisesti ja Yunnanin maatalousyliopiston eläinten hoito- ja käyttökomitean (hyväksyntätunnus: YAUACUC01) hyväksymä.

2.2. Kollgeenivalmiste ja aminohappokoostumus

Kananluun kollageenin uuttaminen ja aminohappokoostumus noudatti Liuet ai. [18]pienillä muutoksilla. Kananluujauhetta sekoitettiin ja liotettiin 0.05 M NaOH:ssa, 10 % n-heksaanissa ja 0,25 M EDTA-liuoksessa (pH 7,5). ) suhteessa 1/10 (m/o). Jokaisessa vaiheessa näytettä käsiteltiin 36 tuntia ja liotusliuosta vaihdettiin 6 tunnin välein luujauheen turvottamiseksi, ei-kollageeniproteiinien, rasvan ja mineraalien poistamiseksi luujauheesta. Näyte pestiin puhtaalla vedellä neutraaliksi jokaisen vaiheen jälkeen. Esikäsitelty kanan luujauho sekoitettiin 0,5 M jääetikkaa, joka sisälsi 0,1 % (w/v) pepsiiniä kiinteän aineen ja nesteen suhteen 1:10 (w/v) ja sekoitettiin jatkuvasti ja uutettiin 4 asteessa 48 h. Sitten se suodatettiin ja suodosta sentrifugoitiin 15,000 × g 15 minuuttia 4 asteessa. Supernatantin pH säädettiin arvoon 7.{30}},8 NaOH-liuoksella, ja NaCl:a lisättiin lopulliseen pitoisuuteen 1,5 M. Sen jälkeen, kun seosta pidettiin 12 tuntia 4 asteessa suolaamista varten, kollageeni sakka sentrifugoitiin 15,000 x g 15 minuuttia 4 asteessa, liuotettiin sitten 0,5 M etikkahappoon, dialysoitiin puhtaaseen veteen, pakastekuivattiin ja lopputuote oli kananluun kollageenia.

Kananluun kollageenin aminohappokoostumus määritettiin Sykam S433D -aminohappoanalysaattorilla (München, Saksa). Tietty määrä testattavaa kollageeninäytettä otettiin suljettuun putkeen, lisättiin 10 ml 6 M HCl:a ja hydrolvoitiin 110 °C:ssa 24 tuntia. Hydrolysaatti konsentroitiin typpipuhalluksella ja liuotettiin uudelleen 20 ml:aan sitruunahappopuskuria. 0,22 um:n mikrohuokoisella kalvolla suoritetun mikrosuodatuksen jälkeen otettiin 20 µl hydrolysaattia aminohappospektrianalyysiä varten. Näytteen aminohappopitoisuus ilmaistiin prosentteina.

2.3. Kollageenipeptidien (CP:iden) valmistus ja molekyylipainon jakautuminen

Edellisen optimointiprosessimme tulosten mukaan CP:t valmistettiin käyttämällä papaiinia entsyymi-substraattisuhteella 1:40 (massasuhde). Kun pH oli säädetty arvoon 7 ja entsymaattinen hydrolyysi 63 asteessa 5 tunnin ajan, entsyymi inaktivoitiin kiehuvassa vesihauteessa 15 minuutin ajan. Entsyymihydrolysaatista poistettiin suola ja se lyofilisoitiin, liuotettiin uudelleen 0,1-prosenttiseen muurahaishappoliuokseen ja sentrifugoitiin supernatantin saamiseksi. AQ Exactive HF Orbitrap High-Resolution Mass Spectrometer-QE-HF (Thermo Fisher, Waltham, MA, USA), joka oli varustettu sähkösumutusionisaatiolla (ESI), käytettiin analysoimaan kollageenihydrolysaattia täydellä pyyhkäisytilassa 350-1800 m. /z, ja tulokset haettiin ja analysoitiin Proteome Discoverer 2.1 -ohjelmistolla.

2.4. Eläinkoe

Naaraspuolisia BALB/C-karvattomia hiiriä (n{{0}}) pidettiin huoneessa kontrolloiduissa olosuhteissa: lämpötila (24±1 astetta), kosteus (60 ±5 prosenttia) ja 12 h päivä-yö -kierto yhden viikon ajan. Heille annettiin ad libitum mahdollisuus saada ruokaa ja vettä. Viikon mukauttamisen jälkeen hiiret jaettiin satunnaisesti seuraaviin viiteen ryhmään (n =11 ryhmää kohden): (i). Normaali ryhmä (N): UV-valottumaton; suun kautta annettava 0,4 ml suolaliuosta päivittäin. (ii). Malliryhmä (M): UV-altistettu plus D-galaktoosi (0,2 ml); 0,4 ml suolaliuosta suun kautta päivittäin.

(i). Pienen annoksen kollageenipeptidiryhmä (LCP:t): UV-altistettu plus D-galaktoosi (0,2 ml); oraalinen

0,4 ml CP:tä (annos: 200 mg:kg-1 ruumiinpainoa) päivittäin.

(iv). Keskiannoksen kollageenipeptidiryhmä (MCP:t): UV-altistettu plus D-galaktoosi; suun kautta

0,4 ml CP:tä (annos: 500 mg·kg-1 ruumiinpainoa) päivittäin.

(v). Suuriannoksinen kollageenipeptidiryhmä (HCP): UV-altistettu plus D-galaktoosi; suullinen hoito-

0,4 ml CP:tä (annos: 1000 mg kg-1 ruumiinpainoa) päivittäin.

D-galaktoosihoito suoritettiin antamalla 0,2 ml 10-prosenttista D-galaktoosiliuosta ihonalaisesti hiiren kaulan takaosaan (annos: 1.0g/ kg-1paino) päivässä. UV-säteilytys suoritettiin 40 W UVA-340 LAMIP:llä (O-paneeli, Cleveland, USA, huippuaallonpituus: 340 nm), lampun ja hiirien takaosan välinen etäisyys oli 30 cm (230 m J/cm). -), ja säteilytys kesti 30 minuuttia joka päivä seitsemän viikon ajan (49 päivää). Säteilyn intensiteetti mitattiin UVA365-radiometrillä (Xinbao Keyi Electronic Technology Co., Ltd., Xi'an, Kiina). Tunti D-galaktoosi- ja UV-käsittelyn jälkeen hiirille annettiin 0,4 ml CP:tä suun kautta joka päivä. Viimeisen säteilytyksen jälkeen hiiret nukutettiin, punnittiin ja kudoksista otettiin näytteitä myöhempää analyysiä varten.

2.5. Ihon kosteus, sisäelinten indeksi ja kehon painon nousu

Ihon kosteus määritettiin ISO 1442:lla ja sisäelinten indeksi laskettiin käyttämällä seuraavaa yhtälöä: sisäelinten indeksi (g/kg)= sisäelinten paino/kehon paino.

2.6. Oxidatioe Stress, HA ja Ihon HYP-pitoisuus

Ihonäytteet homogenisoitiin yhdeksännkertaisella määrällä normaalia suolaliuosta (w/w) jäähauteessa kudoshomogenisaattorilla (TGrinder OSE-Y30, Tiangen Biochemical Technology Co., Ltd., Peking, Kiina) ja sentrifugoitiin sitten 2000:ssa. ×g ja 4 astetta 10 minuutin ajan. Superoksididismutaasin (SOD), katalaasin (CAT) ja glutationiperoksidaasin (GSH-PX) aktiivisuudet sekä hyaluronihapon (HA) ja hydroksiproliinin (HYP) pitoisuudet kerätystä supernatantista määritettiin julkaisussa kuvatun menetelmän mukaisesti. vastaavia sarjoja vastaavat ohjeet.

2.7. Ihon histologinen

Hiiren ihonäytteet kiinnitettiin 4-prosenttisessa paraformaldehydiliuoksessa 24 tunnin ajan, kuivattiin, upotettiin parafiiniin ja viipaloitiin. Iholeikkeet värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (HE) ja tarkkailtiin ECLIPSE CI-E eteenpäin suuntautuvalla fluoresenssimikroskoopilla (Nikon, Japani). Ihon epidermiksen ja dermiksen paksuus arvioitiin Halcon 13.0.1.1 -ohjelmistolla (MVTec, München, Saksa).

2.8. Ihon transkriptoimisekvensointi

2.8.1. RNA:n erottaminen, kirjaston rakentaminen ja transkriptiosekvenssi

Kokonais-RNA uutettiin hiirten ihosta käyttämällä RNeasy Mini Kit -sarjaa (Tiangen Bio-chemical Technology Co., Ltd., Peking, Kiina) valmistajan ohjeiden mukaisesti. RNA:n puhtaus ja pitoisuus tarkistettiin käyttämällä kaiaoK5500 Spectrophoto-meter -laitetta (Kaiao, Peking, Kiina); RNA:n eheys arvioitiin käyttämällä RNA Nano 6000 Assay Kit -sarjaa ja Bioanalyzer 2100 -järjestelmää (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Kunkin näytteen transkription sekvensointianalyysin suoritti Biolinker Technology Company Limited (Kunming, Kiina). Lyhyesti sanottuna indeksikoodattujen näytteiden klusterointi suoritettiin cBot-klusterin generointijärjestelmässä käyttämällä HiSeq PE Cluster Kit v4-cBot-HS(llu-mina) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Klusterin luomisen jälkeen kirjastot sekvensoitiin Ilumina-alustalla ja luotiin 150 bp:n parillisen pään lukuja.

2.8.2. Bioinformatiikka RNA-sekvensointitietojen analyysit

Gene Ontology (GO) ja Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) -rikastusanalyysit differentiaalisesti ekspressoituneiden geenien (DEG) avulla suoritettiin käyttämällä R-kielen klusterianalysaattoripakettia. Kun p-arvo oli pienempi kuin 0,05, GO:n ja KEGG:n rikastamia kohteita ja polkuja pidettiin merkittävinä.

2.8.3. Käänteistranskriptaasi-polymeraasiketjureaktio (qRT-PCR)

QRT-PCR suoritettiin aiemmin kuvatulla tavalla [19].

2.9. Wester Blot

Park et ai. kuvaaman menetelmän mukaisesti. [20] Western blot (WB) -analyysi suoritettiin ihon ikääntymiseen liittyvien proteiinien ilmentymisen kvantifioimiseksi hiirissä. Iholysaatin proteiinipitoisuus kussakin hoitoryhmässä määritettiin käyttämällä BCA-sarjaa, erotettiin SDS-PAGE:lla (10-prosenttinen akryyliamidigeeli), siirrettiin PVDF-kalvolle, suojattiin 5-prosenttisella rasvattomalla maidolla ja inkuboitiin sopivan määrän kanssa primääriainetta. vasta-aineita (TGF-b1, c-Fos, c-Jun, Samd2/3 ja -aktiini) 4 asteessa yön yli. TBST:llä pesun jälkeen näytteet sekoitettiin sekundaaristen vasta-aineiden kanssa ja inkuboitiin huoneenlämpötilassa 1 tunti.cistanche tubulosa arvostelutChemiDoc XRS plus kemiluminesenssigeelikuvantajaa (BioRAD, Hercules, CA, USA) käytettiin tiettyjen proteiinien havaitsemiseen. Image] -ohjelmistoa käytettiin kohdeproteiinin ilmentymisen kvantifiointiin kussakin hoitoryhmässä, ja tulokset esitettiin tiheysarvoina, jotka oli normalisoitu -aktiiniproteiiniksi.

2.10.ELISA

MMP{0}}, MMP-3, tyypin I pro-kollageenin ja IL-1&:n ilmentymistasot ihon hajoamisnesteessä määritettiin entsyymi-immunomäärityksellä. Määritys suoritettiin pakkauksen mukana toimitettujen ohjeiden mukaisesti.

2.11. Tilastolliset analyysit

Kaikki tulokset analysoitiin käyttämällä SPSS 21 (IBM Inc., Armonk, NY, USA) -ohjelmistoa yksisuuntaisen varianssianalyysin (ANOVA) ja Duncanin usean alueen testin avulla merkitsevyystasoksi asetettuna p.<0.05. originpro="" 2017(originlab,="" northampton,="" ma,="" usa)was="" used="" to="" plot="" the="" data.="" all="" data="" were="" expressed="" as="" the="" mean="" ±="" standard="" deviation="">

3. Tulokset ja keskustelu

3.1. Kollageenin aminohappokoostumus

Kananluun kollageenin aminohappokoostumus on esitetty taulukossa 1. Gly oli tärkein aminohappo näytteissä ja sen osuus oli lähes kolmasosa (27.86 prosenttia) kaikista aminohapoista, ja Hyp oli kollageenin erityinen aminohappo, jonka osuus on 9,83 prosenttia. Kollageenimolekyylien tärkeimmät ominaisuudet olivat toistuvat Gly-XY-sekvenssit ja ainutlaatuinen kolmikierteinen rakenne, joka koostuu kolmesta ketjusta. Glyn osuus aminohappojen kokonaismäärästä oli noin kolmasosa, X ja Y olivat usein proliinia ja hydroksiproliinia tai ne voivat olla mikä tahansa tähde [21]. Näytteen aminohappokoostumus oli samanlainen kuin aiemmissa tutkimuksissa raportoidulla kananluun kollageenilla, ja sillä oli kollageenille tyypilliset ominaisuudet [22].

3.2. CP:iden molekyylipainon jakautuminen

Molecular weight distribution reflects the degree of collagen hydrolysis. The molecular weight of the CPs was mainly below 3000 Da (Figure 1), accounting for about 87.61%of all collagen hydrolysates, indicating that almost all of the CPs were small peptides. Many studies claim that collagen peptides with a lower molecular weight have better biological activity [23]. For example, Song et al. [24]. reported that lower molecular weight (200-1000 Da, 65%)silver carp skin collagen peptides repaired UV-induced aging skin in mice more effectively than similar peptides with a higher molecular weight(>1000 Da, 72 prosenttia). Saksalainen Gelita-yhtiö osoitti kuitenkin useilla kliinisillä tutkimuksilla, että kollageenipeptidien vaikutus määräytyy pääasiassa niiden yhteensopivuuden asteen mukaan kollageenipeptidien ominaisuuksiin ihmisen kollageenin hajoamisen jälkeen, eikä kollageenipeptidien molekyylipainosta. He havaitsivat, että tuotteella VERISOL③, jonka keskimääräinen molekyylipaino on 2000 Da, on eniten stimuloiva vaikutus ihon fibroblasteihin, kun taas tuotteella FortigelTM, jonka keskimääräinen molekyylipaino on 3000 Da, on erityinen vaikutus ruston korjaamiseen [25-27].

3.3. Oraalisten CP-lääkkeiden vaikutus ihon ikääntymisen lievitykseen

3.3.1.Kehon paino ja elinindeksi

Painoindeksi ja elinindeksi ovat tärkeitä ja heijastavat hiirten terveydentilaa. Jokaisen ryhmän hiirten paino nousi normaalisti testijakson aikana (taulukko 2). M-ryhmän keskimääräinen painonnousu oli pienempi kuin N-ryhmän ja CP-hoitoryhmien painonnousu oli korkeampi kuin M-ryhmän, mikä viittaa siihen, että CP:illä ei ollut sivuvaikutuksia hiirissä. Aiemmissa raporteissa kollageenipeptidillä käsiteltyjen hiirten annos oli enimmäkseen välillä 100-1000 mg/kg.bw·d, ja tilapiakollageenipeptidien turvallinen annos oli 4,07 g/kg.bw·d [{{6} }]. Samoin ihon ikääntyneiden hiirten kasvu tilapia-asteikkokollageenipeptidien (annokset: 500 ja 1000 mg/kg·bw·d) letkuruokituksen jälkeen oli myös samanlaista kuin tuloksemme [29]. Pernalla on tärkeä rooli humoraalisessa ja sellulaarisessa immuniteetissa, joten pernaindeksiä käytetään usein immuunijärjestelmän toiminnan arvioinnissa.cistanche UKThe liver index was used to evaluate the toxicity of the tested sample. In these tests, the liver and spleen indices in the M group were lower than those in the N group, and both recovered after treatment with CPs, but there was no significant difference across the treatment groups (p >0.05). Tulokset olivat samankaltaisia ​​kuin aikaisemmissa tutkimuksissa [30], mikä osoittaa, että CP:t ovat turvallisia ja saattavat hieman parantaa hiirten immuniteettia.

3.3.2.Ihon koostumus

UV- ja D-galaktoosihoito (M-ryhmä) vähensi merkittävästi ihon kosteus-, HA- ja Hyp-pitoisuutta N-ryhmään verrattuna, vastaavasti 13,36 prosenttia, 24,08 prosenttia ja 15,83 prosenttia (p)<0.05)(table 2).="" the="" contents="" of="" moisture,="" ha,="" and="" hyp="" in="" the="" skin="" were="" significantly="" higher="" in="" mice="" after="" the="" oral="" administration="" of="" cps="" compared="" to="" the="" contents="" of="" those="" in="" the="" mice="" of="" the="" m="" group=""><0.05). among="" the="" dose="" groups,="" the="" contents="" of="" the="" three="" skin="" components="" were="" significantly="" different="" between="" the="" lcp="" and="" hcp="" groups="" and="" were="" dependent="" on="" the="" dose="" of="" intake="" of="" cps.="" the="" hcp="" group="" had="" even="" higher="" contents="" than="" the="" n="" group,="" and="" ha="" and="" hyp="" were="" significantly="" different="" between="" the="" two="" groups="" (p=""><>

Muutokset ihon kosteuspitoisuudessa aiheuttavat ryppyjä ja ihon löystymistä, ja niihin vaikuttavat matriisikomponentit, kuten ihon kollageeni ja HA[31]. Hydroksiproliini on vakaa, rikas ja erityinen kollageenin aminohappo, jonka pitoisuus voi epäsuorasti heijastaa ihon kollageenipitoisuutta sekä ihon ikääntymistä. Lisäksi HA:lla, joka ilmentyy voimakkaasti ihon ECM:ssä, on tärkeä rooli. ihon vesitasapainon, osmoottisen paineen, kosteudenpidätyskyvyn ja kimmoisuuden säätelyssä veden varastointijärjestelmänä ja ihon rakenneosana [32]. Tässä tutkimuksessa ihon kosteus-, HYP- ja HA-pitoisuus nousi merkittävästi CP:n saannin jälkeen, mikä saattaa liittyä kollageeni- ja HA-synteesin edistämiseen CP:illä. Lisäksi HYP:n ja HA:n nousu lisäsi kosteuspitoisuutta.

3.3.3. Ihon histologiset muutokset

Hiirten selän ihon histologiset muutokset seitsemän viikon jatkuvan hoidon jälkeen on esitetty kuvassa 2. M-ryhmän ikääntyvä iho osoitti karkean pinnan, paksuuntuneen orvaskeden, ohentuneen dermiksen ja harvan solujen ominaisuuksia verrattuna hiirien ihoon. N-ryhmä. Ikääntyvän ihon tila hiirillä kuitenkin parani oraalisen CP:n antamisen jälkeen säilyttäen sileän, säännöllisen ja täydellisen rakenteen, joka on samanlainen kuin N-ryhmän hiirillä. Siten ihon dermis oli merkittävästi ohuempi ja orvaskesi merkittävästi paksumpi M-ryhmässä kuin N-ryhmässä (p<0.05). the="" change="" in="" skin="" dermis="" and="" epidermal="" thickness="" was="" significantly="" better="" after="" treatment="" with=""><0.05), and="" the="" effect="" was="" more="" obvious="" with="" the="" increase="" in="" the="" dose="" of="" cps="" (figure="" 2).the="" effect="" of="" oral="" cps="" on="" the="" histological="" structure="" of="" aging="" skin="" was="" similar="" to="" that="" reported="" previously="" [4,28,31].="" the="" increase="" in="" the="" thickness="" of="" the="" epidermis="" might="" be="" an="" adaptive="" change="" to="" protect="" the="" skin="" from="" external="" stimuli,loss="" of="" skin="" moisture,="" and="" uv="" damage,="" possibly="" due="" to="" the="" increase="" in="" uv-activated="" epidermal="" growth="" factor="" receptor="" (egfr)="" that="" induces="" keratinocyte="" proliferation="" and="" epidermal="" hyperplasia[4].="" however,="" the="" mechanism="" by="" which="" oral="" cps="" alleviate="" the="" increase="" in="" epidermal="" thickness="" remains="" unclear.="" the="" dermis="" imparts="" elasticity="" and="" strength="" to="" the="" skin,="" and="" the="" degradation="" of="" ecm="" and="" the="" reduction="" in="" the="" ability="" to="" repair="" fibroblasts="" are="" the="" main="" causes="" of="" dermal="" thinning="" in="" aging="" skin.="" dermal="" thickness="" increased="" after="" the="" treatment="" with="" cps,="" which="" might="" be="" due="" to="" the="" removal="" of="" ros="" from="" the="" skin="" and="" inhibition="" of="" the="" increase="" of="" mmps="" by="" cps.="" this,="" in="" turn,="" inhibited="" the="" degradation="" of="" skin="" collagen="" and="" elastin="" (figure="" 3),="" the="" entry="" of="" cps="" in="" the="" skin,="" and="" their="" participation="" in="" the="" synthesis="" of="" collagen="" and="" ha="" [6],="" which="" was="" confirmed="" by="" the="" increase="" in="" the="" content="" of="" hyp="" and="" ha="" in="" the="" skin="" (table="">

3.3.4. Ihon antioksidantti- ja tulehdustasot

Antioksidanttientsyymien aktiivisuuden määrittäminen on yleisimmin käytetty menetelmä kehon antioksidanttitason arvioimiseksi [28]. Kuten kuvasta 3 näkyy, CAT-, SOD-, GSH-Px- ja MDA-pitoisuudet M-ryhmässä olivat merkittävästi alhaisemmat kuin N-ryhmässä (p<0.05). administering="" cps="" effectively="" inhibited="" the="" decrease="" of="" cat,="" sod,="" gsh-pxactivities,and="" the="" mda="" content="" in="" the="" skin="" of="" mice,="" compared="" to="" those="" in="" the="" mice="" skin="" of="" the="" m="" group,="" and="" was="" positively="" correlated="" with="" the="" dose="" of="" cps;="" there="" were="" significant="" differences="" among="" the="" different="" dose="" groups=""><0.05). when="" ros,="" accumulated="" by="" skin="" oxidative="" stress,="" exceed="" the="" antioxidant="" defense="" ability="" of="" the="" body,="" they="" destroy="" the="" ecm,="" which="" is="" the="" key="" cause="" of="" skin="" aging.="" ros="" can="" cause="" the="" oxidation="" of="" lipids="" and="" proteins="" in="" the="" skin,="" resulting="" in="" fibroblast="" degeneration="" and="" changes="" in="" the="" skin.="" ros="" activate="" the="" mapk="" signaling="" pathway="" and="" the="" ap-1="" protein="" to="" upregulate="" the="" expression="" of="" mmps="" and="" promote="" the="" degradation="" of="" matrixcollagen="" [21].="" although="" the="" antioxidant="" enzymes="" and="" antioxidants="" in="" the="" body="" can="" remove="" ros="" to="" protect="" the="" skin="" from="" damage,="" when="" the="" content="" of="" rosexceeds="" the="" defense="" (antioxidant)="" ability="" of="" the="" body="" or="" the="" body's="" defense="" ability="" declines,="" it="" causes="" oxidative="" stress="" and="" skin="">

Lisäksi ROS:n aiheuttama solujen tulehdusvaste vaikuttaa myös ihon ikääntymiseen. UV- ja D-galaktoosihoidon (M-ryhmä) jälkeen hiirten ihon IL-lo-pitoisuus nousi merkittävästi verrattuna N-ryhmään (kuva 3D). ), mikä osoittaa, että iholla oli merkittävä tulehdusreaktio (s<0.05). the="" cps="" significantly="" reduced="" the="" content="" of="" il-1α="" in="" the="" skin="" in="" a="" dose-dependent="" manner,="" compared="" to="" that="" in="" the="" skin="" of="" mice="" in="" the="" m="" group.="" there="" was="" a="" significant="" difference="" between="" hcps="" and="" lcps=""><0.05),indicating that="" cps="" alleviated="" skin="" inflammation.="" the'o,="" produced="" by="" ultraviolet="" irradiation="" stimulated="" the="" expression="" of="" mmp-1="" in="" dermal="" fibroblasts="" through="" the="" secretion="" of="" il-1α="" and="" il-6,="" thereby="" disrupting="" the="" ecm="" [33].="" therefore,="" this="" study="" suggested="" that="" cps="" significantly="" increased="" the="" activity="" of="" skin="" antioxidant="" enzymes="" and="" inhibited="" inflammatory="" responses,="" which="" might="" be="" important="" in="" delaying="" skin="" aging="" in="">

3.4. Ruokavalion CP:iden vaikutusmekanismi ihon ikääntymisen lievittämisessä

3.4.1.RNA-Seq-tietojen analyysi ja validointi

Analysis techniques, such as PCA, HCA, gene GOenrichment, and KEGG pathway enrichment were used to analyze the transcriptome data. Based on the PCA analysis (Figure 4A) and hierarchical clustering analysis (heat map)of 4303 differential genes with average channel strength greater than 100, the relative expression levels of total DEGs between the two treatment groups are shown to provide an overview of the changes in gene expression(Figure 4B). The M group and the HCP group were significantly separated, and the expression patterns of most DEGs in the M and HCP groups were opposite, indicating that there were significant differences between the mouse skin after HCP treatment and the M group (Figure 4A,B). Pairwise comparisons showed that after feeding HCPs,4303 genes were significantly expressed in the mice skin, including 1790 upregulated genes and 2513 downregulated genes(Foldchange>2,p<0.05)(figure 4c).among="" the="" sixgenes="" associated="" with="" skin="" aging="" quantified="" by="" qrt-pcr,="" five="" genes="" (including="" fos,="" jun,="" cxcll,and="" egr1)were="" downregulated,="" and="" one="" gene="" was="" upregulated="" (figure="" 4d),="" which="" was="" consistent="" with="" the="" overall="" trend="" of="" transcriptomic="" data.="" the="" rna="" expression="" levels="" of="" fos,="" jun,="" and="" cxcll="" were="" significantly="" upregulated="" in="" damaged="" skin="" compared="" to="" that="" in="" intact="" skin="" [34],="" and="" inhibition="" of="" egr1="" expression="" alleviated="" skin="" inflammation="" [35].="" these="" results="" reflected="" the="" reliability="" of="" transcriptome="" sequencing="" data,="" and="" oral="" cps="" effectively="" alleviated="" skin="">

GO-rikastusanalyysi ja KEGG-tietokannan rikastusanalyysi tarjosivat tukea DEG:iden biologisten toimintojen lisätutkimukselle. GO-analyysi osoitti, että DEG:t rikastuivat merkittävästi biologisissa prosesseissa, kuten DNA:n replikaatiossa, hemopoieesin säätelyssä, hydrolaasiaktiivisuuden säätelyssä ja sytokiinituotannossa; solukomponenteissa, jotka sisälsivät lyyttisen vakuolin ja lysosomin, kollageenia sisältävät ja muut samankaltaiset geenit rikastuivat merkittävästi; molekyylitoiminnan suhteen reseptori-ligandiaktiivisuus, sytokiiniaktiivisuus ja muut samankaltaiset geenit rikastuivat merkittävästi (kuvio 5). DEG:iden merkittävästi muuttamien 20 ensimmäisen signaalireitin KEGG-rikastusanalyysi on esitetty kuvassa 5. Sytokiini-reseptori-vuorovaikutus, lysosomi, neuroaktiivinen ligandi-reseptori-vuorovaikutus, solusykli, systeeminen lupus erythematosus ja TGF-reitti (p<05) were="" closely="" related="" to="" aging,="" especially="" cytokine-receptor="" interactions,="" lysosomes,="" and="" tgf-βsignaling.="" an="" important="" feature="" of="" cellular="" senescence="" is="" the="" accumulation="" of="" damaged="" or-ganelles="" and="" protein="" aggregates.="" lysosomes="" play="" an="" important="" role="" in="" degrading="" damaged="" organelles="" and="" protein="" aggregates="" in="" senescent="" cells="" [36].="" cytokine-receptor="" interaction="" is="" the="" main="" pathway="" of="" enrichment="" in="" the="" skin="" after="" being="" affected="" by="" various="" factors="" such="" as="" inflammation="" [37],="" sulfur="" mustard="" exposure="" [38],="" and="" terahertz="" pulse="" [39].="" cytokines,="" as="" small="" molecular="" proteins="" synthesized="" and="" secreted="" by="" various="" tissue="" cells,="" maintain="" skin="" homeostasis="" by="" controlling="" the="" balance="" between="" keratinocyte="" proliferation,="" diferentiation,="" and="" apoptosis="" through="" complex="" interactions="" with="" growth="" factors[40].="" the="" tgf-β="" signaling="" pathway="" is="" also="" important="" for="" regulating="" skin="" aging[14].="" gene="" functional="" enrichment="" anal-ysis="" showed="" that="" tgf-β="" was="" highly="" expressed="" during="" cytokine-receptor="" interaction="" and="" in="" the="" tgf-β="" signaling="" pathway.="" tgf-β="" is="" a="" major="" pro-fibrotic="" cytokine="" that="" regulates="" cell="" differentiation="" and="" proliferation="" while="" inducing="" extracellular="" matrix="" protein="" synthesis="" [41].="" therefore,="" we="" verified="" the="" tgf-β="" signaling="" pathway="" and="" some="">

3.4.2. CP:iden vaikutusmekanismin todentaminen ihon ikääntymisen lievittämisessä

TGF-signalointireitin ja sytokiini-reseptorivuorovaikutuksen roolin vahvistamiseksi ihon ikääntymisen lievittämisessä oraalisilla CP:illä suoritettiin WB-analyysi TGF- ja transkriptiotekijän Smad2/3:n todentamiseksi TGF-signalointireitillä sekä avainasemassa. transkriptiotekijä AP-1 (c-Fos ja c-Jun), joka säätelee sytokiinejä. MMP-1, MMP-3, tyypin I pro-kollageenin ja IL-1 pitoisuudet määritettiin ELISA:lla. WB-analyysin tulokset osoittivat, että TGF-, Smad2:n ja Smad3:n ilmentyminen ryhmässä M oli merkittävästi alhaisempi kuin ryhmässä N(p<0.05). the="" expression="" levels="" of="" tgf-β="" and="" smad3="" were="" significantly="" higher="" in="" mice="" after="" the="" oral="" administration="" of="" cps="" compared="" to="" their="" levels="" in="" group="" m="" mice;="" additionally,="" smad2="" also="" increased=""><0.05), except="" for="" in="" the="" lcps="" in="" a="" dose-dependent="" manner(figure="" 6).="" on="" the="" contrary,="" the="" expression="" of="" c-fos="" and="" c-jun="" in="" the="" mgroup="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" n="" group.="" the="" expression="" of="" c-fos="" and="" c-jun="" in="" the="" cp="" group="" was="" significantly="" lower="" than="" that="" in="" the="" m="" group,="" except="" for="" the="" expression="" of="" c-jun="" in="" the="" lcp="" group=""><0.05), and="" the="" change="" was="" dose-dependent.="" these="" results="" indicated="" that="" the="" tgf-β="" signaling="" pathway="" was="" activated="" and="" ap-1="" was="" inhibited="" after="" feeding="">

AP-1-proteiini on Jun- ja Fos-perheen proteiinien dimeerinen kompleksi ja tärkeä ihotulehduksen ja sytokiinien ilmentymisen säätelijä. Yleensä c-Junista ja c-Fosista koostuvalla kompleksilla on suurin transkriptioaktiivisuus ihossa [41, A42]. Ikääntyvissä ihosoluissa tuotettu ROS aktivoi ensin AP-1-proteiinin ja säätelee sitten alavirran sytokiineja (kuten IL-1), MMP:itä ja TGF-signalointireittiä transkription ja translaation kautta, mikä helpottaa ihon ikääntymistä[43 ,44]. TGF-/Smad-signalointireaktio on klassinen kollageenisynteesireitti, ja Smad-transkriptiotekijä on tämän signaalinvälitysreitin ytimessä. TGF- laukaisee alavirran Smad2:n ja Smad3:n fosforylaation ja aktivoitumisen sitoutumalla reseptoriin, mikä lisää COLI:n synteesiä [14].

Lisäksi ELISA-tulokset osoittivat, että MP{0}},MMP-3 ja IL-1a:n pitoisuus M-ryhmän ihossa oli merkittävästi korkeampi kuin N-ryhmän. Typel pro-kollageenin pitoisuus oli merkittävästi pienempi (s<0.05). however,="" the="" contents="" of="" mmp-1,mmp-3,and="" il-1α(figure="" 3d)in="" the="" skin="" after="" oral="" administration="" of="" cps="" were="" significantly="" lower="" than="" those="" in="" the="" m="" group=""><0.05); type="" i="" pro-collagen="" increased="" significantly,="" and="" all="" the="" changes="" were="" dose-dependent="" with="" cps="" (figure="" 7).="" mps="" are="" involved="" in="" the="" decomposition="" of="" skin="" collagen,="" il-1o="" shows="" the="" level="" of="" inflammation="" of="" the="" skin,="" and="" type="" i="" pro-collagen="" reflects="" the="" synthesis="" of="" skin="" collagen.="" accumulating="" evidence="" suggests="" that="" the="" role="" of="" the="" jun/ap-1="" protein="" pathway="" has="" also="" been="" proposed="" to="" regulate="" skin="" inflammation="" [40].="" the="" elisa="" results="" showed="" that="" the="" combined="" treatment="" of="" uv="" and="" d-galactose="" caused="" skin="" collagen="" degradation,="" decreased="" collagen="" synthesis,="" and="" caused="" skin="" inflammation,="" leading="" to="" skin="" aging.="" however,="" these="" changes="" were="" reversed="" after="" the="" oral="" administration="" of="">

Yllä olevien reittien lisäksi tässä tutkimuksessa CP-hoidon jälkeen säädellyt geenit rikastuivat merkittävästi lysosomireitillä, mikä osoittaa, että CP-hoito aktivoi lysosomin ihossa (kuva 5). Aiemmat tutkimukset osoittavat, että aktivoidut lysosomit puhdistavat aggregaatteja ja lisäävät vanhenevien hermoston kantasolujen aktivaatiota ikääntymisen aikana [45]. Näiden lisäksi lysosomin toiminnan lisääntyminen voi vähentää solunsisäisen ROS:n pitoisuutta solujen lepotilan estämiseksi. Samoin mikä tahansa lysosomin toiminnan heikkeneminen voi lisätä solunsisäistä ROS-pitoisuutta, joka lopulta edistää solujen lepotilaa [46]Vaikka emme ole systemaattisesti vahvistaneet sitä tässä artikkelissa, nämä tulokset ja aiemmat raportit viittaavat siihen, että lysosomaalisen toiminnan aktivointi voi olla tärkein tapa CP:t lievittämään ihon ikääntymistä, ja pyrimme jatkossakin varmistamaan sen.

Siksi tämä tutkimus osoitti, että ravinnon CP:t voivat lievittää UV- ja D-galaktoosin aiheuttamaa ihon ikääntymistä annosriippuvaisella tavalla. CP:t lievittävät ihon ikääntymistä alentamalla ihon hapettumista, estämällä tärkeiden transkriptiotekijöiden AP-1 (c-Jun ja c-Fos) ilmentymistä, aktivoimalla TGF-/Smad-signalointireittiä kollageenisynteesin edistämiseksi, estämällä MMP-1 ja MMP-3 (jotka estävät kollageenin hajoamista) ja estävät ihon tulehdusta ihon ikääntymisen lievittämiseksi (kuva 8). Lisäksi tämän tutkimuksen havainnot viittaavat myös siihen, että aktivoitu lysosomi voi olla CP:ille tärkeä tapa säädellä ihon ikääntymistä, mikä ansaitsee erityistä huomiota.

4. Johtopäätökset

Yhteenvetona tämä tutkimus vahvisti, että kananluun kollageenipeptidien ravintolisä voisi merkittävästi lieventää ultraviolettisäteilyn ja D-galaktoosin aiheuttamaa ihon ikääntymistä useiden eri reittien kautta, joihin kuuluu kollageenisynteesin edistäminen, kollageenin hajoamisen estäminen, ihon antioksidanttitason parantaminen, ja tulehduksen estäminen; helpotus oli annoksesta riippuvaista CP:llä. Yksityiskohtainen tutkimus osoitti, että CP:t vähentävät ensin ihon hapettumista, estävät tärkeimmän transkriptiotekijän AP-1 (c-Jun ja c-Fos) ilmentymisen ja aktivoivat sitten TGF-/Smad-signalointireitin edistääkseen kollageenisynteesiä, estävät MMP-1- ja MMP-3-ilmentymistä kollageenin hajoamisen estämiseksi ja ihon tulehdusta ihon ikääntymisen lievittämiseksi hiirillä. Lisäksi lysosomien aktivointi voi olla myös pääasiallinen CP-reitti lievittää ihon ikääntymistä, mikä on seurantatutkimuksen ja todentamisen arvoista. Nämä tulokset tarjoavat teoreettisen perustan kollageenipeptidien käyttöönotolle ihon ikääntymisen lievittämiseksi ja laajentavat eläinperäisten sivutuotteiden kokonaisvaltaista hyödyntämistä terveysvaikutteisissa elintarvikkeissa.

Tämä artikkeli on poimittu julkaisusta Nutrients 2022, 14, 1622. https://doi.org/10.3390/nu14081622 https://www.mdpi.com/journal/nutrients