Uudet rekombinantti Newcastlen taudin virukseen perustuvat ovo-rokotteet ohittavat äidin immuniteetin tarjotakseen täyden suojan varhaiselta virulentilta haasteelta, osa 1

Abstrakti:

Newcastlen tauti (ND) on yksi taloudellisesti tärkeimmistä siipikarjan taudeista. Huolimatta nykyisten rokotusohjelmien intensiivisistä ponnisteluista tätä tautia esiintyy edelleen maailmanlaajuisesti, mikä aiheuttaa merkittävää kuolleisuutta jopa rokotetuissa parvissa. Tämä on osittain johtunut immuniteetin aukosta kuoriutumisen jälkeisenä aikana, mikä johtuu äidin vasta-aineiden läsnäolosta, jotka vaikuttavat negatiivisesti yleisesti käytettyjen elävien rokotteiden replikaatioon. In ovo -rokotteilla on useita etuja, ja ne tarjoavat mahdollisuuden käsitellä tätä ongelmaa.

Tällä hetkellä ovo-ND-rokotteissa käytetään rekombinanttiherpesvirus kalkkunan (HVT) -vektorirokotteita, jotka ilmentävät Newcastlen tautiviruksen (NDV) antigeenejä. Vaikka näillä rokotteilla on todistetusti tehokkaita, niillä on joitain rajoituksia, kuten viivästynyt immunogeenisyys ja kyvyttömyys antaa toista HVT-rokotetta kuoriutumisen jälkeen. Elävien ND-rokotteiden käyttö in ovo -rokotuksiin ei ole tällä hetkellä sovellettavissa, koska ne liittyvät korkeaan alkikuolleisuuteen. Tässä tutkimuksessa yhdistelmä-NDV-vektorilla varustetut kokeelliset rokotteet, jotka sisälsivät lintujen interleukiini 4:n (IL4R) ja niiden rungon antisense-sekvenssin, annettiin in ovo eri annoksilla 18-vuorokauden ikäisiin kaupallisiin muniin, joilla oli korkeat äidin vasta-ainetiitterit. Kuoriutuneet linnut altistettiin virulentille NDV:lle 2 viikon iässä. Kuoriutumisen jälkeinen rokotteen leviäminen, altistuksen jälkeinen eloonjääminen, altistusviruksen leviäminen ja humoraaliset immuunivasteet arvioitiin useissa aikapisteissä. Rekombinantti-NDV:llä (rNDV) rokotetuilla linnuilla oli merkittävästi vähentynyt kuoriutumisen jälkeinen kuolleisuus verrattuna villityypin LaSota-rokotteeseen.

Kaikki rNDV-rokotteet pystyivät tunkeutumaan äidin immuniteetin ja indusoimaan voimakkaan varhaisen humoraalisen immuunivasteen. Lisäksi rNDV-rokotteet suojasivat kliiniseltä taudilta ja vähensivät merkittävästi viruksen leviämistä varhaisen virulentin NDV-altistuksen jälkeen kaksi viikkoa kuoriutumisen jälkeen. Altistuksen jälkeiset hemagglutinaation eston vasta-ainetiitterit rokotetuissa ryhmissä pysyivät vertailukelpoisina ennen altistusta saatujen tiitterien kanssa, mikä viittaa tutkittujen rokotteiden kykyyn estää altistusviruksen tehokas replikaatio. Kuoriutumisen jälkeinen eloonjääminen rNDV-IL4R-rokotteilla rokotuksen jälkeen oli annoksesta riippuvaista, ja eloonjäämisaika lisääntyi annoksen pienentyessä. Tämä parantunut eloonjäämis- ja annosriippuvuustiedot viittaavat siihen, että uudet heikennetyt in ovo rNDV-pohjaiset rokotteet, jotka voivat tunkeutua äidin immuniteetin läpi ja saada aikaan vahvan immuunivasteen jo 14 päivää kuoriutumisen jälkeen, mikä johtaa korkeaan tai täydelliseen suojaukseen virulentilta altistukselta. lupauksen myötävaikuttajana Newcastlen taudin torjuntaan.

Ihmisten rokotusten lisäksi ihmiset voivat ottaa myös ruokaa ja lisäravinteita. Cistanche sisältää erilaisia ​​kemiallisia aineita, kuten polysakkarideja, steroideja, alkaloideja, flavonoideja jne. Näillä aineilla on merkittävä rooli immuunijärjestelmän säätelyssä. Niistä polysakkaridit voivat edistää immuunisolujen aktivoitumista ja lisääntymistä ja lisätä kehon vastustuskykyä; steroidit voivat säädellä immuunisolujen toimintaa ja tehostaa immuunivastetta; alkaloidit ja flavonoidit voivat vastustaa hapettumista, anti-inflammatorisia, antibakteerisia ja edelleen parantaa immuniteettia. Siksi Cistanchella on merkittävä immuunijärjestelmää säätelevä vaikutus, ja sitä voidaan käyttää terveysruokana ja lääkkeenä immuniteetin parantamiseen.

Napsauta cistanchen terveyshyötyjä

1. Esittely

Newcastlen tauti (ND), tuhoisa siipikarjan tauti, joka voi saavuttaa 100 prosentin kuolleisuuden naiiveissa linnuissa, johtuu Newcastlen tautiviruksen (NDV) virulenteista kannat [1]. Tämä viruslaji, joka nimettiin äskettäin uudelleen Avian orthoavulavirus 1:ksi, kuuluu Paramyxoviridae-heimoon [2,3]. Newcastlen tautiviruksilla on yksijuosteinen, segmentoimaton negatiivisensensen RNA-genomi, joka koodaa vähintään kuutta rakenneproteiinia (30 - nukleoproteiini [NP] - fosfoproteiini [P] - matriisiproteiini [M] - fuusioproteiini [F] - hemagglutiniini-neuraminidaasi [HN] ja suuri RNA-polymeraasi [L]-50) ja sisältää yhden kolmesta genomikoosta (15 186, 15 192 ja 15 198 nukleotidia) [4,5]. Newcastlen tautia pidetään kolmanneksi tärkeimpänä siipikarjan tautina maailmanlaajuisesti [6], ja se on edelleen endeeminen monissa Aasian, Afrikan ja Amerikan maissa [7].

ND:n valvontaan kuuluu tiukka bioturvallisuus, jotta estetään virulenttien NDV:n (vNDV) kulkeutuminen siipikarjatiloihin [8,9] ja rokotteiden oikea antaminen [10]. Useat maailmanlaajuisesti esiintyvät ND-epidemiat [11] viittaavat kuitenkin siihen, että nykyiset rokotteet ja rokotusmenetelmät eivät ole täysin tehokkaita. Perinteisten elävien ja inaktivoitujen rokotteiden lisäksi viimeisten kahden vuosikymmenen aikana on tutkittu useita ND-rokotteen konsepteja, mukaan lukien muun muassa vektoroidut, antigeeni-vasta-ainekompleksi-, viruksen kaltaiset hiukkaset ja maksun kaltaiset reseptoriligandirokotteet [1, 8,9]. Useiden linturokotteiden, jotka on suunniteltu yhteisilmentämään immunostimulatorisia sytokiineja, on myös ehdotettu parantavan suojaavaa immuniteettia [12]. Toinen lähestymistapa, jota on tutkittu, on antigeenisesti yhteensopivien rokotteiden käyttö. Vaikka kaikkia NDV:itä pidetään yhden serotyypin jäseninä [3,13], kantojen välillä on antigeenisiä vaihteluita [14]. Aiemmat tutkimukset eri-ikäisillä kanoilla ovat osoittaneet, että kanat, jotka on rokotettu kantoilla, jotka olivat antigeenisesti yhteensopivia altistusvirukseen, erittivät merkittävästi vähemmän altistusta vNDV:tä kuin heterologisilla rokotteilla rokotettujen kanojen erittämä määrä [15–17]. On huomionarvoista, että passiivisesti siirretyt äidin anti-NDV-vasta-aineet, vaikka ne suojaavat kanoja ratkaisevien alkuviikkojen aikana, häiritsevät isännän immuniteetin kehittymistä rokotuksen jälkeen [18].

In ovo -rokotus on lähestymistapa, jolla on useita etuja – esimerkiksi merkittävä kustannusten aleneminen, standardointi, massarokotteen käyttö, automaattinen rokotus hautomossa, rokotteen tasainen annostelu jokaisessa munassa ja linnuille ei stressiä [19–21] – ja se on houkutteleva immunisointimenetelmä siipikarjateollisuudelle [22]. 80–90 prosenttia Yhdysvalloissa kasvatetuista broilereista on tällä hetkellä ovo-rokotettu kaksi tai kolme päivää ennen kuoriutumista [23,24], ja prosessin automatisointi mahdollistaa jopa 70,000 munan rokotuksen. rokotetaan tunnissa [23].

Maailmanlaajuisesti tätä rokotteen antomenetelmää käytetään 26:ssa maailman 30 johtavasta siipikarjantuotantomaasta [23]. Muutamia in-ovo-rokotteita ND:tä vastaan ​​on tällä hetkellä saatavilla, mutta ne kaikki tuotetaan käyttämällä ei-NDV-vektoreita. Linturokkovirus (FPV) -vektoripohjaisten rokotteiden, jotka ilmentävät NDV:n F- ja HN-proteiineja in ovo, on osoitettu suojaavan siipikarjaa vNDV-altistukselta [25,26].

Rekombinanttisia FPV-ND-rokotteita ei kuitenkaan käytetä laajalti, koska immuunihäiriöt ovat aiheuttaneet aikaisemmat FPV-rokotteet tai altistukset (FPV on yleisesti läsnä ympäristössä) ja massamenetelmien käyttöönoton optimoinnin puutteesta [9]. Eniten käytetty vektori rekombinantti-ND-tuotannossa in ovo -rokotteen tuotannossa on Meleagrid alfaherpesvirus 1, joka tunnetaan yleisesti kalkkunan herpesviruksena (HVT) tai serotyypin 3 Marekin taudin virus [12,23]. Pelkästään Yhdysvalloissa valmistettiin 8,2 miljardia annosta rekombinantti-HVT- (rHVT)-ND-rokotteita vuonna 2018 verrattuna 3,6 miljardiin tavanomaiseen ND-rokotteeseen [27].

In ovo -käytön edun lisäksi NDV-proteiineja ilmentävät rHVT-rokotteet saavat aikaan vahvan ja pitkäaikaisen immuniteetin yhden sovelluksen jälkeen [28]. Lisäksi heihin vaikuttaa ohimenevästi anti-NDV-vasta-aineiden läsnäolo äidiltä [8]. RHVT-ND-rokotteilla on kuitenkin joitain rajoituksia, kuten viivästynyt immuniteetti, ja aikaisempi HVT-rokotus näyttää olevan vastustuskykyinen HVT-tehosterokotteiden käytölle samoissa linnuissa [9,29]. HV-rokotteet liittyvät soluihin, ja ne on säilytettävä ja kuljetettava nestetypessä, mikä rajoittaa niiden käyttöä monissa maissa.

Uusien in ovo -rokotteiden mahdollisuus kasvaa [23]. Eri vektoreita on tutkittu in-ovo-antoreitille, ja lupaavia tuloksia on raportoitu replikoitumattomilla ihmisen adenovirus- [30] ja alfavirusvektorirokotteilla [31]. Vaikka rutiininomaisessa kaupallisessa käytössä ei ole edistytty, on myös pyritty kehittämään uusia in ovo ei-HVT NDV-vektorirokotteita [32–35]. Elävien ND-rokotteiden käyttö in ovo on haaste. Vaikka elävät ND-rokotteet, kuten LaSota, B1, Clone 30 ja Ulster, muutamia mainitakseni, antavat vahvan immuunivasteen ja niitä käytetään yleisesti jopa yhden päivän ikäisten kanojen rokottamiseen, mutta niihin liittyy korkea alkikuolleisuus, kun annettiin 18 päivän alkiovaltion kohdalla. In-ovo -käytön jälkeen on raportoitu jopa 100 prosentin kuolleisuutta villityypin matalavirulenttisia viruksia käytettäessä ja 80 prosentissa geneettisesti heikennettyjä eläviä viruksia, eikä tähän rokotteen antotapaan käytetä tällä hetkellä eläviä ND-rokotteita [36, 37]. .

Uusi rekombinantti-NDV (rNDV) -vektorilla varustettu kokeellinen rokote, joka sisältää antisense lintujen interleukiini 4 -insertin (IL4), nimeltään ZJ1*l-IL4R, osoitettiin äskettäin lupaavaksi in ovo -rokoteehdokkaaksi spesifisestä patogeenivapaassa (SPF) tehdyn arvioinnin jälkeen. ) alkioituneet kananmunat (ECE) [38]. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli edelleen arvioida tämän rekombinantti-NDV-vektorirokotteen ja sen yhdistelmärungon (heikennetty pilkkoutumiskohta villityypin viruksesta) ja rekombinantti LaSota-IL4R -viruksen soveltuvuutta 18-päivän ikäisten in ovo -rokotuksiin. kaupalliset munat, joilla on korkeat äidin vasta-ainetiitterit. Kaupallisesti saatavilla olevat rokotteet LaSota ja rHVT-ND sisällytettiin kontrolleina. Lisäksi tämän tutkimuksen tavoitteena oli arvioida tutkittujen rokotteiden suojaava teho vNDV:n varhaisia ​​altistuksia vastaan. Tässä osoitetaan näiden rekombinanttirokotteiden kyky tehokkaasti voittaa äidin immuniteetti, jopa pieninä annoksina, ja indusoida vahva immuunivaste. Kokeelliset rNDV-rokotteet osoittivat 100-prosenttisen suojan vNDV-altistuksen jälkeen.

2. Materiaalit ja metodit

2.1. Virukset

Virulentti hanhi/China/ZJ1/2000 (ZJ1, GenBank-talletusnumero AF431744) NDV, joka on alagenotyypin VII.1.1 (entinen VIId) jäsen, käytettiin altistusviruksena tässä tutkimuksessa. Yhdistelmä-ZJ1-virusta (ZJ1:n heikennetty versio), jolla on alhainen virulentti pilkkoutumiskohta (ZJ1*L), joka on aiemmin luotu laboratoriossamme käänteisen genetiikan avulla [39], käytettiin selkärankana yhdistelmä-ZJ1*L-rokotteiden luomisessa ja rokotteena. virus. Alhaisen virulentin LaSota (LS) -rokotekantaa käytettiin rokotekontrollina ja rungona rekombinantti-LS-IL4R-rokotteen tuottamiseksi. Kaikki virukset saatiin Southeast Poultry Research Laboratoryn (SEPRL) arkistosta Yhdysvaltain kansallisesta siipikarjatutkimuskeskuksesta (USNPRC), US Department of Agriculturesta (USDA). Lisäksi kaupallisesti saatavaa rHVT-ND-rokotetta (fuusiogeeni-insertti) käytettiin myös kontrollina.

Tässä tutkimuksessa käytetyt kokeelliset rekombinantti-NDV-rokotteet luotiin käyttämällä käänteistä genetiikkaa, kuten aiemmin on kuvattu [38,39]. Lyhyesti sanottuna linnun IL4:n koodaava sekvenssi kloonattiin ZJ1*L- ja LS-rungoille käänteisessä orientaatiossa (IL4R) P- ja M-geenien välillä, jolloin muodostui kaksi heikennettyä elävää rekombinanttivirusta – nimittäin ZJ1*L-IL4R ja LS- IL4R (GenBank-talletusnumerot MM680659 ja MM680665, vastaavasti). Rekombinanttivirukset pelastettiin käyttämällä modifioitua vacciniavirus Ankaraa, joka ekspressoi T7-polymeraasia (MVA/T7), aiemmin julkaistujen protokollien mukaisesti [38–41]. Kaavamainen esitys rakenteista on esitetty lisäkuvassa S1A. Tämän työn tarkoitusta varten termi "DV-rokotteet", jota käytetään jäljempänä, viittaa ZJ1*L:ään, ZJ1*L-IL4R:ään ja LS-IL4R:ään.

Kaikkien NDV-tautien työkannat lisääntyivät {{0}} 11-päivän ikäisiksi SPF embryonated kananmuniksi (ECE) [42]. Tässä tutkimuksessa munien rokottamiseen käytetyt viruskannat laimennettiin aivosydäninfuusio- (BHI) -liemellä (BD Biosciences, MD, USA), joka sisälsi 200 µg/ml gentamysiiniä, 2{{22} }00 U/ml penisilliiniä ja 4 µg/ml amfoterisiini B:tä kolmeen eri kohdetiitteriin, 105,5/0,1 ml, 104,5/0,1 ml ja 103,5/0,1 ml alkion tarttuva annos (EID50), paitsi LS. , joka laimennettiin 105,5/0,1 ml:ksi ja 104,5/0,1 ml:ksi EID50. Elävien rokotteiden laimennettujen käyttövarastojen tiitterit varmistettiin takaisintitrauksilla 9- vuorokauden ikäisissä SPF ECE:issä 11-päivän ikäisissä SPF ECE:issä noudattaen yllä mainittuja vakiomenettelyjä. rHVT-ND-rokote laimennettiin suoraan käyttämällä rHVT-rokotteiden sakkaroosifosfaattiglutamaattialbumiinilaimennusainetta, joka on kuvattu USDA:n Center for Veterinary Biologics Test Protocolissa [43].

2.2. Munat

Kaksisataakuusikymmentäkaksi kaupallista (ei-SPF) munaa Hy-Line Rockside W-36 -rotuparvesta (Mansfield, GA, USA) lahjoitettiin ystävällisesti tähän kokeeseen. Kerrosparvi oli rutiininomaisesti rokotettu LaSota-rokotteella. Parven immuniteetti on testattu säännöllisesti ELISA:lla, ja vaikka nämä tulokset eivät ole suoraan muunnettavissa hemagglutinaation eston (HI) tiittereiksi, vanhempainparven keskimääräiset anti-NDV-vasta-ainetasot olivat erittäin korkeat (eli 15 534 ja positiivisten tulosten raja. näytteet 1159). SPF ECE:n lähde (42 munaa) oli SEPRL SPF White Leghorn -parvi. Kaikkia munia inkuboitiin 37,5 ◦C lämpötilassa ja 55–60 prosentin suhteellisessa kosteudessa 18 päivää.

2.3. Rokotus

Kaupalliset (n {{{10}}}}) ja SPF (n=42) munat, 18 päivän alkiot (DOE) jaettiin 14 ryhmään, joissa kussakin oli 21 munaa. ryhmä (paitsi BHI- ja Hatch-kontrolliryhmät, joissa kummassakin oli 26 munaa). Käyttäen 1 ml:n, 24 G × 1/2 ruiskua, jokainen muna siirrostettiin allantoisonteloon 0,1 ml:lla laimennettua rokotetta tai BHI:tä, paitsi Hatch-kontrolliryhmää, jossa munia ei käsitelty kaikki. Inokuloituja munia oli kolmetoista ryhmää, jotka jaettiin seitsemään koeryhmään ja kuuteen kontrolliryhmään. Seitsemän koeryhmää olivat seuraavat: ZJ1*L-IL4R 104.5, ZJ1*L-IL4R 105.5, LS-IL4R 103.5, LS-IL4R 104.5, LS-IL4R 105.5, ZJ1*L 104.5, ZJ1*L 104.5 ja Z1J1*5. vastaava siirrosteen EID50-annos per 0,1 ml, kuten ryhmän nimessä on ilmoitettu. Lisäksi luotiin kuusi kontrolliryhmää. Kaksi kaupallisten munien kontrolliryhmää siirrostettiin edellä kuvatulla tavalla BHI:llä ja vastaavasti rHVT-ND:llä. Kaksi kaupallisten munien kontrolliryhmää ympättiin edellä kuvatulla tavalla LS 104,5- ja LS 105,5 EID50 -annoksella ymppiä per 0,1 ml. Kaksi SPF-munien kontrolliryhmää siirrostettiin ZJ1*L 103.5:llä ja ZJ1*L-IL4R 103.5:llä. Kaavamainen esitys tutkimussuunnitelmasta on lisäkuvassa S1B, C.

Inokuloinnin jälkeen munat sijoitettiin Turbofan Hova-Bator Incubatorsiin (GQF Manufacturing Company Inc., GA, USA), jotka asetettiin sen jälkeen isolaattoreihin eläinten bioturvallisuustason 2 (ABSL-2) laitokseen. Inkubaattorit säädettiin termostaateilla niin, että lämpötila pysyi vakiona 37,5 ◦C ja suhteellinen kosteus välillä 55-60 prosenttia.

2.4. Kuoriutuminen, näytteenotto, kuolleisuus

Kuoriutumisen jälkeen 21 DOE:ssa poikaset sijoitettiin alipaineeristimiin (ABSL-2) ja niille tarjottiin ruokaa ja vettä vapaasti. Viisi ei-SPF-kanaa sekä Hatch-kontrolli- että BHI-ryhmästä tapettiin ja niistä otettiin verta välittömästi kuoriutumisen jälkeen äidin anti-NDV HI -vasta-aineiden perustiitterin määrittämiseksi. Kaikki kanat punnittiin 1, 8 ja 13 päivää kuoriutumisen jälkeen (DPH). Suunielun ja kloakaan vanupuikkoja kerättiin BHI:ssä jokaiselta linnulta 2 ja 4 DPH:ssa. Kliiniset merkit ja kuolleisuus kirjattiin kahdesti päivässä koko kuoriutumisen jälkeisen ajanjakson ajan, ja verinäytteet kerättiin klo 13 DPH.

2.5. Haaste

Kaksitoista lintua kustakin ryhmästä (paitsi LS 1{{10}}5.5, jossa kaikki linnut kuolivat 6 DPH:lla) siirrettiin ABSL-3E-laitokseen klo 13 DPH. Linnut asetettiin alipaineeristyksiin ja niiden annettiin sopeutua 24 tuntia ennen altistusta. Kaikki linnut altistettiin 14 DPH:lla virulentilla ZJ1 NDV:llä pitoisuudessa 106 EID50/0,1 ml okulo-nasaalista reittiä. Lintuja tarkkailtiin päivittäin kliinisten oireiden ja kuolleisuuden varalta. Suunielun ja kloaakin vanupuikkoja kerättiin jokaisesta linnusta 2 ja 4 päivää altistuksen jälkeen (DPC). Kaikki eloon jääneet linnut punnittiin ja niistä otettiin verta 14 DPC:ssä ja ne lopetettiin kohdunkaulan dislokaatiolla nukutuksen jälkeen 0,2 ml:lla ketamiini/ksylatsiiniliuosta (66 mg/ml ketamiinia ja 6,6 mg/ml ksylatsiinia), joka annettiin lihakseen {{22}gauge-neulalla.

2.6. Reaaliaikainen RT-PCR

RNA uutettiin kaikista vanupuikkoväliaineista käyttämällä MagMAX 96 AI/ND -viruksen RNA-eristyssarjaa (Ambion, Inc. Austin, TX, USA) KingFisher-magneettipartikkeliprosessorilla (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) noudattaen valmistajan ohjeita. inhibiittorinpoistomodifikaatiolla, jonka ovat kuvanneet Das et al. [44]. Kvantitatiivinen reaaliaikainen RT-PCR (rRT-PCR) NDV:n havaitsemiseksi, joka kohdistui matriisi (M) geeniin, suoritettiin käyttämällä AgPath-ID yksivaiheista RT-PCR Kitiä (Ambion) ja ABI 750{{31 }} Fast Real-Time PCR-järjestelmä (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA), jossa hyödynnetään alukkeita ja koetinta, jotka ovat aiemmin kuvanneet Wise et ai. [45]. Määritysolosuhteet olivat käänteistranskriptio 10 minuutin ajan 45 ◦C:ssa; alkudenaturointi 10 min 95 ◦C:ssa; 40 denaturaatiosykliä 10 sekunnin ajan 94 ◦C:ssa, alukkeen pariutus 30 sekuntia 56 ◦C:ssa ja alukkeen pidennys 10 sekuntia 72 ◦C:ssa. Jokaisen näytteen 25 µl:n kokonaisreaktiotilavuus koostui molekyylilaatuisesta vedestä – 2,5 µl; 2X puskuri - 12,5 ui; eteenpäin suunnattu aluke - 0,25 ui (20 pmol/ul); käänteinen aluke - 0,25 ui (20 pmol/ul); koetin - 0,50 ui (6 pmol/ul); 25X entsyymisekoitus - 1,0 ui; ja RNA-templaatti - 8,0 ui. Viruksen kvantifiointia varten kullekin virukselle määritettiin standardikäyrä, jossa RNA uutettiin samasta titratusta viruskannasta, jota käytettiin munien (kuoriutumisen jälkeen kerättyjen vanupuikkonäytteiden) tai altistusviruksen (siirtymän jälkeen kerättyjen vanupuikkonäytteiden) ymppäämiseen. -haaste).

Tulokset ilmoitetaan EID50/ml. Määritysten laskettu alempi havaitsemisraja oli välillä 101,7 - 101,9 EID50/ml. On tärkeää huomata, että rRTPCR havaitsee virusnukleiinihapot ja että arvioidut arvot eivät välttämättä edusta tarttuvia viruksia. EID50/ml-arvoilla ei pyritä ilmaisemaan tarttuvuutta, ja niitä käytetään tarjoamaan keinoja viruksen leviämisen suhteelliselle vertailulle ryhmien välillä. Huolimatta inhibiittorinpoistonukleiinihappojen uuttoprotokollan käytöstä RNA-templaatin suuri tilavuus on saattanut vaikuttaa laskelmiin standardikäyrästä. Huomaa, että sama määrä RNA-templaattia käytettiin kaikissa reaktioissa, ja mahdolliset jäännösestäjät olisivat vaikuttaneet kaikkiin tuloksiin samalla tavalla.

2.7. HI Assay

Hemagglutinaation eston (HI) määritystä käytettiin arvioimaan vasta-aineiden läsnäolo ja tiitterit seeruminäytteissä, jotka kerättiin koko kokeen ajan. Noudattaen standardimenettelyjä [46] kunkin rokotteen rungona käytettyä virusta käytettiin antigeeninä jokaiselle seerumiryhmälle (ZJ1*L kaikille ZJ1-ryhmille ja LS kaikille LS-ryhmille). Altistuksen jälkeen kerätyille seeruminäytteille virulenttia ZJ1-virusta käytettiin antigeeninä HI-määrityksessä. Tiitterit laskettiin viimeisen HI-positiivisen seerumilaimenoksen käänteislukuna, ja näytteet, joiden HI-tiitterit olivat log2 3 ja alle, katsottiin negatiivisiksi.

2.8. Tilastolliset analyysit

Prism v.7.{7}}3 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA) -ohjelmistoa käytettiin tietojen analysointiin, ja poikkeamat tunnistettiin ROUT-testillä. D'Agostino–Pearson-normaalisuustesti suoritettiin sen arvioimiseksi, olivatko kunkin ryhmän arvot peräisin Gaussin jakaumasta. Normaalijakauman perusteella ei-parametrista Kruskal–Wallis-testiä Dunnin jälkitestillä käytettiin useisiin ryhmien välisiin vertailuihin. Tilastollisia tarkoituksia varten kaikille vanupuikkonäytteille, joista ei havaittu viruksia, annettiin kunkin viruksen havaitsemisrajan numeerinen arvo, joka oli 1 log. Eloonjäämiskäyrät analysoitiin Log-rank (Mantel-Cox) -testillä. Tilastollinen merkitsevyys asetettiin p-arvoon < 0,05.

3. Tulokset

3.1. Kuoriutuvuus, kuoriutumisen jälkeinen selviytyminen ja ruumiinpainot

Kaikkien kaupallisista munista kuoriutuneiden ryhmien eloonjääminen kuoriutumisen jälkeen on kuvattu eloonjäämiskäyrinä kuviossa 1 (eroteltu kuvissa 1A ja B selvyyden vuoksi ja grafiikan ruuhkautumisen välttämiseksi). Yhdistetty kaavio on saatavilla lisäkuvassa S2. Hatch-kontrolliryhmä (ei rokotettu) otettiin mukaan suunnitteluun sen varmistamiseksi, että ei ollut epänormaalia kuoriutumiskykyä tai kuoriutumisen jälkeistä kuolleisuutta, joka ei liittynyt munien rokottamiseen.

Kuten odotettiin, hyvin alhainen (rHVT-ND) tai ei (Hatch ja BHI) kuoriutumisen jälkeinen kuolleisuus havaittiin kolmessa kontrolliryhmässä. Sitä vastoin LS-verrokkiryhmien eloonjäämisaste oli 57,1 prosenttia ja 0 prosenttia, kun käytettiin 104,5 ja 105,5 annosta, mikä on aiemmin raportoitu tavanomaisten elävien ND-rokotteiden osalta. Kaksi munaa ei kuoriutunut LS-IL4R 105.5 -ryhmässä ja yksi muna ei kuoriutunut LS 104.5 -ryhmässä. Muissa ryhmissä havaittiin vaihtelevaa kuolleisuutta rokotteen ja rokoteannoksen mukaan. ZJ1*L-IL4R 104.5 ja 105.5 ryhmien eloonjäämisaste oli 90,5 prosenttia ja 71,4 prosenttia, ja ZJ1*L 104,5 ja 105,5 ryhmien eloonjääminen oli 80,9 prosenttia ja 76,2 prosenttia, mutta erot olivat vastaavasti (kuva 1A). ei tilastollisesti merkitsevä. Eloonjääminen LS-IL4R 103,5 -ryhmässä oli 95,2 prosenttia. LS-IL4R 104,5- ja 105,5-ryhmissä havaitut eloonjäämisluvut olivat 85,7 prosenttia ja 66,7 prosenttia, vastaavasti (kuvio 1B).

Kokeellisten ZJ1*L-, ZJ1*L-IL4R- ja LS-IL4R-rokoteryhmien sekä Hatch-, BHI- ja rHVT-ND-verrokkiryhmien välillä ei ollut merkittäviä eroja eloonjäämisessä, mutta eloonjäämisprosentti näissä kontrolliryhmissä oli numeerisesti korkeampi. , jolloin havaittiin negatiivinen korrelaatio rokoteannoksen ja kuoriutumisen jälkeisen eloonjäämisen välillä (eloonjääminen lisääntyi rokoteannoksen pienentyessä). LS 1{{10}}5,5 -vertailuryhmässä oli merkittäviä eroja eloonjäämisessä koeryhmiin verrattuna (p-arvot välillä 0.0001 ja 0,02). LS 104.5 -kontrolliryhmällä, vaikka se ei ollut tilastollisesti erilainen, eloonjäämisluvut olivat huomattavasti alhaisemmat verrattuna koeryhmiin, joilla oli sama annos. Kahdella LS-kontrolliryhmällä oli merkittäviä eroja eloonjäämisessä verrattuna Hatch-, BHI- ja rHVT-ND-kontrolliryhmiin (p-arvot välillä 0,0001 - 0,04). Kliinisiä oireita ei havaittu missään ryhmässä kuoriutumisen jälkeen. Ryhissä, joissa esiintyi kuoriutumisen jälkeistä kuolleisuutta, linnut löydettiin kuolleina päivittäisissä tarkastuksissa.

Kaikki linnut punnittiin päivinä 1, 8 ja 13 kuoriutumisen jälkeen (taulukko 1). 1 DPH:lla keskimääräinen ruumiinpaino lintua kohti oli useimmissa ryhmissä 38,5–42,6 grammaa (g). Merkittäviä painoeroja oli vain rHVT-ND ja ZJ1*L-IL4R 104,5 ryhmien välillä toiselta puolelta ja ZJ1*L 104,5 ja kontrollin LS 1{{4{{42} }}}4,5 toisesta (kahden ensimmäisen ryhmän linnut painoivat enemmän kuin kontrolliryhmän linnut) (p-arvot välillä 0.0001 ja 0,017). Klo 8 DPH kahden ZJ1*L-ryhmän ja LS-IL4R 104.5-, LS-IL4R 105.5-ryhmän ja LS-verrokkiryhmän (keskimääräinen paino 50–63 g) ruumiinpaino oli huomattavasti pienempi kuin Hatchista peräisin olevien lintujen paino. BHI- ja rHVT-ND-kontrolliryhmät (keskipaino 77–82 g) (p-arvot välillä 0,0001–0,03). Samoilla ryhmillä, jotka erosivat merkittävästi kontrolleista 8 DPH:n kohdalla (paitsi LS-IL4R 104,5), oli merkittävästi pienempi ruumiinpaino kuin kontrolli Hatch-, BHI- ja rHVT-ND-ryhmillä myös 13 DPH:n kohdalla (p-arvot välillä 0,0001 ja 0,01). Inokuloitujen SPF-kontrolliryhmien linnut eivät sisälly tähän vertailuun, koska SPF-munat (ja niistä kuoriutuneet linnut) ovat perinteisesti pienempiä ja kevyempiä kuin kaupalliset munat.

Kuvio 1. Kanojen eloonjääminen kuoriutumisen jälkeen kaupallisten munien siirrostuksen jälkeen 18 päivän alkiossa kokeellisilla in ovo NDV-rokotteilla. Hy-Line Rockside W-36 -munat siirrostettiin rekombinanttiviruksilla ja LaSotalla. Kolme kontrolliryhmää inokuloitiin BHI- tai rHVT-ND-rokotteella tai niitä ei rokotettu (Hatch-kontrolliryhmä). Lintuja tarkkailtiin 13 päivää kuoriutumisen jälkeen. Eloonjäämiskäyrät on esitetty kahdessa kuvassa: (A) kontrolliryhmät ja ZJ1*L-ryhmät ja (B) kontrolliryhmät ja LS-IL4R-ryhmät. Erilaiset yläindeksikirjaimet osoittavat tilastollisesti merkitseviä eroja ryhmien välillä (p-arvo < 0,05). Ryhmälyhenteet: HATCH—munat ei rokotettu; BHI - BHI:llä rokotetut munat; rHVT-ND — yhdistelmä-HVT-rokotteella rokotetut munat; ZJ1*L — munat, joihin on inokuloitu rekombinantti ZJ1*L-virus, jonka katkaisukohta oli muunnettu matalavirulenssiksi; ZJ1*L-IL4R – munat, joihin on siirrostettu rekombinantti matalavirulentti ZJ1*L ja interleukiini-4-geeni insertoituna käänteisessä suunnassa; LS — munat, joihin on ympätty LaSota-kantaa; LS-IL4R – munat, joihin on inokuloitu yhdistelmä-DNA-tekniikalla valmistettu LaSota-virus, jossa interleukiini-4-geeni on lisätty käänteisessä suunnassa. Kunkin ryhmän munien saama virusannos on esitetty numerona ryhmän nimen jälkeen yksikössä EID50/muna.

Taulukko 1. Kanojen keskimääräiset painot (ja standardipoikkeamat) 1, 8 ja 13 päivää kuoriutumisen jälkeen kaupallisten munien rokotuksen jälkeen 18 päivän alkioiden kokeellisilla in ovo -rokotteilla ja 14 päivää virulentilla Newcastlen taudilla altistuksen jälkeen virus.

3.2. Rokotevirusten leviäminen rokotuksen jälkeen, kuten rRT-PCR osoittaa

2 DPH:lla ei ollut merkittäviä eroja viruksen leviämisessä rokoteryhmien välillä. (Kuva 2A). Vastaavasti 4 DPH:ssa ryhmien väliset erot eivät olleet tilastollisesti merkitseviä. (Kuva 2B). Viruksen leviämistä ei havaittu missään Hatch- ja BHI-kontrollilintuista.

Kuva 2. Keskimääräinen kuoriutumisen jälkeinen rokotteen irtoaminen kanoista, jotka on kuoriutunut kaupallisista munista, jotka on inokuloitu 18 päivän alkion synnyssä kokeellisilla in ovo -rokotteilla. Jokainen datapiste edustaa yhtä lintua ja NDV-tiittereitä, jotka on havaittu suunnielun (OP) ja kloakaan (CL) pyyhkäisynä eri päivinä kuoriutumisen jälkeen (DPH). Irtoaminen esitetään erikseen 2 päivää kuoriutumisen jälkeen (A) ja 4 päivää kuoriutumisen jälkeen (B). Pylväät edustavat keskiarvon keskihajontoja. Kaikille näytteille, joista virusta ei havaittu, annettiin numeerinen arvo, joka oli 1 log tunnistusrajan alapuolella kullekin vastaavalle virukselle. rRT-PCR:n havaitsemisraja on esitetty vaakasuorana katkoviivana (käytetään alinta rajaa). Ryhmälyhenteet: HATCH—munat ei rokotettu; BHI - BHI:llä rokotetut munat; rHVT-ND — yhdistelmä-HVT-rokotteella rokotetut munat; ZJ1*L — munat, joihin on inokuloitu rekombinantti ZJ1*L-virus, jonka katkaisukohta oli muunnettu matalavirulenssiksi; ZJ1*L-IL4R – munat, joihin on inokuloitu rekombinantti matalavirulentti ZJ1*L, jossa interleukiini-4-geeni on insertoitu käänteisessä suunnassa; LS — munat, joihin on ympätty LaSota-kantaa; LS-IL4R – munat, joihin on inokuloitu yhdistelmä-DNA-tekniikalla valmistettu LaSota-virus, jossa interleukiini-4-geeni on lisätty käänteisessä suunnassa. Kunkin ryhmän munien saama virusannos on esitetty numerona ryhmän nimen jälkeen yksikössä EID50/muna.

3.3. Humoraalinen immuunivaste kuoriutumisen jälkeen

Kuvassa 3 on kuvattu HI-määrityksellä (NDV:n hemagglutinaatiovasta-aineiden havaitseminen) kerättyjen seeruminäytteiden analyysi 13 DPH:ssa (diagonaalisilla raidoilla täytetyt palkit). kanoista otettiin verta heti kuoriutumisen jälkeen (0 DPH). HI-tiitterit luukun kohdalla vaihtelivat log2 5:n ja log2 8:n välillä, ja keskiarvo oli log2 7.17 (kuva 3, katkoviiva vaakasuora punainen viiva). Vasta-aineet kohdassa 13 DPH Hatch-, BHI- ja rHVT-ND-ryhmissä (keskiarvo log2 4.7) ovat jäännösmaternaalisia vasta-aineita, koska näitä ryhmiä ei joko rokotettu tai ne on rokotettu rHVT-ND-rokotteella, mikä tekee eivät aiheuta HI-vasta-aineita NDV:lle. Vasta-ainetiitterit ZJ1*L-, ZJ1*L-IL4R- ja LS 104.5-ryhmissä olivat merkittävästi korkeammat verrattuna Hatch-, BHI- ja rHVT-ND-kontrolliryhmiin. Merkittäviä eroja ei havaittu saman rungon omaavien rokotteiden eri annosryhmien välillä. LS-IL4R-ryhmillä oli alhaisemmat rokotuksen jälkeiset HI-tiitterit verrattuna ZJ1*L-IL4R- ja ZJ1*L-ryhmiin, vaikka nämä erot eivät olleet tilastollisesti merkitseviä. On huomattava, että vaikkakin numeerisesti hieman korkeammat, kaikkien LS-IL4R-ryhmien lintujen rokotuksen jälkeiset HI-tiitterit eivät eronneet merkittävästi rokottamattomien kontrollilintujen tiittereistä.

Kuva 3. Altistusta edeltävät ja jälkeiset HI-vasta-ainetiitterit (ja standardipoikkeama) kanoista, jotka on kuoriutunut kaupallisista munista, jotka on ympätty 18 päivän alkion synnyttämisen jälkeen kokeellisilla in ovo -rokotteilla ja varhaisella altistuksella virulentilla Newcastlen taudin viruksella 14 päivää kuoriutumisen jälkeen. Diagonaaliset raitatäytetyt palkit edustavat altistusta edeltäviä tiittereitä 13 päivää kuoriutumisen jälkeen. Kiinteällä aineella täytetyt pylväät edustavat altistuksen jälkeisiä tiittereitä 14 päivää altistuksen jälkeen. Tilastollisesti merkitsevät erot eri ryhmien välillä on esitetty pienillä kirjaimilla kunkin ryhmän yläpuolella (p-arvo<0.05). The level of maternal antibodies on the day of hatch (0 DPH) is presented as a horizontal dotted line. Group abbreviations: HATCH—eggs not inoculated; BHI—eggs inoculated with BHI; rHVT-ND—eggs inoculated with recombinant HVT vaccine; ZJ1*L—eggs inoculated with the recombinant ZJ1*L virus whose cleavage site was modified to be of low virulence; ZJ1*L-IL4R—eggs inoculated with the recombinant low virulent ZJ1*L with the interleukin-4 gene inserted in reverse orientation; LS—eggs inoculated with the LaSota strain; LS-IL4R—eggs inoculated with the recombinant LaSota virus with the interleukin-4 gene inserted in reverse orientation. The virus dose that the eggs in each group received is represented as a number after the group name in EID50/per egg.

3.4. Kliiniset merkit ja selviytyminen CDV:n varhaisen haasteen jälkeen

Kontrolliryhmissä ensimmäiset havaitut kliiniset merkit olivat Hatch- ja BHI-ryhmissä 3 DPC:n kohdalla. Kolmella Hatch-ryhmän linnulla ja yhdellä BHI-ryhmän linnulla oli hengitysvaikeuksia. 4 DPC:ssä ryppyisiä höyheniä ja pään vapinaa havaittiin BHI- ja hatch-ryhmissä ja 5 DPC:ssä rHVT-ND-ryhmässä; jälkimmäisessä ryhmässä kahdella linnulla havaittiin myös ataksia ja vaikea torticollis. Hatch-kontrolliryhmän linnuilla oli letargiaa 5 DPC:ssä, ja kahdella BHI-ryhmän linnulla oli halvaus. Letargiaa ja halvauksia havaittiin rHVT-ND-ryhmässä klo 6 ja 7 DPC. Opisthotonos, torticollis ja hengitysvaikeudet havaittiin Hatch- ja BHI-kontrolliryhmissä klo 9 DPC alkaen. RHVT-ND-ryhmässä torticollis havaittiin jo 5 DPC:ssä, hengitysvaikeudet ja ataksia alkoivat klo 6 DPC:ssä ja opisthotonos alkoi klo 13 DPC. 14 DPC:hen mennessä kaikki linnut paitsi kaksi Hatch-lintua, yksi BHI-lintu ja kaksi rHVT-ND-lintua (83,3 prosenttia, 91,6 prosenttia ja 83,3 prosenttia sairastuvuusasteesta) joko kuolivat tai niille kehittyi pääasiassa neurologisia kliinisiä oireita, kuten ataksia, opisthotonus, torticollis ja vapina. , ja halvaantuu. Linnut, joilla oli vakavia kliinisiä oireita, lopettivat syömisen tai juomisen tai pysyivät makuuasennossa, lopetettiin ja ilmoitettiin kuolleiksi seuraavana päivänä selviytymisaikojen laskemista varten. Kliinisiä oireita ei havaittu missään ZJ1*L- ja ZJ1*L-IL4R-ryhmistä. Lieviä kliinisiä opisthotonoksen tai torticollis-oireita havaittiin yhdellä linnulla (8,4 prosentin sairastuvuus) kussakin LS-IL4R-ryhmässä ja LS 104.5 -ryhmässä 14 DPC:n kohdalla.

Eloonjääminen virulentilla ZJ1 NDV:llä altistuksen jälkeen on kuvattu eloonjäämiskäyrinä kuvassa 4. Vaikka kaikki ryhmät, jotka oli rokotettu yhdistelmärokotteilla ja LS:llä, osoittivat 100 prosentin eloonjäämistä, Hatch-, BHI- ja rHVT-ND-ryhmien linnuilla oli 58,3 prosenttia. 58,3 prosenttia ja 66,6 prosenttia eloonjäämisistä vastaavasti. Altistuksen jälkeinen eloonjääminen Hatch- ja BHI-verrokkiryhmissä oli merkittävästi alhaisempi kuin kokeellisissa rokoteryhmissä. On huomattava, että vaikka lintujen painot rokotetuissa ryhmissä vaihtelivat kuoriutumisen jälkeen verrattuna Hatch-, BHI- ja rHVT-ND-kontrolleihin, kaikki rNDV-rokotetut linnut (282–328 g) ylittivät rokottamattomien painon. kontrollilinnut altistuksen jälkeen (255–266 g) (taulukko 1). Mitään merkittävää painoeroa ei kuitenkaan havaittu minkään tutkitun ryhmän välillä.

Kuvio 4. Kanojen eloonjääminen kaupallisten munien siirrostuksen jälkeen 18 päivän alkiossa kokeellisilla in ovo -rokotteilla ja varhaisen altistuksen jälkeen virulentilla Newcastlen taudin viruksella 14 päivää kuoriutumisen jälkeen. Lintuja tarkkailtiin 14 päivän ajan altistuksen jälkeen. Erilaiset yläindeksikirjaimet osoittavat tilastollisesti merkitseviä eroja ryhmien välillä (p-arvo < 0,05). Ryhmälyhenteet: HATCH—munat ei rokotettu; BHI - BHI:llä rokotetut munat; rHVT-ND — yhdistelmä-HVT-rokotteella rokotetut munat; ZJ1*L — munat, joihin on inokuloitu rekombinantti ZJ1*L-virus, jonka katkaisukohta oli muunnettu matalavirulenssiksi; ZJ1*L-IL4R – munat, joihin on siirrostettu rekombinantti matalavirulentti ZJ1*L ja interleukiini-4-geeni insertoituna käänteisessä suunnassa; LS — munat, joihin on ympätty LaSota-kantaa; LS-IL4R – munat, joihin on inokuloitu yhdistelmä-DNA-tekninen LaSota-virus, jossa interleukiini-4-geeni on insertoitu käänteisessä suunnassa. Kunkin ryhmän munien saama virusannos on esitetty numerona ryhmän nimen jälkeen yksikössä EID50/muna.

3.5. Haasteen jälkeinen häviäminen rRT-PCR:n osoittamana

2 DPC:n kohdalla Hatch-, BHI- ja rHVT-ND-kontrolliryhmien linnut erittelivät korkeita virustiittereitä (1{{20}}5,3–5,7 EID50/ml) suun kautta, kun taas kaikki rokoteryhmät oli alle 104 EID50/ml keskimääräiset irtoamistiitterit (kuvio 5A). Tulokset viruksen leviämisestä kloakan läpi olivat testin havaitsemisrajan alapuolella kaikissa ryhmissä. Kahden DPC:n kohdalla kaikkien ZJ1*L- ja ZJ1*L-IL4R-ryhmien sekä LS-IL4R 105.5 -ryhmän linnuilla havaittiin merkittävästi vähemmän viruksen RNA:ta suun kautta verrattuna Hatch-, BHI- ja rHVT-ND-kontrolliryhmiin. (p-arvot vaihtelivat välillä 0,001 ja 0,02). Klo 4 DPC:n irtoaminen suun kautta Hatch-, BHI- ja rHVT-ND-ryhmissä oli korkea (106,2–6,9 EID50/ml) (kuva 5B).

Sitä vastoin kaikissa rokoteryhmissä havaittiin vähemmän irtoamista 4 DPC:llä verrattuna 2 DPC:hen, jolloin korkein keskimääräinen tiitteri oli 102,9 EID50/ml ryhmässä ZJ1*L 104,5 ja alhaisin keskimääräinen tiitteri 101,5 EID50/ml ZJ1*:ssa. l-IL4R 104.5 -ryhmä (viruksen RNA:ta ei havaittu joissakin linnuissa). Kaikki kokeelliset rNDV-rokoteryhmät erittivät merkittävästi vähemmän virusta oraalisen reitin kautta verrattuna Hatch-, BHI- ja rHVT-ND-kontrolliryhmiin (p-arvot<0.0001 to 0.03). No significant differences in oral shedding were observed among the experimental rNDV vaccine groups. The birds in the rNDV vaccine groups shed significantly less virus through the cloacal route compared with the Hatch, BHI, and rHVT-ND control groups (p values from <0.0001 to 0.007). The differences in the titers were not significant among the experimental rNDV vaccine groups and the LS control group.

Kuvio 5. Keskimääräinen altistuksen jälkeinen viruksen leviäminen kanoista kaupallisten munien siirrostuksen jälkeen 18 päivän alkion syntyvaiheessa kokeellisilla in ovo -rokotteilla ja varhaisen altistuksen jälkeen virulentilla Newcastlen taudin viruksella 14 päivää kuoriutumisen jälkeen. Jokainen datapiste edustaa NDV-tiittereitä, jotka on havaittu suunielun (OP) ja kloakaan (CL) pyyhkäisynä eri päivinä altistuksen jälkeen (DPC). Irtoaminen esitetään erikseen 2 päivää altistuksen jälkeen (A) ja 4 päivää altistuksen jälkeen (B). Pylväät edustavat keskiarvon keskihajontoja. Kaikille näytteille, joista virusta ei havaittu, annettiin numeerinen arvo, joka oli 1 log havaitsemisrajan alapuolella. rRT-PCR:n havaitsemisraja on esitetty vaakasuuntaisena katkoviivana.

Tilastollisesti merkitsevät erot eri ryhmien välillä on esitetty pienillä kirjaimilla kunkin ryhmän yläpuolella (p-arvo < 0.05). Ryhmälyhenteet: HATCH—munat ei rokotettu; BHI - BHI:llä rokotetut munat; rHVT-ND — yhdistelmä-HVT-rokotteella rokotetut munat; ZJ1*L — munat, joihin on inokuloitu rekombinantti ZJ1*L-virus, jonka katkaisukohta oli muunnettu matalavirulenssiksi; ZJ1*L-IL4R – munat, joihin on inokuloitu rekombinantti matalavirulenttinen ZJ1*L interleukiini-4-geeni insertoituna käänteisessä suunnassa; LS — munat, joihin on ympätty LaSota-kantaa; LS-IL4R – munat, joihin on inokuloitu yhdistelmä-DNA-tekninen LaSota-virus, johon on liitetty interleukiini-4-geeni käänteisessä suunnassa. Kunkin ryhmän munien saama virusannos on esitetty numerona ryhmän nimen jälkeen yksikössä EID50/muna.

3.6. Haasteen jälkeinen serologia

Kaikki Hatch-, BHI- ja rHVT-ND-kontrolliryhmien linnut osoittivat kohonneita (yli kaksinkertaisia) HI-vasta-ainetiittereitä kohdassa 14 DPC (yli log2 10) verrattuna altistusta edeltäviin tiittereihin 13 DPH:ssa (log{ {6}}.7). Erot tiittereissä näissä kolmessa ryhmässä ennen altistusta ja sen jälkeen olivat merkittäviä (p-arvo<0.0001) (Figure 3, solid bars). In contrast, the post-challenge HI titers in all experimental rNDV vaccine groups and the LS control group did not change significantly compared with the pre-challenge titers of the same groups. In all groups, the differences between pre-and post-challenge antibody titers were within a log (except LS-ILR4 103.5, in which the difference was log2 1.8).

3.7. Inokuloidut SPF-kontrolliryhmät

SPF-kontrolliryhmissä eloonjääminen kuoriutumisen jälkeen oli 66,7 prosenttia ryhmässä, jolle oli inokuloitu ZJ1*L 103,5 ja 57,1 prosenttia ryhmässä, jolle oli inokuloitu ZJ1*L-IL4R 103.5 (lisäkuva S3A). Aktiivinen viruksen leviäminen havaittiin SPF-kontrolliryhmien linnuissa molempien reittien kautta, korkeammat tiitterit havaittiin suunielun vanupuikkonäytteissä (katso lisäkuva S3B). Rokotuksen jälkeiset HI-tiitterit inokuloiduilla SPF-kontrollilintuilla olivat korkeammat kuin Hatch-, BHI- ja rHVT-ND-kontrolliryhmien tiitterit ja saavuttivat keskiarvot log2 7.08 ja log2 7. 58 klo 13 DPH ZJ1*L-IL4R 103.5 ja ZJ1*L-IL4R 103.5 ryhmissä, vastaavasti (katso lisäkuva S3C). Kahdessa rokotetussa SPF-kontrolliryhmässä ei havaittu altistuksen jälkeisiä kliinisiä oireita tai kuolleisuutta (katso eloonjäämiskäyrät lisäkuvasta S3D). Inokuloitujen SPF-kontrolliryhmien linnut levittivät merkittävästi vähemmän virusta suun kautta 2 DPC:llä ja 4 DPC:llä verrattuna kontrolliryhmiin (p-arvot<0.0001 to 0.009) (see Supplementary Figure S3E). The post-challenge antibody titers in both inoculated SPF control groups did not change significantly compared with the pre-challenge titers of the same groups (see Supplementary Figure S3C).

For more information:1950477648nn@gmail.com