Isotiosyanaattien neuroprotektiivinen potentiaali hermotulehduksen in vitro -mallissa

Ottaa yhteyttä:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Tiziana Latronico1 · Marilena Larocca2 · Serafna Milella1 · Anna Fasano1 · Rocco Rossano2 · Grazia Maria Liuzzi1

Vastaanotettu: 10.7.2020 / Hyväksytty: 25.10.2020 / Julkaistu verkossa: 16.11.2020

© Tekijä(t) 2020

Cistanche-yrttijauhetoiminto: on erittäin hyväneuroprotektiivinen vaikutus

Abstrakti

Isotiosyanaatit (ITC:t), joita esiintyy glukosinolaatin esiasteena ristikukkaisissa vihanneksissa, ovat osoittaneettulehdusta ehkäisevä, antioksidanttisia ja karsinogeenisia vaikutuksia. Tässä vertailimme kolmen eri ITC:n vaikutuksia ROS:n tuotantoon ja matriksin metalloproteinaasien (MMP) -2 ja -9 ilmentymiseen, jotka edustavat tärkeitä patogeneettisiä tekijöitä eri neurologisissa sairauksissa. Rotan astrosyyttien primääriviljelmät aktivoitiin LPS:llä ja niitä käsiteltiin samanaikaisesti eri annoksilla allyyli-isotiosyanaattia (AITC), 2-fenetyyli-isotiosyanaattia (PEITC) ja 2-sulforafaania (SFN). Tulokset osoittivat, että SFN ja PEITC pystyivät torjumaan H2O2:n indusoimaa ROS-tuotantoa. Soluviljelmän supernatanttien tsymografinen analyysi osoitti, että PEITC ja SFN olivat tehokkaimpia MMP-9:n estäjiä, kun taas vain SFN esti merkittävästi MMP{7}}-aktiivisuutta. PCR-analyysi osoitti, että kaikki käytetyt ITC:t estivät merkittävästi sekä MMP{8}}- että MMP{9}}-ilmentymistä. Mitogeenin aktivoiman proteiinikinaasin (MAPK) signaalireitin tutkimus osoitti, että ITC:t moduloivat MMP:n transkriptiota estämällä solunulkoisen säädellyn proteiinikinaasin (ERK) aktiivisuutta. Tämän tutkimuksen tulokset viittaavat siihen, että ITC:t voisivat olla lupaavia ravitsemuksellisia aineita MMP:hen liittyvien neurologisten sairauksien ehkäisyyn ja täydentävään hoitoon.

AvainsanatAntioksidantti · Anti-inflammatorinen · Isotiosyanaatti · Matriksimetalloproteinaasit · Neurodegeneratiiviset sairaudet

Johdanto

Neuroinflammaatio on monimutkainen reaktio aivovaurioon, joka sisältää sarjan biokemiallisia tapahtumia, jotka johtavat keskushermoston (CNS) solujen aktivoitumiseen. Astrosyyttien poikkeava aktivaatio vaarantaa niiden hermostoa suojaavan roolin, mikä johtaa tulehdusvälittäjien, kuten reaktiivisten happiyhdisteiden (ROS), typpioksidin (NO), sytokiinien, kemokiinien ja matriksin metalloproteinaasien vapautumiseen.

(MMP:t).

MMP:t ovat suuri ryhmä neutraaleja, Zn2 plus -riippuvaisia ​​endopeptidaaseja, joiden pääkohteina ovat ekstrasellulaarisen matriisin (ECM) komponentit, kuten fibronektiini, kollageeni, elastiini ja laminiini (Latronico ja Liuzzi 2017).

Tiziana Latronico

tiziana.latronico@uniba.it

Biotieteiden, bioteknologian ja biofarmasian laitos, Barin yliopisto "Aldo Moro",

Bari, Italia

Tieteiden laitos, Basilicatan yliopisto, Potenza,

Italia

Keskushermostossa MMP:t osallistuvat erilaisiin fysiologisiin reaktioihin, kuten morfogeneesiin, vaihtumiseen ja ECM:n uudelleenmuodostumiseen, embryogeneesiin ja haavan korjaamiseen; kuitenkin, kun MMP:t pakenevat säätelymekanismeja, niistä tulee haitallisia (Rosenberg 2009; Agrawal et al. 2008).

Tässä suhteessa tiedetään, että muutokset MMP:n ilmentymisessä ja aktiivisuudessa ovat keskeisiä patogeneettisiä tapahtumia useissa neurologisissa häiriöissä (Latronico ja Liuzzi 2017; Mastroianni ja Liuzzi 2007; Brkic et al. 2015). Kokeelliset todisteet ovat osoittaneet, että MMP:istä gelatinaasit A ​​(MMP-2) ja B (MMP-9) ovat erityisen osallisia hermotulehdukseen, koska niiden lisääntynyt säätely voi vaarantaa veri-aivoesteen (BBB) ​​eheyden. Tämä johtaa immuunijärjestelmän perifeeristen verisolujen lisääntyneeseen rekrytoitumiseen ja tunkeutumiseen aivojen parenkyymiin, mikä jatkaa tulehdusprosessia, joka on syynä progressiiviseen hermosolujen menetykseen ja hermosolujen toiminnan heikkenemiseen (Rivest 2009). Useat in vitro ja in vivo -tutkimukset ovat osoittaneet, että ROS-tuotanto on yksi tekijöistä, jotka osallistuvat MMP-9-ilmentymisen voimistumiseen aivosoluissa mitogeeniaktivoidun proteiinikinaasin (MAPK) signaalireittiriippuvaisten mekanismien kautta (Hsieh ja Yang 2013).

Tämän todisteen perusteella on selvää, että neurotoksisten tekijöiden heikentyminen, mikä johtaa alentuneisiin hermotulehdusvasteisiin, voi edustaa tehokasta terapeuttista strategiaa aivosairauksien puhkeamisen estämiseksi tai niiden etenemisen lievittämiseksi.

Viime vuosina biolääketieteellinen kiinnostus neurologiseen kenttään on keskittynyt yhä enemmän sellaisten luonnonyhdisteiden tutkimukseen, jotka pystyvät moduloimaan hermotulehdusreaktioihin liittyviä prosesseja. Tässä suhteessa useat tutkimukset ovat osoittaneet, että fytokemiallisilla yhdisteillä, kuten polyfenoleilla, isotiosyanaateilla (ITC) ja muilla, on hermostoa suojaavaa potentiaalia, joka johtuu myös niiden kyvystä estää MMP:iden ilmentymistä ja vastustaa ROS-tuotantoa (Dinkova-Kostova ja Kostov). 2012; Liuzzi et al. 2007, 2011).

Isotiosyanaatit ovat useiden Brassicaceae-heimoon kuuluvien kasvien tuottamia aineenvaihduntatuotteita suojautumisjärjestelmänä taudinaiheuttajia vastaan ​​(Bones ja Rossiter 2006). Ne ovat peräisin glukosinolaattien (GSL) entsymaattisesta hajoamisesta myrosinaasientsyymin vaikutuksesta. ITC:t ovat läsnä yleisesti kulutetuissa ristikukkaisissa vihanneksissa, kuten parsakaali, ruusukaali, kaali, nauris, piparjuuri, kyssäkaali, sinappi, retiisi, vesikrassi ja lehtikaali. Niiden määrät ruoassa ovat hyvin vaihtelevia ja riippuvat ruoan prosessoinnista ja valmistuksesta.

Viime aikoina on osoitettu, että ITC:illä on erilaisia ​​terapeuttisia vaikutuksia, mukaan lukien antioksidanttinen, antibakteerinen, anti-inflammatorinen ja kemopreventiivinen vaikutus (Dufour et al. 2015; Marzocco et al. 2015).

ITC:iden suojaava aktiivisuus toteutetaan moduloimalla erilaisia ​​signalointireittejä, jotka liittyvät myrkkyjen poistoon, tulehdukseen, apoptoosiin ja solusyklin säätelyyn. Useat todisteet osoittavat, että ITC:iden karsinogeeniset ja anti-inflammatoriset ominaisuudet voivat johtua pääasiassa niiden kyvystä aktivoida ydintekijän erytroidi 2- liittyvä tekijä 2 (Nrf2) -reitti. Nrf2 on redox-herkkä transkriptiotekijä, joka elektrofiilisten aineiden ja oksidatiivisten stressiolosuhteiden läsnä ollessa siirtyy ytimeen, jossa se sitoo antioksidanttivasteelementtejä (ARE) indusoimalla sytoprotektiivisten geenien ilmentymistä, jotka osallistuvat myrkkyjen poistoon ja oksidatiivisten olosuhteiden säätelyyn ja säätelyyn. tulehdusprosessit (Heiss et al 2001). Tässä suhteessa on raportoitu, että ITC:t pystyvät lisäämään ihmissolujen antioksidanttikapasiteettia indusoimalla faasin II myrkkyjä poistavien entsyymien ilmentymistä ja lisäämällä GSH:n tuotantoa (Wagner et al 2010). Lisäksi on raportoitu, että Nrf2:n ja ydintekijän (NF)-κB-reitin välillä on ristikeskustelu, joka johtaa tulehduksen modulaatioon (Sturm ja Wagner 2017; Lee ja Johnson 2004). Tässä suhteessa erilaiset kokeelliset hermotulehduksen in vitro ja in vivo -mallit ovat osoittaneet, että ITC:t pystyvät merkittävästi vähentämään NF-KB:n translokaatiota ja siten estämään proinflammatorisia sytokiinejä ja MMP:itä (Lee et al. 2015; Subedi et al. 2017).

Tässä artikkelissa tutkimme kolmen ITC:n eli allyyli-isotiosyanaatin (AITC), 2-fenetyyli-isotiosyanaatin (PEITC) ja 2-sulforafaanin (SFN) vaikutusta MMP:n vapautumiseen-2 ja -9 sekä LPS-aktivoitujen astrosyyttien ROS-tuotannossa. Tuloksemme osoittivat, että PEITC, SFN ja AITC pystyvät estämään in vitro MMP-9 ja MMP-2 ilmentymistä LPS-aktivoiduissa astrosyyteissä ja estämään H2O2:n indusoimaa ROS-tuotantoa. Lisäksi osoitimme, että ITC:t moduloivat MMP:iden yli-ilmentymistä mekanismilla, jotka liittyvät solunulkoisen säädellyn proteiinikinaasin (ERK) aktiivisuuden estämiseen. Nämä tulokset viittaavat siihen, että runsaasti ristikukkaisia ​​vihanneksia sisältävällä ruokavaliolla voi olla potentiaalisia etuja neurologisten sairauksien ehkäisyssä ja täydentävässä hoidossa.

Materiaalit ja menetelmät

Kemikaalit ja reagenssit

Dulbeccon modifioidun Eagle-alustan (DMEM), sikiön naudan seerumin (FBS), penisilliinin ja streptomysiinin toimitti GIBCO (Paisley, Skotlanti). Gelatiini, DNaasi 1, poly-L-lysiini

(PLL), trypsiini, lipopolysakkaridi (LPS), trypaanisininen ja 3-(4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli)-2.5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT) ), Allyyli-isotiosyanaatti (AITC) [turska. 377 430, puhtaus 95 prosenttia (HPLC)], 2-fenetyyli-isotiosyanaatti (PEITC) [cod. 253 731, puhtaus 99 prosenttia )], 2-Sulforafaani (SFN) [turska. S6317, puhtaus suurempi tai yhtä suuri kuin 95 prosenttia (HPLC)] toimitettiin Sigmalta (St. Louis, MO, USA). 2',7'-dikloorifluoreseiinidiasetaatti (DCFH-DA) ostettiin Calbiochemilta. Vakioproteiinit ja R-250 Coomassie Brilliant Blue olivat Bio-Radilta (Hercules, CA, USA). Anti-glial fibrillary acidic protein (GFAP) -vasta-aineet (RRID: AB_2294571) ostettiin Serotecilta (Oxford, UK). Vasta-aineet ekstrasellulaarisesti säädeltyjä proteiinikinaaseja (ERK) 1/2 ja fosforyloituja ERK 1/2 (p-ERK 1/2) vastaan ​​olivat Santa Cruz Biotechnologylta (Santa Cruz, CA). Hybond-P PVDF -kalvot, tehostetun kemiluminesenssin (ECL) Western Blotting -analyysijärjestelmä ja anti-hiiri-HRP-sekundaarinen vasta-aine olivat GE:ltä

Terveydenhuollon biotieteet (Little Chalfont, Buckinghamshire,

Iso-Britannia). MMP{0}}, MMP-9 ja 18S rRNA:lle spesifiset alukeparit olivat Sigma Genosysilta (Cambs, UK). RNeasy-minisarja ja QuantiTect Reverse Transcription -pakkaus ostettiin Qiagenilta (Valencia, CA, USA). Econo-Taq PLUS GREEN 2X Master Mix -reagenssit PCR:ää varten ostettiin Lucigen Corporationilta (Middleton, WI, USA).

Eettinen lausunto

Eläimillä tehdyt kokeet suoritettiin NIH:n laboratorioeläinten hoito- ja käyttöoppaan suositusten mukaisesti ja Italian Barin yliopiston Institutional Animal Care and Use Committeen (lupanumero: 23-98-) hyväksynnällä. A).

Astrosyyttiviljelmien valmistus

Astrosyytit valmistettiin {{0}}päivän ikäisten Wistar-rottien (RRID: RGD_737960, Harlan Laboratories srl, Udine, Italia) neokortikaalisista kudoksista. Astrosyyttien valmistukseen käytettiin 6 pentuetta, joissa oli 12 pentua, kumpaakin sukupuolta. Eläimet lopetettiin altistamalla hiilidioksidille (CO2) ja tapettiin nopealla katkaisulla. Neokortikaaliset kudokset leikattiin ja niitä käytettiin primääristen gliasoluviljelmien puhdistamiseen noudattaen menetelmää, jonka ovat raportoineet Latronico et ai. (2018). Lyhyesti, dissektion jälkeen rotan aivoista poistettiin aivokalvot ja verisuonet, ne jauhettiin mekaanisesti ja pilkottiin 0,25 prosentin trypsiinillä 0,01 prosentin DNaasin läsnä ollessa. Sentrifugoinnin ja solujen elinkelpoisuuden arvioinnin jälkeen solut maljattiin PLL-päällystettyihin pulloihin (75 cm2) tiheydellä 1,5 x 107 solua/pullo DMEM:ssä, 10 % FBS, 100 IU ml -1 penisilliiniä, 100 ug ml -1 streptomysiiniä. ja pidettiin 37 asteessa 5 prosentin CO2:ssa. 7 päivän kuluttua pulloja ravisteltiin oligodendrosyyttien ja mikroglian poistamiseksi. Trypsinisoinnilla saatujen astrosyyttien puhtaus (0,25 prosenttia trypsiiniä/0,02 prosenttia EDTA:ta) arvioitiin immunovärjäyksellä GFAP:n suhteen.

LPS-aktivoitujen astrosyyttien hoito allyyli-isotiosyanaatilla, fenetyyli-isotiosyanaatilla tai 2-sulforafaanilla

Konfluentteja astrosyyttejä, jotka oli kylvetty 96 kuoppalevylle, stimuloitiin 10 µg ml -1 LPS:llä ja käsiteltiin samanaikaisesti eri pitoisuuksilla allyyli-isotiosyanaattia (AITC), 2-fenetyyli-isotiosyanaattia (PEITC) tai 2-sulfafaania. (SFN) seerumittomassa DMEM:ssä. Astrosyytit seerumittomissa DMEM- ja LPS-aktivoiduissa astrosyyteissä edustivat negatiivisia ja positiivisia kontrolleja, vastaavasti. Lisäksi, koska AITC:n (100 µM), PEITC:n (67 µM) ja SFN:n (56,4 µM) kantaliuokset valmistettiin DMSO:ssa, annos-vastekäyrä DMSO:lle laimennettiin viljelyväliaineeseen samalla liuotinkonsentraatiolla, joka on läsnä DMSO:ssa. analysoidut näytteet ajettiin yhdisteen toksisuuden arvioimiseksi. 20 tunnin inkubaation jälkeen 37 asteessa, 5 % C02:ssa, supernatantit kerättiin ja säilytettiin -20 asteessa käyttöön asti, kun taas solut altistettiin MTT-määritykselle solujen elinkelpoisuuden arvioimiseksi.

MTT-solujen elinkelpoisuusmääritys

AITC:n, PEITC:n ja SFN:n sytotoksisuus astrosyyteissä havaittiin käyttämällä MTT:tä [{{0}}(4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli)- 2,{{5 }}difenyylitetratsoliumbromidi]-määritys. Tämä määritys perustuu MTT:n pelkistykseen mitokondrioiden sukkinaattidehydrogenaasin toimesta elävissä soluissa liukenemattomaksi siniseksi formatsaanituotteeksi, joka voidaan mitata spektrofotometrisesti. Lyhyesti sanottuna 20 tunnin AITC-, PEITC- tai SFN-käsittelyn jälkeen viljelyväliaine poistettiin ja solut ladattiin 0,5 mg:lla ml-1 MTT:tä. Kun oli inkuboitu 2 tuntia 37 asteessa, 5-prosenttinen C02-elatusaine poistettiin ja formatsaanikiteet soluissa liuotettiin 90-prosenttisella etanolilla. Levyjä ravisteltiin 15 minuuttia kiteiden täydellisen liukenemisen saavuttamiseksi, minkä jälkeen formatsaanituotteen määrä määritettiin optisella absorbanssilla 560 nm:ssä vertailuaallonpituudella 690 nm. Solujen elinkelpoisuus ilmaistiin prosentteina kontrollista (CTRL), jota edustavat käsittelemättömät solut ja joka asetettiin 100 prosenttiin. Jokaiselle yhdisteelle saatiin solujen elinkelpoisuuden annos-vaste-käyrä.

Reaktiivisten happilajien havaitseminen

Reaktiivisten happilajien (ROS) havaitseminen suoritettiin lataamalla astrosyytit 10 µM 2',7'-dikloorifluoreseiinidiasetaattia (DCFH-DA) fenolipunavapaassa DMEM:ssä 37 asteessa 30 minuutin ajan. Sitten DCFH-DA poistettiin kuopista ja soluja käsiteltiin 1 tunnin ajan AITC:llä (400 μM), PEITC:llä (10 μM) tai SFN:llä (25 μM) fenolipunavapaassa DMEM:ssä H2O2:n läsnä ollessa lopullisessa pitoisuudessa 100 μM. . Vain DCFH-DA:lla tai H202:lla käsitellyt solut edustivat vastaavasti negatiivista (CTRL) ja positiivista kontrollia (H2O2). Inkuboinnin jälkeen solut huuhdeltiin PBS:llä ja hajotettiin

Tris-HCl 10 mM/NaCl 150 mM/Triton X-100 0,5 %, pH 7,5,

sitten sentrifugoitiin 10,000×g, 4 astetta 10 minuuttia. Supernatantit kerättiin ja niiden spektrofluorimetrinen analyysi suoritettiin aallonpituudella 525 nm viritteen aallonpituudella 485 nm. Tulokset normalisoitiin kokonaisproteiinipitoisuuteen ja ROS-tuotanto ilmaistiin suhteellisena prosenttiosuutena fotoluminesenssin (PL) intensiteetistä positiiviseen kontrolliin verrattuna.

Gelatinaasien havaitseminen

Gelatinaasiaktiivisuus solusupernatanteissa (SN:t) havaittiin tsymografisella analyysillä, kuten ovat raportoineet Latronico et ai. (2013). Lyhyesti sanottuna määrä SN:ää, joka vastasi noin 10 ug kokonaisproteiineja, liuotettiin 30 ul:lla Laemmli-näytepuskuria ilman merkaptoetanolia. Näytteet ajettiin 7,5-prosenttisessa polyakryyliamidigeelissä, joka oli kopolymeroitu 0,1-prosenttisella (paino/tilavuus) gelatiinilla. Elektroforeettisen ajon jälkeen geelit huuhdeltiin kahdesti 2,5 % Triton X-100/10 mM CaCl2:lla 50 mM Tris-HCl:ssä, pH 7,4, ja inkuboitiin 24 tuntia 37 asteessa 1 % Triton X:ssä-100 /50 mM Tris-HCl/10 mM CaCl2, pH 7,4. Geelit värjättiin Coomassie briljanttisinisellä R-250 ja värjättiin metanoli/etikkahappo/H20-seoksessa (4:1:5 tilavuus/tilavuus). Gelatinaasiaktiivisuus visualisoitiin kirkkaana pilkkoutumisvyöhykkeenä geelin sinisellä taustalla ja kvantifioitiin tietokoneistetun densitometrisen kuva-analyysin avulla käyttämällä Image LabTM -ohjelmistoa (Bio-Rad Laboratories). Gelatinaasi

aktiivisuus ilmaistiin optisena tiheydenä (OD) × mm2, joka edustaa käyrien alla olevaa skannausaluetta, joka ottaa huomioon sekä substraatin hajoamisvyöhykkeen kirkkauden että leveyden. Tiedot ilmaistiin käyttämällä seuraavaa yhtälöä: prosentuaalinen inhibitio=[100 − (OD-näyte/OD-positiivinen kontrolli) × 100].

Käänteistranskriptiopolymeraasiketjureaktio (RT-PCR)

Astrosyytit, jotka oli kylvetty 6-kuoppaisille levyille, aktivoitiin LPS:llä (10 µg ml-1) ja käsiteltiin samanaikaisesti ITC:illä myrkyttömällä maksimipitoisuudella. 20 tunnin inkubaation jälkeen kokonais-RNA uutettiin astrosyyteistä käyttämällä Qiagen RNeasy -minisarjaa valmistajan ohjeiden mukaisesti. Komplementaarinen DNA (cDNA) syntetisoitiin 500 ng:sta RNA:ta käyttämällä QuantiTect Reverse Transcription -kittiä valmistajan ohjeiden mukaisesti. Yhteensä 25 ng käänteistranskriptiotuotteita käytettiin 591 bp:n fragmentin monistamiseen käyttämällä erityisiä alukkeita (sense 5′-GTC ACT CCG CTG CGC TTT TCT CG-3′; antisense 5'-GAC ACA TGG GGC ACC TTC TGA-3′) rotan MMP-2-sekvenssille ja 541 bp:n fragmentti käyttämällä spesifisiä alukkeita (sense 5'-CGG AGC ACG GGG ACG GGT ATC 3'; antisense 5'-AAG ACG AAG GGG AAG ACG CAC ATC 3′) rotan MMP-9-sekvenssille. Samanaikaisesti suoritettiin rotan 18S rRNA:n (sense 5'-GCCTAGATA CCGCAGCTAGGA-3'; antisense 5'-TCATGGCCTCAG TTCCGAA-3'), suhteellisen muuttumattoman sisäisen vertailugeenin, 308 bp:n fragmentin monistus. . Muissa tutkimuksissa jo validoidut alukesarjat (Latronico ym. 2013; Liuzzi ym. 2004; Gramegna et al. 2011) tunnistavat spesifisesti vain kiinnostavat geenit, kuten PCR:n odotetun kokoisen yksittäisen juovan monistaminen osoittaa. Tuotteet. PCR-monistus suoritettiin 25 syklin ajan, joista kukin koostui denaturaatiosta 94 asteessa, pariutumisesta 59 asteessa ja pidennyksestä 72 asteessa. Monistamisen jälkeen tuotteet analysoitiin 1,5-prosenttisissa agaroosigeeleissä. Geelien densitometrisen analyysin jälkeen kohdegeenien monistuminen normalisoitiin 18S rRNA:n ilmentymiseen, ja tulokset ilmaistiin eston prosentteina verrattuna positiiviseen kontrolliin, kuten gelatinaasin kvantifiointiin on raportoitu.

ERK 1/2 -fosforylaation havaitseminen Western blot -analyysillä

ERK 1/2 havaittiin immunoblot-analyysillä, kuten on raportoitu julkaisussa Latronico et ai. (2018). Lyhyesti sanottuna yhtyevä ensisijainen

astrosyytit, jotka oli maljattu {{0}}kuoppalevyille, lepotilassa seerumittomassa alustassa 24 tuntia, esikäsiteltiin 1 tunnin ajan AITC:llä (400 μM), PEITC:llä (10 μM), tai SFN (25 μM) fenolipunavapaassa DMEM:ssä. 2 tunnin stimulaation jälkeen 10 ug ml-1 LPS:llä solut hajotettiin liuoksella 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 2,5 mM Na-pyrofosfaatti, 1 mM -glyserofosfaatti 1 % Triton X{19}}, 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifuoridi, 20 ug/ml aprotiniinia, 1 mM EGTA, 1 mM Na-fuoridi, 1 mM Na3V04, pH 7,5. Kuusikymmentä ug kunkin näytteen kokonaisproteiineja erotettiin 10 prosentin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla ja proteiinit immunoblotattiin sitten polyvinylideenidifluoridikalvoille. Sen jälkeen, kun kalvoja oli estetty yön yli 4 asteessa 0,05 % Tween 20:llä, 1 % maidolla, 1 % naudan seerumialbumiinilla 150 mM NaCl:ssa, 20 mM Tris-HCl:ssa (pH 7,5), kalvoja tutkittiin yön yli 4 asteessa monoklonaalisella anti-p- ERK 1/2 vasta-aine (1:500). Sitten kalvot pestiin kolme kertaa 0,05-prosenttisella Tween 20:llä Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa, tutkittiin anti-hiiri-piparjuuriperoksidaasin sekundaarivasta-aineella (1:20,{56}}) 2-h 24 asteessa ja havaittiin parannetulla kemiluminesenssilla. ERK:n kokonaismäärän arvioimiseksi kalvot irrotettiin ja niitä inkuboitiin fosforyloimattomalle ERK 1/2:lle spesifisen vasta-aineen kanssa (1:500). Vyöhykkeiden intensiteetit määritettiin blottien densitometrisellä skannauksella ja ERK 1/2:n fosforylaatiotasot normalisoitiin fosforyloimattomaksi ERK 1/2:ksi ja ilmaistiin prosentteina verrattuna positiiviseen kontrolliin (astrosyytit, joita käsiteltiin LPS:llä) seuraava yhtälö:

prosentti pERK 1/2=(OD-näyte/ODpositiivinen kontrolli) × 100.

Tilastollinen analyysi

Tietojen analyysi suoritettiin käyttämällä GraphPad Prism 5:tä.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA). Tiedot ilmaistiin keskiarvoina ± SD. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttämällä yksisuuntaista varianssianalyysiä (ANOVA), jota seurasi Dunnettin moninkertainen vertailu post hoc -testi.

Tulokset

Isotiosyanaattiyhdisteiden vaikutus astrosyyttien elinkykyyn

Alustavat kokeet suoritettiin AITC:n, PEITC:n tai SFN:n sytotoksisuuden arvioimiseksi. Tätä tarkoitusta varten puhdistettuja astrosyyttejä käsiteltiin 20 tuntia ITC-yhdisteillä pitoisuuksilla, jotka vaihtelivat välillä 5 - 400 uM, tai DMSO:lla, joka oli laimennettu elatusaineeseen menetelmä-osiossa kuvatulla tavalla. Kuten kuviossa 1 on esitetty, DMSO ei ollut myrkyllinen millään käytetyillä pitoisuuksilla, jotka vastaavat testattujen ITC-liuosten pitoisuuksia. Tutkituista ITC:istä AITC

Kuva 1 Isotiosyanaattiyhdisteillä käsiteltyjen astrosyyttien solujen elinkelpoisuus. Konfluentteja primaarisia astrosyyttejä käsiteltiin 20 tunnin ajan allyyli-isotiosyanaatilla (AITC), 2-fenetyyli-isotiosyanaatilla (PEITC) tai 2-sulforafaanilla (SFN) osoitetuissa pitoisuuksissa, minkä jälkeen niille suoritettiin MTT-määritys. Lisäksi, koska se on varastoliuoksissa, jotka liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO), jokaisessa kokeessa ajettiin annos-vastekäyrä DMSO:lle, joka oli laimennettu viljelyväliaineeseen samalla liuotinkonsentraatiolla (prosenttia), joka oli läsnä ITC-näytteissä. luotettava arvio ITC-myrkyllisyydestä. Kontrolli (CTRL) oli repre-

tuoksuttu käsittelemättömistä astrosyyteistä seerumittomassa DMEM:ssä. Kaaviot edustavat solujen elinkelpoisuuden annos-vastekäyriä ilmaistuna prosentteina solujen eloonjäämisestä verrattuna kontrolliin. Yhdisteiden annokset, jotka määrittelivät solujen elinkelpoisuuden yli 60 prosentiksi, valittiin myrkyttömäksi maksimipitoisuudeksi. Arvot ovat eri solupopulaatioilla suoritetun n=3 kokeen keskiarvo ± SD. Mikrograafit osoittavat edustavia tuloksia solumorfologiasta, joka on havaittu faasikontrastimikroskoopilla (50-kertainen suurennus) eri yhdisteillä käsittelyn jälkeen

oli vähemmän myrkyllinen astrosyyteille. Erityisesti AITC ei ollut toksinen soluille 400 uM asti, kun taas PEITC ja SFN olivat myrkyllisiä pitoisuuksilla, jotka olivat yli 10 ja 25 uM, vastaavasti. Mikroskooppinen havainto vahvisti MTT-määrityksen tulokset, jotka osoittavat, että PEITC:n ja SFN:n toksisilla pitoisuuksilla astrosyyttien määrä väheni ja jäljelle jääneiden osoitti sytotoksisia muutoksia sytoplasmassaan.

ITC-yhdisteiden suojaava vaikutus ROS-tuotantoon vetyperoksidilla käsitellyissä astrosyyteissä

ITC:iden oksidatiivista stressiä vastaan ​​suojaavan vaikutuksen arvioimiseksi astrosyytit esikäsiteltiin PEITC:llä, AITC:llä ja SFN:llä suurimmalla myrkyttömällä pitoisuudella ja sitten stimuloitiin H2O2:lla. H202:n indusoima solunsisäinen ROS-tuotanto määritettiin DCFH-DA:lla. Kuten kuvassa 2 näkyy, H2O2:lle altistuminen tehosti fluoresoivaa signaalia sisään

Kuva 2 Reaktiivisten happilajien (ROS) tuotanto ITC:illä käsitellyissä astrosyyteissä. ROS:n läsnäolo määritettiin mittaamalla 2',7'-dikloorifluoreseiinin (DCFA) fluoresoivan signaalin muutokset, kuten Materiaalit ja menetelmät -osiossa on raportoitu. Astrosyyttejä, jotka oli kylvetty 6-kuoppaisille levyille, esikäsiteltiin 3 0 minuuttia DCFA:lla, sitten niitä käsiteltiin 1 tunti 10 µM PEITC:llä, 400 µM AITC:llä tai 25 µM SFN:llä H2O2:n läsnä ollessa lopullisessa pitoisuudessa 100 µM. . Astrosyytit, joita käsiteltiin pelkällä DCFA:lla (CTRL) tai 100 µM H2O2:lla, edustivat vastaavasti negatiivista ja positiivista kontrollia. Solulysaateissa havaittu fluoresoiva signaali mitattiin fluorometrillä aallonpituudella 525 nm viritteen aallonpituudella 485 nm. ROS-tuotanto ilmaistiin prosentteina (prosenttina) fotoluminesenssin (PL) intensiteetistä verrattuna positiiviseen kontrolliin. Arvot ovat eri solupopulaatioilla suoritetun n=3 kokeen keskiarvo ± SD. Tilastollisesti merkitsevä lasku H2O2:een verrattuna on merkitty tähdillä (yksisuuntainen ANOVA, jota seuraa Dunnet'in post hoc -testi; *p <>

astrosyytit verrattuna kontrolliin (CTRL). Kuten DCF-fluoresenssin intensiteetin lasku osoittaa, astrosyyttien esikäsittely ITC-yhdisteillä torjui H2O2:n indusoimaa ROS:n muodostumista. Testatuista ITC:istä vain PEITC ja SFN pystyivät merkittävästi vähentämään ROS-tuotantoa noin 20 ja 24 prosenttia verrattuna positiiviseen kontrolliin (H2O2).

Isotiosyanaattiyhdisteet estävät MMP-2- ja MMP-9-tasoja LPS-aktivoiduissa astrosyyteissä

ITC-yhdisteiden vaikutus MMP-2- ja MMP-9-tasoihin arvioitiin astrosyyteissä, jotka oli aktivoitu LPS:llä, jonka tiedetään indusoivan gelatinaasien ilmentymistä (Gottschall ja Deb 1996), ja joita oli samanaikaisesti käsitelty AITC:llä. PEITC tai SFN pitoisuuksilla, jotka eivät olleet toksisia soluille. Kuten kuvassa 3a esitetään, geelissä oli kaksi selkeää 72 ja 92 kDa:n pilkkoutumisvyöhykettä, jotka vastasivat vastaavasti MMP:tä-2 ja MMP:tä-9. Astrosyyttien aktivointi LPS:llä lisäsi MMP-2 tasoja ja indusoi MMP-9 synteesiä. Hoito AITC:llä (kuva 3b), PEITC:llä (kuva 3c) tai SFN:llä (kuva 3d) määritti annoksesta riippuvan

MMP{0}}-tasojen alentaminen, mikä vaihteli käytetyn yhdisteen mukaan. Erityisesti käytetyistä ITC:istä SFN oli tehokkain MMP:n estämisessä-9, koska se määritti 70 prosentin eston annoksella 10 µM ja 100 prosentin eston annoksella 25 µM. Lisäksi vain SFN myrkyttömällä maksimipitoisuudella kykeni estämään merkittävästi MMP-2 (kuvio 2d).

Isotiosyanaattiyhdisteet estävät MMP-2- ja MMP-9-geenin ilmentymistä LPS-aktivoiduissa astrosyyteissä

Sen määrittämiseksi, kykenivätkö tutkitut ITC-yhdisteet inhiboimaan MMP{0}}- ja MMP-9-ilmentymistä, RT-PCR suoritettiin LPS-aktivoiduille astrosyyteille, joita oli käsitelty maksimi myrkyttömällä ITC-pitoisuudella. Kuten edustavat geelit kuviossa 4a osoittavat, LPS-aktivoitujen astrosyyttien käsittely yksittäisillä ITC:illä pystyi estämään MMP{7}}- ja MMP{8}}-mRNA:n lisääntyneen ilmentymisen. Kuten kuvassa 4b näkyy, tulosten kvantitatiivinen analyysi osoitti, että myrkyttömällä maksimipitoisuudella ITC-yhdisteet määrittelivät tilastollisesti merkitsevän MMP{11}}- ja MMP{12}}-ekspression eston vertailussa. positiiviseksi kontrolliksi (LPS). Erityisesti PEITC ja SFN estivät saman prosenttiosuuden MMP:lle-2 (85 prosenttia) ja MMP:lle-9 (100 prosenttia), kun taas AITC oli vähemmän tehokas kuin PEITC ja SFN MMP:n estämisessä{{17} } (65 prosenttia ) ja MMP-9 (90 prosenttia ) lauseke.

ERK 1/2 osallistuu MMP:n ilmentymisen estämiseen ITC:llä

Koska ERK 1/2 on tärkein signaalinvälitysreitti, joka osallistuu MMP-2- ja MMP-9-ilmentymisen säätelyyn LPS-aktivoiduissa astrosyyteissä (Lee et al. 2003), ITC-yhdisteiden vaikutus solunulkoisten säädeltyjen proteiinikinaasien (ERK) aktivaatio 1/2 testattiin.

Kuten kuviossa 5 on esitetty, LPS indusoi tilastollisesti merkitsevän nousun fosforyloidun ERK 1/2:n (p-ERK) tasoissa, jota torjui esikäsittely ITC-yhdisteillä.

Keskustelu

Yleisesti uskotaan, että tärkeimmät puolustusstrategiat monia sairauksia vastaan ​​ovat pääasiassa riskitekijöiden välttäminen ja oikeanlainen elämäntapa. On olemassa lukuisia tieteellisiä todisteita, jotka tukevat hypoteesia, jonka mukaan jotkin luonnolliset aineenvaihduntatuotteet, joita tyypillisesti tuottavat erilaisia ​​hedelmiä ja vihanneksia, pystyvät moduloimaan patologisia ilmiöitä, kuten syöpää, neurologisia sairauksia ja muita monitekijäisiä sairauksia. Tässä skenaariossa isotiosyanaatit (ITC) herättivät suurta kiinnostusta, koska niiden antifungaaliset, antibakteeriset,

Kuva 3 Isotiosyanaattiyhdisteiden vaikutus MMP-2- ja MMP-9-tasoihin LPS-aktivoiduissa astrosyyteissä. Kohdassa a on raportoitu edustava tsymograafinen geeli viljelmän supernatanttien analyysistä astrosyyteistä, jotka on aktivoitu LPS:llä (10 ug ml-1) ja joita on samanaikaisesti käsitelty 20 tunnin ajan AITC:llä, PEITC:llä tai SFN:llä ilmoitetuissa pitoisuuksissa (μM). Negatiiviset ja positiiviset kontrollit saatiin stimuloimattomista ja käsittelemättömistä astrosyyteistä seerumivapaassa elatusaineessa (CTRL) ja LPS-

aktivoidut solut (LPS). Histogrammit b–d edustavat tuloksia (keskiarvo ± SD) n:stä {{0}} kokeesta, jotka on suoritettu eri solupopulaatioilla, ilmaistuna prosentteina MMP-estämisestä verrattuna LPS:ään, laskettuna skannausdensitometrian ja geelien tietokoneistetun analyysin jälkeen. . Tilastollisesti merkitsevä lasku LPS:ään verrattuna on merkitty tähdillä (yksisuuntainen ANOVA, jota seuraa Dunnet'n post hoc -testi; *p < 0,05,="" **p=""><>

antikarsinogeeniset, antimutageeniset, antioksidanttiset ja anti-inflammatoriset biologiset ominaisuudet (Dufour et al. 2015; Marzocco ym. 2015; Vig et al., 2009; Talalay ja Fahey 2001). Isotiosyanaatit ovat peräisin glukosinolaattien (GSL) entsymaattisesta hajoamisesta. Ne ovat sekundaarisia metaboliitteja, joita esiintyy 15 Capparales-lahkon kasvitieteellisessä perheessä ja joita on runsaasti Brassicaceae-heimossa (Fahey et al. 2001). GSL:t hydrolysoituvat myrosinaasilla (-tioglukosidiglukohydrolaasi e; EC 3.2.3.147) useissa komponenteissa, kuten ITC:issä, nitriiteissä, tiosyanaateissa, epitionitriileissä, SFGatessa, glukoosissa ja oksatsolidiinissa (Li ja Kushad2005). Vaikka ITC:itä on tutkittu laajasti kemoterapeuttisella alalla (Grundemann ja Huber 2018), niiden terapeuttista potentiaalia neurologisissa sairauksissa on tutkittu vain vähän, vaikka on osoitettu SFN:n ja AITC:n kyky ylittää BBB ja kerääntyä aivojen parenkyymiin. (Clarke ym. 2011; Jazwa ym. 2011; Zhang 2010). Tässä artikkelissa vertailimme kolmen ITC:n vaikutuksia,

esiintyy useissa yleisesti kulutetuissa ristikukkaisissa vihanneksissa, reaktiivisten happilajikkeiden (ROS) tuotannossa ja matriisin metalloproteinaasin (MMP) ilmentymisessä hermotulehduksen in vitro -mallissa, jota edustavat lipopolysakkaridilla (LPS) aktivoidut tai H2O2:lla käsitellyt astrosyytit. Astrosyytit, keskushermoston yleisin gliasolutyyppi, ovat ratkaisevassa roolissa aivojen homeostaasin ylläpitämisessä ja ovat erilaisten neurologisten sairauksien tunnusmerkkejä (Cekanaviciute ja Buckwalter 2016; Colombo ja Farina 2016). Niitä pidetään keskeisinä synnynnäisen immuunivasteen säätelijöinä, ja niiden vasteet haitallisiin loukkauksiin, kuten oksidatiiviseen stressiin, voivat pahentaa tulehdusreaktioita ja kudosvaurioita tai edistää kudosten paranemista. On hyvin tunnettua, että aktivoidut astrosyytit tuottavat neurotoksisia tekijöitä, kuten MMP:itä, joilla on keskeinen rooli hermotulehduksen ja progressiivisen hermosolujen menetyksen edistämisessä neurologisissa sairauksissa (Hsieh ja Yang 2013). Siksi modulaatio

Kuva 4 ITC-yhdisteiden vaikutus MMP-2- ja MMP-9-ilmentymiseen LPS-aktivoiduissa astrosyyteissä. Astrosyytit, jotka oli kylvetty 6-kuoppaisille levyille, aktivoitiin LPS:llä (10 µg ml-1) ja niitä käsiteltiin samanaikaisesti 20 tuntia AITC:llä (400 µM), PEITC:llä (10 µM) tai SFN:llä (25 µM), minkä jälkeen altistettiin RT-PCR. Edustavia agaroosigeelejä MMP-2- ja MMP-9-ekspressiolle on raportoitu kohdassa (a). Histogrammit kohdassa (b) edustavat tuloksia (keskiarvo ± SD) n=3 kokeesta, jotka on suoritettu eri soluissa

tapahtumat, jotka tapahtuvat astrosyyttien aktivoitumisen jälkeen, voivat lieventää tulehdusvastetta ja hermosolujen vaurioita.

Tämän tutkimuksen tulokset osoittivat, että tutkituista ITC:istä AITC oli vähemmän myrkyllinen, koska se ei johtanut solujen elinkelpoisuuden vähenemiseen kaikilla käytetyillä pitoisuuksilla. Sitä vastoin, samoin kuin muut kirjoittajat ovat havainneet eri gliasolulinjoilla, PEITC ja SFN osoittivat solutoksisuutta yli 10 ja 25 µM pitoisuuksilla (Lee et al. 2015; Eren et al. 2018; Su et al. . 2015).

Nykyisessä tieteellisessä kirjallisuudessa on paljon kiistanalaista tietoa ITC:iden solujen elinkykyyn vaikuttavien vaikutusten taustalla olevista molekyylimekanismeista. Tässä suhteessa useimmat tutkimukset ovat ehdottaneet, että ITC:t estävät solujen kasvua indusoivaa apoptoosia, solusyklin pysähtymistä, ROS:n muodostumista syöpäsoluissa, mutta eivät normaaleissa soluissa (Fofaria et al. 2015; Qin et al. 2018; Sestili ja Fimognari 2015). Havaitsimme, että SFN:llä ja PEITC:llä, mutta ei AITC:llä, on suojaava rooli astrosyyttien oksidatiivista stressiä vastaan, ja todellakin maksimi myrkyttömällä pitoisuudella ne pystyivät estämään H2O2:lle altistuksen aiheuttaman ROS-tuotannon. Keskushermosto on erityisen herkkä oksidatiiviselle stressille korkean hapenkulutuksen, heikkojen antioksidanttijärjestelmien ja korkean hapettumiselle alttiiden biomakromolekyylien pitoisuuden vuoksi. ROS:n ja oksidatiivisten vaurioiden muodostumisen uskotaan osallistuvan neurologisten häiriöiden, kuten Alzheimerin taudin (AD), Parkinsonin taudin (PD), amyotrofisen lateraaliskleroosin (ALS) ja multippeliskleroosin (MS) patogeneesiin (Lee et ai. 2015). Tästä syystä, vaikka in vitro -kokeissamme SFN ja PEITC vastustivat ROS-tuotantoa kohtalaisessa määrin, voimme olettaa, että in vivo pitkittynyt ITC:iden anto voi johtaa merkittävämpään ROS:n vähenemiseen, mikä voi ajan myötä johtaa merkitykselliseen populaatioille ilmaistuna prosentteina MMP-inhibitiosta verrattuna positiiviseen kontrolliin (LPS), laskettuna skannausdensitometrian ja geelien tietokoneistetun analyysin jälkeen. Tilastollisesti merkitsevä MMP-2- ja MMP-9-ilmentymien väheneminen verrattuna LPS:ään on merkitty tähdillä (yksisuuntainen ANOVA, jota seuraa Dunnet'n post hoc -testi; *p <>

aivosairauksien ehkäisy ja säätely. ROS toimii kriittisenä signalointimolekyylinä laukaisemaan tulehdusvasteen kaskadin keskushermostoon. Tässä suhteessa tiedetään hyvin, että ROS säätelee monien hermotulehdukseen osallistuvien geenien ilmentymistä aktivoimalla tulehdusta edistäviä transkriptiotekijöitä, kuten ydintekijä-κB (NF-κB) (Lee et al. 2015; Chiurchiù et al. 2016; Martorana ym. 2019). Tässä skenaariossa tärkeä rooli on MMP:illä, joiden ilmentymistä ROS säätelee ylösalaisin NF-κB:n aktivoinnin kautta (Yan ja Boyd 2007).

Koska MMP:n dysregulaatio myötävaikuttaa lukuisten hermoston tulehduksellisten ja hermostoa rappeuttavien sairauksien patogeneesiin, niiden estäminen on tärkeä terapeuttinen strategia. Tästä syystä kasvava kiinnostus on kohdistunut viimeisen vuosikymmenen aikana lääkkeiden ja luonnollisten yhdisteiden mahdollisuuksiin estää MMP:itä. Lukuisat in vitro -tutkimukset ovat osoittaneet, että useiden vihanneksissa ja meren eliöissä olevien lääkkeiden ja bioaktiivisten yhdisteiden anti-inflammatorinen ja antioksidanttivaikutus liittyy niiden kykyyn estää MMP:iden ilmentymistä (Latronico et al. 2016, 2018; Di Bari et al. . 2015). Tässä tutkimuksessa osoitimme, että testatuista ITC:istä SFN ja PEITC estivät tehokkaimmin MMP-2- ja MMP-9-tasoja ja ilmentymistä LPS-aktivoiduissa astrosyyteissä. Muissa in vivo- ja in vitro -tutkimuksissa on raportoitu ITC:iden aiheuttamaa MMP:iden estoa. Erityisesti Li et ai. (2013) osoittivat, että SFN pystyy lieventämään BBB-vaurioita estämällä MMP-9:n ilmentymistä kokeellisen autoimmuunisen enkefalomyeliitin in vivo -mallissa. Muut kirjoittajat raportoivat, että SFN kykeni heikentämään MMP-9-ekspressiota hiirten selkäydinvaurion jälkeen (Mao et al. 2010a). Lisäksi in vitro -tutkimukset osoittivat, että ITC:t estävät solujen migraatiota ja

Kuvio 5 Solunulkoisen signaalin säätelemä kinaasi 1/2 (ERK 1/2) on osallisena ITC-yhdisteiden MMP-ilmentymisen estämisessä. Edustavia autoradiografisia filmejä astrosyyttien lysaattien Western blot -analyysistä, joita on esikäsitelty 1 tunnin ajan AITC:llä (400 µM), PEITC:llä (10 µM) tai SFN:llä (25 µM) ja aktivoitiin sitten 2 tunnin ajan LPS:llä (10 ug mL{{). 13}}). Käsittelemättömät ja stimuloimattomat solut edustavat negatiivista kontrollia (CTRL). Kohdan (b) histogrammi edustaa pERK1/2-tason invaasiota C6-glioomasoluissa, ja se liittyi NF-KB:n välittämään MMP-9-ilmentymisen estoon (Lee et al. 2015).

Molekyylimekanismit, joilla ITC:t estävät MMP:itä, ovat epäselviä, eikä ole olemassa tutkimuksia, joissa tutkittaisiin ITC:iden antioksidanttisia ja anti-inflammatorisia ominaisuuksia primaarisissa astrosyyttiviljelmissä. Useat tutkimukset tukevat hypoteesia, että ITC:iden estävä vaikutus johtuu niiden kyvystä estää NF-KB:tä Nrf2-signalointireitin kautta. Tässä suhteessa in vivo -tutkimus osoittaa, että Nrf2-poistoperäiset hiiret olivat herkempiä NF-KB-välitteiselle selkäytimen tulehdusvasteelle ja NFkB-riippuvaisten geenien, mukaan lukien MMP-9, lisääntyneelle ilmentymiselle (Mao et al. 2010b). ). Vaikka NF-κB- ja Nrf2-reitit voivat olla vuorovaikutuksessa, osoitimme, että NF-kB:n säätely tapahtuu myös Nrf2:n riippumattomien molekyylimekanismien moduloinnin kautta. Todellakin, havaitsimme, että AITC, PEITC ja SFN estivät ERK1/2:n aktivaatiota, jolla on keskeinen rooli signaalinsiirtotapahtumien sarjassa, joka lopulta säätelee MMP-geenin transkriptiota.

Kuitenkin kokeellinen todiste siitä, että SFN myrkyttömällä maksimipitoisuudella esti täysin sekä MMP-9-ilmentymistä että -tasoja, kun taas AITC ja PEITC estivät maksimaalisesti MMP-9-ilmentymistä, mutta vain pudottivat MMP{{3} } tasot noin 50 prosenttiin, saattaa viitata siihen, että nämä yhdisteet moduloivat MMP{5}}-transkriptiota eri vaikutusmekanismein. Tässä suhteessa on raportoitu, että SFN, sen lisäksi, että se estää LPS:n aiheuttamaa NF-KB:n aktivaatiota, häiritsee LPS:n sitoutumista TLR4-reseptoriin (Koo et al 2013). SFN:n estävä vaikutus TLR4:ään saattaa estää LPS:n aiheuttaman astrosyyttien aktivoitumisen, mikä voi johtaa MMP{11}}:n ilmentymisen ylävirran estoon, mistä seuraa MMP-9-tuotannon puute.

saatu autoradiografisten kalvojen densitometrisen skannauksen ja normalisoinnin jälkeen fosforyloimattomaksi ERK:ksi 1/2. Tiedot edustavat eri solupopulaatioilla suoritetun n=3 kokeen keskiarvoja ± SD. Tähdet edustavat arvoja, jotka eroavat tilastollisesti positiivisesta kontrollista (LPS-aktivoidut astrosyytit), joiden arvoksi asetettiin 100 prosenttia (yksisuuntainen ANOVA, jota seurasi Dunnettin moninkertainen vertailu post hoc -testi; *p <>

Johtopäätökset

Yhteenvetona voidaan todeta, että tietomme osoittavat, että astrosyyttien käsittely ITC:illä vähentää ROS:n muodostumista ja estää MMP:n-2 ja MMP-9 vapautumista tarjoten uusia näkemyksiä ITC:iden antioksidanttisista ja anti-inflammatorisista ominaisuuksista glialissa. soluja. Nämä tulokset viittaavat siihen, että ITC:t voisivat olla lupaavia ravitsemuksellisia aineita terveellisten elintarvikkeiden käyttöön perustuvien hermoravitsemusinterventioiden kehittämisessä neurologisten sairauksien ehkäisyyn ja täydentävään hoitoon.

Rahoitus Avoin pääsyn rahoitus, jonka tarjoaa Università Degli Studi di Bari Aldo Moro CRUI-CARE-sopimuksen puitteissa.

Eettisten standardien noudattaminen

Eturistiriita Kirjoittajat ilmoittavat, että ne eivät ole eturistiriitoja.

Open Access Tämä artikkeli on lisensoitu Creative Commons Attribution 4.0 International License -lisenssillä, joka sallii käytön, jakamisen, mukauttamisen, jakelun ja jäljentämisen missä tahansa välineessä tai muodossa, kunhan mainitset asianmukaisesti alkuperäisen kirjoittajan. (s) ja lähde, anna linkki Creative Commons -lisenssiin ja ilmoita, onko muutoksia tehty. Tämän artikkelin kuvat tai muu kolmannen osapuolen materiaali sisältyy artikkelin Creative Commons -lisenssiin, ellei materiaalin luottorajassa toisin mainita. Jos materiaali ei sisälly artikkelin Creative Commons -lisenssiin ja käyttötarkoituksesi ei ole lakisääteinen tai ylittää sallitun käytön, sinun on hankittava lupa suoraan tekijänoikeuksien haltijalta. Näet kopion tästä lisenssistä osoitteessa http://creativecommons.org/licenses/by/4.{4}}/.